Посещений:
Развитие Лимфатических Узлов и Пейеровых Бляшек

LTi Клетки и Ядерные Рецепторы RORγt

An essential function for the nuclear receptor RORγt in the generation of fetal lymphoid tissue inducer cells
Gerard Eberl, Shana Marmon, Mary-Jean Sunshine, Paul D Rennert, Yongwon Choi & Dan R Littman
VOLUME 5 NUMBER 1 JANUARY 2004 NATURE IMMUNOLOGY

Lymphoid tissue inducer (LTi) клетки ассоциируют с ранним развитием лимфатических узлов или Пейеровых бляшек (Peyer’s patches). Было установлено, что во время плодной жизни ядерный рецептор гормона экспрессируется исключительно в и необходим для генерации LTi клеток. RORγt+LTi клетки продуцируют существенные факторы, среди которых lymphotoxin-α1β2 необходим, но не достаточен для активации мезенхимы в зачатки лимфатических узлов и Пейеровых бляшек. Эта ранняя LTi cell–обусловленная активация мезенхимы лимфатических узлов и Пейеровых бляшек формирует необходимую платформу для последующего развития зрелой лимфатической ткани.

Развитие лимфатической системы мышей начинается на 10.5 день эмбриогенеза (E10.5; 10.5 дней после оплодотворения) с инвагинации эндотелиальных клеток из вен и образования лимфоидных мешков1. Пока неизвестно, какие события инициируют локальное развитие лимфатических узлов или Пейеровых бляшек (Peyer's patches). Однако, LTi клетки, характеризующиеся как CD4+CD3- и interleukin 7 receptor-α (IL-7Rα)-позитивные клетки, находятся среди первых гематопоэтических клеток, выявляемых в зачатках лимфатических узлов и Пейеровых бляшек2-6. Эти клетки обнаруживаются в селезенке, крови и зачатках лимфатических узлов на E12.5 и в зачатках Пейеровых бляшек на E16, но присутствуют они лишь в очень небольших количествах после рождения. Отсутствие IL-7Rα+ клеток и Пейеровых бляшек у мышей, дефицитных по IL-7Rα or Jak3 kinase, необходимой для IL-7Rα-обеспечиваемой передачи сигналов, привело к предположению, что IL-7Rα+ клетки являются 'Peyer's patch индукторами'4,5,7. Кроме того, очищенные CD4+CD3- клетки индуцируют развитие Пейеровых бляшек или ассоциированной с носом лимфоидной ткани при переносе их мышам ,дефицитным по Пейеровым бляшкам и ассоциированной с носом лимфоидной ткани8,9. Эти данные показывают, что LTi клетки участвуют в развитии лимфатических узлов, Пейеровых бляшек и ассоциированной с носом лимфоидной ткани.
Появление LTi клеток в зачатках лимфоидных узлов и Пейеровых бляшек коррелирует с lymphotoxin-α(LT-α)-зависимым увеличением локальной экспрессии vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1) и intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1)5,10. LTi клетки экспрессируют связанный с мембраной LTα1β2 (refs. 3,5), тогда как мезенхимные клетки, очищенные из зачатков Пейеровых бляшек экспрессируют VCAM-1, ICAM-1 и LTβR11, рецептор для LTα1β2. Это указывает на то. что LTi клетки и мезенхимные клетки взаимодействуют в зачатках лимфатических узлов и Пейеровых бляшек посредством LTα1β2 и and LTβR? чтобы индуцировать дальнейшее развитие лимфатических узлов и Пейеровых бляшек. В соотв. с центральной функцией этого взаимодействия12, лимфатические узлы и Пейеровы бляшки отсутствуют у мышей, дефицитных по LTα13, LTβR14 или по факторам, необходимых для передачи сигналов ниже LTβR15-17.
LTi клетки, также как лимфатические узлы и Пейеровы бляшки, отсутствуют у мышей, дефицитных по факторы, ингибирующему транскрипцию Id2 (ref.18) или retinoic acid-related orphan receptors (RORs) RORγ и RORγt19,20. RORγ и RORγt являются двумя изоформами, которые отличаются своими N-терминальными последовательностями, кодируемых с помощью альтернативных 5' экзонов внутри Rorc локуса. В то время как RORγ мРНК выявляется в большинстве взрослых тканей, включая печень, легкие, мышцы, сердце и головной мозг RORγt мРНК и белок обнаруживаются только в незрелых дважды позитивных CD4+CD8+ тимоцитах21-23. Что эта изоформа экспрессируется в LTi клетках и необходима для развития лимфатических узлов и Пейеровых бляшек не было известно. Для изучения функции индивидуальных RORγ изоформ в развитии лимфатических узлов и Пейеровых бляшек, мы генерировали мышей, у которых ген, кодирующий enhanced green fluorescent protein (EGFP) бы присоединен к первому экзону гена, кодирующего RORγt (названного здесь Rorc(γt)). Мы нашли, что во время плодного периода RORγt экспрессируется исключительно в CD4+ и CD4- LTi клетках. Эта ограниченная плодная экспрессия RORγt в LTi клетках позволила нам визуализовать развитие ранних лимфатических узлов и Пейеровых бляшек и проверить функцию разных факторов на генерацию и рекрутирование LTi клеток в зачатки лимфатических узлов и Пейеровых бляшек. Отсутствие LTi клеток у RORγt-дефицитных мышей позволило нам оценить непосредственно функцию LTi клеток в развитии лимфатических узлов и Пейеровых бляшек.

