Ab | ER | RINT-1 | t-SNARE v-SNARE

КПП (checkpoint) веретена предупреждает расхождение сестринских хроматид до тех пор, пока все кинетохоры не сформируют стабильные биполярные микротубулярные соединения (Millband et al, 2002; Cleveland et al, 2003). ZW10 открыт как белок, который необходим для правильного расхождения хромосом у Drosophila (Williams et al, 1992,1996; Williams and Goldberg, 1994). ZW10, который оказался законсервированным на огромных эволюционных дистанциях (Starr et al, 1997), взаимодействует с dynamitin, субъединицей p50 комплекса dynactin (Echeverri et al, 1996), и облегчает рекрутирование dynein-dynactin комплекса в кинетохоры (et al, 1998). ZW10, вместе с ROD, участвует в продукции и/или регуляции сил, ответственных за движение хромосом в направлении полюсов (Savoian et al, 2000). Недавние исследования показали, что ZW10 и ROD являются белками spindle checkpoint (Chan et al, 2000) и что их транспорт прочь от кинетохоров обеспечивается с помощью dynein и ведет к окончанию действия spindle checkpoint (Howell et al, 2001; Wojcik et al, 2001).

Ранее нами было показано, что syntaxin 18, target membrane-associated SNAP receptor (t-SNARE), локализован в endoplasmic reticulum (ER) и участвует в мембранном переносе (membrane trafficking) между ER и Golgi (Hatsuzawa et al, 2000). t-SNAREs формируют компактные комплексы с vesicle-associated SNAREs (v-SNAREs), это ведет к слиянию мембран (Lin and Scheller, 2000; Wickner and Haas, 2000; Jahn et al, 2003). После слияния мембран, cis (в той же самой мембране) SNARE комплекс разбирается с помощью ATPase NSF с целью высвобождения α-SNAP Mg²⁺-ATP-зависимым способом. Некоторые свойства syntaxin 18 сходны с таковыми у Ufe1p, дрожжевым ER SNARE, который участвует в ретроградном транспорте из Golgi в ER (Lewis and Pelham, 1996) и в слиянии с мембраной ER (Patel et al, 1998).

Нами показано, что syntaxin 18 формирует комплекс с ZW10, RINT-1 и p31 помимо конвенциональных syntaxin-связывающих белков. Результаты функционального анализа указывают на новую роль ZW10, т.е. на роль в мембранном трафике между ER и Golgi.

Results

Identification of syntaxin 18-associated proteins

тобы определить функцию syntaxin 18, t-SNARE, локализованного в ER, мы попытались установить состав syntaxin 18 комплексов. Были выявлены частичные последовательности 7 белков помимо syntaxin 18 (Рис. 1A). 4 белка (rSec22b, SNAP-23, α-SNAP и rSly1p) являлись традиционными syntaxin-связывающими белками, а др. 3 (p31, RINT-1 и ZW10) были новыми. p31 кодируется с помощью EST клона (AF220052) и его функция в общем неизвестна. В ходе данного исследования однако появились 3 работы, описавшие идентификацию дрожжевого Use1p/Slt1p, нетрадиционного ER SNARE, который взаимодействует с Ufe1p (Belgareh-Touze et al, 2003; Burri et al, 2003; Dilcher et al, 2003). Сравнение последовательностей показало, что p31 является ортологом Use1p/Slt1p у млекопитающих (Dilcher et al, 2003). RINT-1 является Rad50-взаимодействующим белком, который участвует в контроле радиацией-индуцируемого G₂/M checkpoint (Xiao et al, 2001), a ZW10 является связанными с кинетохорами белком, участвующим в spindle checkpoint (Williams et al, 1992, 1996; Williams and Goldberg, 1994; Starr et al, 1997, 1998). Роль RINT-1 и ZW10 во время интерфазы неизвестна.