Figure 1. In the fetus, RORγt is exclusively expressed in LTi cells. (a) Left: CD4 and CD8 expression in thymocytes from 6- to 8-week-old Rorc(γt)+/GFP mice. Boxed areas indicate cell populations analyzed for EGFP expression. Center: blue histograms, thymocytes from Rorc(γt)+/GFP mice; green lines, thymocytes from Rorc(γt)+/+ mice. SP, single-positive; DP, double-positive; DN, double-negative. Right: staining of Rorc(γt)+/GFP thymus with anti-EGFP. Cortex and medulla were defined by nuclear DAPI staining (data not shown). Data are representative of at least five independent experiments. (b–f) Sections from whole Rorc(γt)+/GFP fetuses at age E16.5 (b– d,f) or E12.5 (e) were stained as indicated by color of lettering above sections. Thymus, spleen, intestine and lymph node anlagen in designated regions are shown here. Green autofluorescence was used to visualize tissue structure. Arrowheads in e point to EGFP+ cells. Pink cells in f are stained for both red (CD11b or MHC class II) and blue (CD45). Original magnifications:b, x100 (top) and x200 (bottom); c–f, x400. Sections are representative of at least ten individual sections and three to ten independent experiments.

DISCUSSION


Используя knock-in мышиную модель, мы показали, что во время плодного периода RORγt экспрессируются исключительно в LTi клетках и что при их отсутствии LTi клетки не не образуются и лимфатические узлы и Пейеровы бляшки не развиваются. В зачатках лимфатических узлов и Пейеровых бляшек LTi клетки индуцируют активацию локальной мезенхимы и последующее развитие лимфатических узов и Пейеровых бляшек за счет LT α1β2-LTβR взаимодействия и дополнительных факторов, которые пока не установлены. Более того, накопление LTi клеток в зачатках лимфатических узлов и Пейеровых бляшек является результатом активного рекрутирования с помощью chemokines и cytokines скорее, чем за счет локальной пролиферации LTi клеток. Наши данные продемонстрировали, что RORγt необходим для развития лимфатических узлов и бляшек вследствие своей специфической и важной функции в генерации LTi клеток.
Результаты показывают, что LTi клетки, ранее охарактеризованные как CD3- CD4+ CD45+ IL-7Rα+ клетки2-6, выявляются с помощью экспрессии RORγt. Отсутствие LTi клеток и лимфатических узлов и Пейеровых бляшек у RORγt-дефицитных мышей формально демонстрирует, что LTi клетки необходимы для развития лимфатических узлов и Пейеровых бляшек. Подобно RORγt, ингибитор basic helix-loop-helix транскрипционных факторов Id2 также необходим для генерации LTi клеток18. Однако, в отличие от RORγt, Id2 был также необходим для появления плодных CD11b+ клеток. Более того, Id2 участвует в различных программах клеточной дифференцировки во время эмбрионального развития36. RORγt является, таким образом, единственной молекулой пока известной как экспрессирующейся исключительно в плодных LTi клетках.
Полученные результаты демонстрируют также, что LTi клетки взаимодействуют с и активируют мезенхимные клетки, присутствующие в зачатках лимфатических узлов и Пейеровых бляшек, как это было предположено ранее37. Мы достигали активации мезенхимы с помощью экспрессии адгезивных молекул ICAM-1 и VCAM-1. У E16.5 плодов эти молекулы экспрессировались на высоком уровне только в зачатках лимфатических узлов и Пейеровых бляшек, а также в тимусе и селезенке, что согласуется с центральной функцией этих адгезивных молекул в развитии лимфатических узлов и Пейеровых бляшек. Пороговое количество LTi клеток необходимо для этого процесса, что возможно отражает 'community effect' образующих кластеры LTi клеток33.
Мезенхимные клетки экспрессируют LTβR11, тогда как LTi клетки экспрессируют их лиганды, члены LTα1β2 (refs. 3,5). Существенная функция взаимодействия LTα1β2-LTβR в развитии лимфатических узлов и Пейеровых бляшек была продемонстрирована отсутствием лимфатических узлов и Пейеровых бляшек у LTα-дефицитных мышей13. Развитие лимфатических узлов и пейеровых бляшек может быть восстановлено у LTα-дефицитных мышей путем воздействия на эмбрионов агонистом mAb к LTβR12. Однако, обработка RORγt-дефицитных мышей с помощью этих mAb не восстанавливала развитие лимфатических узлов и Пейеровых бляшек. Сходным образом, агонист mAb не восстанавливал развития лимфатических узлов у TRANCE-дефицитных мышей, а трансгенная экспрессия TRANCE (в клетках, отличных от LTi клеток) не восстанавливала развитие лимфатических узлов у LTα-дефицитных мышей6. Эти данные показывают, что функция клеток LTi в индукции развития лимфатических узлов и Пейеровых бляшек не ограничивается предоставлением LTα1β2 для активации мезенхимы. Др. факторы, экспрессируемые LTi клетками, такие как TRANCE33, может быть необходимым арсеналом из факторов, продуцируемых с помощью LTi клеток во время развития лимфатических узлов. Т.к. TRANCE не участвует в развитии Пейеровых бляшек, то дополнительные факторы, предоставляемые LTi клетками, ещё предстоит определить. Зачатки могут быть результатом активного рекрутирования циркулирующих в крови клеток или благодаря экспансии резидентных LTi клеток или CD45+ клеток предшественников. В пользу первой возможности мы нашли, что клетки LTi не пролиферируют и только редкие гематопоэтические клетки пролиферируют в зачатках лимфатических узлов и Пейеровых бляшек. Кроме того, IL-7Rβ, TRANCE, TNF-R-I и BLC (CXCL13) участвуют в раннем рекрутировании LTi клеток в зачатки лимфатических узлов и Пейеровых бляшек. Индивидуальная функция каждого из этих факторов не очевидна, а недавние сообщения показали, что BCL (CXCL13) формирует перекрывающуюся систему с IL-7Rβ и CCR7 для развития определенных лимфатических узлов27,38. Рекрутированию LTi клеток в зачатки лимфатических узлов и Пейровых бляшек м. способствовать позитивная петля обратной связи, генерируемая с помощью активации мезенхимы LTi клетками посредством LTα1β2-LTβR взаимодействия39. Ligation LTβR индуцирует экспрессию ряда хемокинов в эмбриональных фибробластах и в B клетках, включая, BLC (CXCL13), ELC (CCL19) и SLC (CCL21)40,41. BLC и ELC экспрессируются также ICAM-1+ VCAM-1+ мезенхимными клетками в зачатках Пейеровых бляшек11 Кроме того, рецепторы для BLC (CXCR5) и ELC и SLC (CCR7) экспрессируются LTi клетками и передают хемотактические сигналы в LTi кдетки in vitro11. LTi клетки могут , следовательно, мигрировать в зачатки лимфатических узлов и Пейеровы бляшки в ответ на базовые уровни экспрессии хемокинов мезенхимных клеток и цитокины. Следовательно, LTi клетки активируют мезенхиму посредством LTα1β2-LTβR взаимодействия, индуцируя дальнейшую экспрессию хемокинов и увеличивая рекрутирование LTi клеток. Однако, если даже мезенхима зачатков лимфатических узлов и Пейеровых бляшек не способна активироваться в LTα-дефицитных плодах, количество присутствующих LTi клеток не меняется. Это указывает на то, что позитивная петля обратной связи может оперировать эффективно только на поздних стадиях развития лимфатических узлов и Пейеровых бляшек; т.е. после E16.5. На этой стадии может присутствовать пороговое количество LTi клеток, способное создавать 'community effect' и индуцировать активацию мезенхимы. LTα1β2-LTβR взаимодействие, по-видимому, также необходимо для продолжительного рекрутирования или выживания LTi клеток в зачатках лимфатических узлов, т.к. немного LTi клеток обнаруживается при рождении в зачатках лимфатических узлов LTα-дефицитных мышей33.
В заключение, ядерные гормональные рецепторы RORγt предопределяют границы с помощью своей экспрессии одиночных популяций плодных клеток, LTi клеток. Функция RORγt в генерации LTi клеток неизвестна. Предыдущие находки по рекрутированию RORγt в дважды позитивные тимоциты указывают на то, что они могут контролировать выживаемость LTi клеток19. Однако, форсирование экспрессии анти-апоптического белка Bcl-xL на месте RORγt не способно восстанавливать генерацию LTi клеток (данные не показаны). Это может быть использовано для идентификации мишеней для RORγt d LTi клетках. Анализ таких генов позволит пролить свет на механизмы развития лимфатических узлов и Пейеровых бляшек.
Сайт создан в системе uCoz