Чтобы установить специфичность связывания p31, RINT-1 и ZW10 с syntaxin 18, мы определяли, ассоциируют ли эти белки и с syntaxin 5, локализованным в Golgi syntaxin (Dascher et al, 1994). Как показано на Рис. 1C, ни один из них не преципитирует с поликлональными анти-syntaxin 5 Ab. Далее epitope mapping анализ выявил, что mAbs 2A6 и 1E1 распознают аминокислоты 223-229 и последовательность внутри аминокислот 104-222, соотв. (data not shown). Как показано на Рис. 1D, lane 1, p31, RINT-1 и ZW10 ко-преципитируются с mAb 1E1. В реципрокном эксперименте syntaxin 18 ко-преципитировался с anti-p31 Ab (lane 5). Не только syntaxin 18, но ко-преципитировались также и RINT-1 и ZW10. Сходные результаты получены с Abs к RINT-1 (lane 9) и ZW10 (lane 13).

Результаты двугибридного анализа β-galactosidase filter assay суммипрованы в Табл. I. Т.к. p31 содержит SNARE мотив, то он д. непосредственно взаимодействовать с α-SNAP и syntaxin 18. RINT-1 и ZW10 взаимодействуют др. с др.. но ни один из них не взаимодействует с α-SNAP, syntaxin 18 или p31.

Disassembly of the syntaxin 18 complex

Традиционные SNAREs образуют комплекс с NSF посредством α-SNAP, и комплекс разбирается путём гидролиза ATP, катализируемого NSF (Sollner et al, 1993). Показано, что p31, RINT-1 и ZW10 при инкубации с Mg²⁺-ATP в присутствии NSF и α-SNAP диссоциируют от syntaxin 18 (Рис. 1D, lane 2). Для этого нужны и NSF и α-SNAP (lane 3) и Mg²⁺ (lane 4). Те же результаты получены при иммунопреципитации. Всё это указывает на то, что p31, RINT-1 и ZW10 образуют субкомплекс в комплексе syntaxin 18. Этот субкомплекс не включает Sly1p или Sec22b.

ZW10 is present in the ER and cytosol during interphase

Участие ZW10 в комплексе syntaxin 18 неожиданно, т.к. ZW10 является компонентом кинетохор и играет важную роль в завершении spindle checkpoint (Williams et al, 1992, 1996; Williams and Goldberg, 1994; Starr et al, 1997, 1998). Определяли нахождение ZW10 во время интерфазы (Рис. 2A). Паттерн распределения ZW10 не перекрывается полностью с ER маркёром, calnexin (top and second rows). Следовательно, ZW10 ограничивается отдельным субдоменом ER или присутствует и в р.субклеточных компартментах. ZW10 значительно ко-локализуется с syntaxin 18 (third row). В HeLa клеточной линии с ZW10-green fluorescent protein (GFP), индуцибельным с помощью doxycycline, выявлен паттерн экспрессии существенно перекрывающийся с профилем окраски Hsp47, ER просветным белком (fifth row). Хотя ZW10-GFP избыточно экспрессируется на определенных уровнях, он всё ещё находится на p150^Glued-позитивных кинетохорах и полюсах веретена (bottom row), указывая на функциональную интеграцию экспрессируемого ZW10-GFP.

Т.к. ZW10 взаимодействует с dynamitin (Starr et al, 1998), субъединицей комплекса dynactin, участвующего в зависимом от микротрубочек транспорте (Echeverri et al, 1996), то мы удивились бы, если бы ZW10 присутствовал на микротрубочках. Как показано на Рис. 2B, хотя и имеется некоторе перекрывание в локализации ZW10 и α-tubulin, ZW10 присутствует также в области, лишенной α-tubulin. А воздействие nocodazole не влияло существенно на распределение ZW10 и ZW10-GFP.

ER-производные мембранные пузырьки (fractions 9-17) постоянно отделены от Golgi пузырьков (fractions 3-7) и эндосом (fractions 1-5). Очевидно, что ZW10, RINT-1 и p31, a также syntaxin 18, обнаруживаются в фракциях, соответствующих только ER. α-Tubulin не обнаруживается во фракциях, содержащих ZW10. Количества ZW10 и RINT-1 в мембранных фракциях сравнимы с таковыми в цитозоле (Рис. 2C, left panel), хотя они не содержат трансмембранных доменов. Очевидно, что значительная фракция ZW10 ассоциирована с ER мембранами во время интерфазы.

Overexpression of ZW10 perturbs trafficking between the ER and Golgi

Syntaxin 18 участвует в транспорте белков между ER и Golgi (Hatsuzawa et al, 2000). Проверяли влияние избыточной экспрессии ZW10 на морфологию органелл путей ранней секреции. Как показано на Рис. 3A избыточная экспрессия ZW10 вызывает дисперсию прикрепленного белка к cis-Golgi, p115 (Waters et al, 1992), интегрального мембранного белка в промежуточном ER-Golgi компартменте, ERGIC-53 (Schweizer et al, 1990), cis-Golgi интегрального мембранного белка, syntaxin 5 (Dascher et al, 1994) и cis-Golgi матричного белка, GM130 (Nakamura et al, 1995). Sec31p, компонент COPII оболочки участвующий в экспорте из ER, обнаруживается повсюду на периферии цитоплазмы, но концентрируется в околоядерной области в интактных клетках (Tang et al, 2000). После избыточной экспрессии ZW10, интенсивность окрашивания Sec31p в околоядерной области становтся слабой. С др. стороны, не обнаруживается достоверных изменений морфологии ER белка, calnexin (Рис. 3A), или микротрубочек (data not shown). Всё это указывает на то, что мембранный перенос по ранним секреторным путям нарушается при избыточной экспрессии ZW10.

Измеряли транспорт VSVG-GFP, химерного белка из GFP и vesicular stomatitis virus-encoded glycoprotein (VSVG), чей экспорт из ER осуществляется зависимым от температуры образом (Presley et al, 1997). Как показано на Рис. 3B (top right), спустя 30 мин. после температурного сдвига к 32°C (permissive temperature), VSVG-GFP остаётся ER в ZW10-overexpressing клетках (стрелки), но достигает околоядерной Golgi в контрольных клетках (головки стрелок).

Блокада VSVG-GFP транспорта в Golgi в ZW10-overexpressing клетках подтверждена и биохимически (Рис. 3C).

Overexpression of ZW10 does not disrupt the dynein-dynactin complex

Учитывая, что ZW10 взаимодействует с dynamitin (Starr et al, 1998),субъединицей комплекса dynactin (Echeverri et al, 1996), одним из объяснений ZW10-вызванных дефектов мембранного трафика между ER и Golgi м.б. то, что избыточная экспрессия ZW10, подобно таковой dynamitin (Burkhardt et al, 1997), нарушает функцию dynein-dynactin путём разрушения комплекса dynactin. Однако, во-первых, VSVG-GFP распределяется униформно по всему ER в ZW10-экспрессирующих клетках спустя 30 мин после температурного сдвига(Рис. 3B, top right), тогда как он концентрируется в виде точко-образных структур, представляющих собой расширенные ER exit сайты (Presley et al, 1997; Storrie et al, 1998), в dynamitin-overexpressing клетках (bottom right). Это указывает на то, что этапы, ингибируемые избыточной экспрессией ZW10 и dynamitin разные. Во-вторых, хотя избыточная экспрессия dynamitin (Burkhardt et al, 1997) существенно блокируется dynein-обеспечиваемыми движениями инкорпорированного FITC-transferrin в направлении центра клетки, избыточная экспрессия ZW10 не оказывает подобного эффекта (Рис. 4A). В-третьих, избыточная экспрессия dynamitin, вызыванная p150^Glued, субъединицей комплекса dynactin (Paschal et al, 1993), вызывает перераспределение коротких линейных array-подобных структур в ворсистые, дезинтегрированные структуры, а избыточная экспрессия ZW10 не вызывает (Рис. 4B). Наконец, избыточная экспрессия ZW10, в отличие от dynamitin, не разрушает комплекса dynactin (Рис. 4C, middle).

Association of ZW10 with RINT-1 and syntaxin 18 is required for disruption of the Golgi

Как показано на Рис. 5A, N-терминальный фрагмент, но не центральный или С-терминальный вызывает перераспределение p115 и Sec31p. RINT-1 и syntaxin 18 ко-преципитируются с N-терминальным фрагментом (Рис. 5B, lane 7). Следовательно, избыточная экспрессия ZW10 нарушает мембранный трафик по раннему секреторному пути путём взаимодействия с комплексом syntaxin 18.

Loss of ZW10 function affects membrane trafficking between the ER and Golgi

Как показано на Рис. 6, анти-ZW10 инъекции индуцируют дисперсию ER-Golgi белков, таких как p115, GM130 и ERGIC-53.

Как показано на Рис. 7A, уровень экспрессии ZW10 заметно снижается с помощью ZW10(102), но лишь слегка с помощью ZW10(1911). Рост не арестовывался в клетках, в которых экспрессия ZW10 заметно супрессирована, хотя скорость роста несколько ниже по сравнению с контролем. Вообще-то остаточный ZW10 м. продолжить управлять ходом клеточного цикла (T Urano, personal communication).

Параллельно со снижением белка ZW10 существенно изменяется распределение p115 от компактного, околоядерного паттерна в диспергированный (Рис. 7B, bottom). Молчание ZW10 заметно влияет на распределение p115, но менее значительно на др. cis-Golgi белки, такие как syntaxin 5 и GM130.

ЭМ анализ клеток с с редуцированными уровнями экспрессии ZW10 показал присутствие mini-Golgi stacks (Рис. 7C). Количественный анализ подтвердил, что длина цистерн Golgi в клетках с редуцированными уровнями ZW10 значительно короче, чем в mock-обработанных клетках (Рис. 7D). Кроме того, показано, что аппарат Golgi нормален в клетках, трансфицированных ZW10(102).

Чтобы оценить эффект устранения ZW10 на везикулярный транспорт из ER, использовали методику VSVG-GFP транспорта (Рис. 8). Спустя 30 мин после температурного сдвига VSVG-GFP выявлялся в ERGIC и/или ER exit сайтах в клетках со сниженными уровнями экспрессии ZW10, тогда как он транспортировался в аппарат Golgi в mock-обработанных клетках и в клетках, трансфицированных ZW10(1911). В ZW10-истощенных клетках VSVG-GFP достигал плазматической мембраны спустя 120 мин. Следовательно, деплеция ZW10 частично ингибирует транспорт VSVG-GFP из ER.

Discussion

Полученные результаты демонстрируют, что syntaxin 18 образует большие комплексы, состоящие из традиционных syntaxin-связывающих (rSec22b, α-SNAP и rSly1p) и нетрадиционных (ZW10, RINT-1 и p31) белков. Неясно, действительно ли SNAP-23 ассоциирует с syntaxin 18. Сходным образом, неясен факт, что Sly1p взаимодействует с syntaxins, локализованными в Golgi (Sed5p) (Lupashin and Waters, 1997) и ER (Ufe1p) (Reilly et al, 2001; Yamaguchi et al, 2002), rSly1p соединяется с аналогом млекопитающих Sed5p, syntaxin 5 (Dascher and Balch, 1996), и предполагаемым ортологом Ufe1p у млекопитающих, syntaxin 18.

Оказалось, что ZW10, spindle checkpoint белок, и RINT-1, G₂/M checkpoint белок, ассоциируют с syntaxin 18. Белки ZW10, RINT-1 and p31, во-первых, ко-преципитируют с двумя разными mAbs и поликлональными Ab к syntaxin 18, но не с анти-syntaxin 5 Ab. Во-вторых, syntaxin 18 ко-преципитируется с Abs к любому из трёх белков, хотя эффективность ко-преципитации syntaxin 18 с анти-ZW10 Ab довольно низкая. В-третьих, 3 белка диссоциируют от syntaxin 18 NSF, α-SNAP, Mg²⁺-ATP-зависимым образом, указывая тем самым на их функциональную связь с syntaxin 18.Наконец, syntaxin 18 и RINT-1 ко-преципитируют с экспрессируемым FLAG-tagged ZW10 и его N-терминальным фрагментом с анти-FLAG Ab.

Ufe1p, предполагаемый дрожжевой ортолог syntaxin 18, как известно, формирует комплекс с Sec22p, Sec20p и Tip20p (Lewis et al, 1997). Сравнение последовательностей показывает, что RINT-1 обладает низким, но достоверным сходством последовательностей с Tip20p (21% идентичных аминокислот в 300-620 RINT-1). Из белков млекопитающих RINT-1 пока наиболее сходен с Tip20p. Ito et al (2001) показали, что в дрожжевом двугибридном assay, Tip20p взаимодействует с Dsl1p, белком, участвующим в ретроградном транспорте из Golgi в ER (Andag et al, 2001; Reilly et al, 2001). Хотя RINT-1 взаимодействует с ZW10 в двугибридном assay, не обнаруживается четкого сходства последовательностей между Dsl1p и ZW10. Мы не нашли очевидного ортолога Sec20p среди идентифицированных компонентов комплекса syntaxin 18.

Мы не выявили белок, соответствующий Rad50, партнёру RINT-1 (Xiao et al, 2001), в комплексе syntaxin 18, RINT-1 м. существовать в двух отдельных комплексах, один связан с G₂/M checkpoint, а др. с мембранным трафиком. ZW10 также формирует комплекс с ROD (Scaerou et al, 2001), и комплекс, играющий роль в выключении spindle checkpoint (Howell et al, 2001; Wojcik et al, 2001). Мы продемонстрировали, что ROD не присутствует в изолированном syntaxin 18 комплексе.

Мы предлагаем две возможные модели. Одна модель предсказывает, что все комплексы (ZW10-ROD, Rad50-RINT-1, ZW10-RINT-1-p31 и возможно др.) постоянно присутствуют в клетках и функционируют независимо. В этом случае ZW10-ROD и Rad50-RINT-1 комплексы д. активироваться с помощью неких механизмов в начале митоза и в G₂/M фазе, соотв. Согласно альтернативной модели ZW10 и RINT-1 в основном скомплексованы с syntaxin 18 во время интерфазы и меняют своих партнёров в зависимости от клеточного цикла. Эта модель базируется на находках, что RINT-1 формирует комплекс с Rad50 только во время G₂/M фазы (Xiao et al, 2001). Однако наши предыдущие результаты показывают, что связывание ZW10 и RINT-1 с syntaxin 18 не зависит от клеточного цикла (data not shown), что делает последнюю модель маловероятной.

Избыточная экспрессия ZW10 и микроинъекции анти-ZW10 Ab заметно нарушают мембранный транспорт между ER и Golgi. С одной стороны, снижение экспрессии ZW10 частично ингибирует VSVG-GFP транспорт из ER, не нарушая при этом сильно аппарат Golgi. Вообще-то остаточный ZW10 м. обеспечивать транспорт, хотя и с низкой эффективностью, Возможно, что ZW10 своей функцией и/млм взаимодействиями интимно связан с p115, но не с syntaxin 5 и GM130. Следовательно, деплеция ZW10 д. оказывать выраженный эффект на распределение p115, но не syntaxin 5 и GM130. Хотя микроинъекции анти-p115 Ab вызывают разборку Golgi в клетках млекопитающих (et al, 1999; Puthenveedu and Linstedt, 2001), деплеция p115 у Drosophila, хотя и нарушает организацию ER exit сайтов, но несущественно влияет на транспорт белков из ER (Kondylis and Rabouille, 2003).

Следовательно, существует некоторая связь между мембранным тарфиком и КПП (checkpoint) клеточного цикла. В этом контексте находки Malhotra and colleagues (Sutterlin et al, 2002), что аппарат Гольджи м. действовать как сенсор, контролирующий вступление в митоз клеток млекопитающих, очень интересны. Они указывают на присутствие ряда компонентов, которые следят за состоянием аппарата Golgi и определяют ход клеточного цикла вступления в митоз. ER компоненты, такие как ZW10 и RINT-1, м. кооперироваться для вступления в митоз. необходимо отметить, что ZW10 у эмбрионов Drosophila исключается из ядра во время интерфазы и мигрирует в ядро во время прометафазы (Williams and Goldberg, 1994). В начале митоза некоторые компоненты ER м. мигрировать в ядерный объем, a Golgi и ядерных мембран компоненты м. перераспределяться в ER (Zaal et al, 1999; Daigle et al, 2001).

В ходе этого исследования открыт новый SNAP-25-interacting белок (SIP30) (Lee et al, 2002). SIP30 является тем же самым белком что и HZwint-1, компонент кинетохор, который взаимодействует с ZW10 (Starr et al, 2000). Тот факт, что HZwint-1/SIP30 взаимодействует с SNAP-25 подтверждает наше мнение, что ZW10 участвует в мембранном переносе посредством взаимодействия с SNARE комплексом.