Митохондрии являются ключевыми генераторами клеточной АТФ, продуцируемого посредством цикла Кребса, β-окисления и oxidative phosphrylation (OXPHOS). В огромном большинстве случаев первичным путём продукции АТФ является OXPHOS посредством electron transfer chain (ETC; Рис. 1), которая в отличие от др. клеточных путей кодируется двумя отдельными геномами, ядерным (яДНК) и митохондриальным (мтДНК) геномами. мтДНК млекопитающих кодирует 13 полипептидов, которые составляют часть ЕТС (Рис. 2). Кроме того она представлена 22 transfer РНК (тРНК) и 2 рибосомальными РНК (рРНК), таким образом создаётся полу-автономная молекулярная единица, которая нуждается во взаимодействии с ядром, чтобы побуждать транскрипцию и репликацию.
Состояние гомоплазмии существует, когда все копии мтДНК внутри клетки или ткани идентичны или дикому типу, или мутантому или делетированному/перестроенному. Смесь двух вариантов или существование дикого типа и перестроенных молекул вызывает гетероплазмию. Фенотипически начало мтДНК-типа болезни часто зависит от соотношения мутантной и дикого типа мтДНК. Исследование пациентов показало, что при Leber's hereditary optic neuropathy (LHON), напр., более 60% мутантного груза мтДНК необходимо прежде чем возникнет характерный фенотип. Др. исследования показали, что существует критический пороговый уровень, при котором свыше 85-90% мутантных мтДНК д.присутствовать для проявления биохимического или клинического болезненного фенотипа. Среди матерински наследуемых точковых мутаций имеются: мутации в индивидуальных рРНК/тРНК комплексах, ассоциируемые с митохондриальной миопатией энцефалопатией, lactic ацидозом и stroke-like эпизодами (MELAS); myoclonic epilepsy and ragged-red fibre (MERRF) болезнью и глухотой; мутации в кодирующей области, напр.. neurogenic weakness, ataxia, retinitis pigmentosa (NARP); mitochondrial encephalomyopathy и LHON и комбинацией симптомов митохондриальных болезней, возникающей в результате точковой мутации в нуклеотиде 8993. Мутации м. также передаваться Менделевским способом, напр., chronic progressive external ophtalmoplegia (CPEO). Эта группа возникает в результате мутаций компонентов, кодируемых ядром, витальных для транскрипции и репликации мтДНК. Сюда входят adenine nucleotide translocator (ANT) 1 , ADP/ATP translocator, thymidin kinase 2 и mitochondrial deoxyguanosinе kinase - ферменты, участвующие в пути удаления мусора, которые обеспечивает dNTPs для репликации мтДНК, и polymerase γ (PolG), ДНК полимераза, специфичная для мтДНК. Кроме того. митохондриальные транскрипционный фактор А (TFAM) является жизненно необходимым для фактором, который соединяется с D-петлёй или контрольной областью митохондриального генома и регулирует его транскрипцию и репликацию. Снижение экспрессии TFAM ассоциирует с mtDNA depletion syndrome. Наконец, крупно масштабные делеции, выступающие в качестве спорадических одиночных делеций или в качестве инсерций-дупликаций мтДНК, которые м. действовать как промежуточные образования, как напр., при Kearns-Sayre syndrome (KSS) и часто характеризуется с помощью 'common' делеции в 4977 п.н. Множественные крупномасштабные делеции также обнаруживаются в постмитотических тканях, таких как мышцы и м.б. индуцированы посредством механизма старения, такого как генерация свободных радикалов.
Heteroplasmy derived from the coexistence of two distinct alleles
Сосуществование двух или более мтДНК аллелей, определяемое как следствие вариантов, м. возникать в результате переноса спермия при межвидовом скрещивании или при добавлении, возникающем в результате цитоплазматического переноса или ядерного переноса. Эти техники противоречат строгому механизму, который регулирует трансмиссию мтДНК после оплодотворения. мтДНК в первую очередь передаётся посредством ооцита и поэтому она наследуется от матерей. Лучше всего это видно при межвидовых скрещиваниях мышей, это происходит, чтобы элиминировать митохондрии спермия на поздней стадии пронуклеуса и до 8-клеточной стадии у кошек и макак-резус. Этот процесс, как полагают, обеспечивается посредством мечения митохондрий сперматогоний с помощью убиквитина, приводящего в результате к их последующему целенаправленному с помощью ооцита управляемого убиквитинированию. Межвидовые скрещивания ведут себя по-разному, путём игнорирования убиквитином-обеспечиваемого события и делая возможным перенос мтДНК спермия, хотя и на низком уровне. Однако, эта молекула не передаётся последующим поколениям. Интересно, что двухродительский перенос наблюдается также у
Drosophila и у мидий, мужское потомство мидий обладает и материнского- и отцовского-типа геномами, а женское потомство обладает только материнским геномом. Считалось, что люди передают мтДНК строго по материнской линии. однако, отцовская мтДНК м. сохраняться у немногих полиплоидных эмбрионов, генерируемых с помощью IVF, a его присутствие в бластоцисте м. объяснить мтДНК миопатию, наблюдаемую у пациентов мужчин (Schwartz & Vissing 2002). Существуют и др. доказательства, подтверждающие, что мтДНК спермиев м. персистировать, но опять же редко, вследствие инъекций сперматид.
Cytoplasmic transfer (CT) - относительно новая техника репродукции. Она связана с инъекцией донорской цитоплазмы, а также спермия с целью добавления дефектной цитоплазмы в такой ооцит от пациентов с повторной неспосбностью эмбрионального развития. Это м. возникать , т.к. митохондрии, присутствующие в зрелом ооците при оплодотворении получают энергию, необходимую эмбриону для всей преимплантационной фазы развития, т.к. не происходит пополнения митохондрий вплоть до стадии пост-бластоциста. Было установлено, что имеется критическое количество митохондрий приблизительно 100000, которые д. присутствовать в неоплодотворённом ооците, чтобы сделать возможным развитие эмбриона после оплодотворения у людей. Это количество м.б. существенным, т.к. пороговый уровень АТФ необходим для клеточного деления или определенное количество митохондрий необходимо для синхронизации клеточной динамики, что существенно для раннего эмбрионального развития. СТ было успешным, обнаруживало более высокие, чем ожидалось, уровни беременностей у женщин, неспособных зачать др. способами, особенно у старых женщин с плохим качеством ооцитов. Однако, технология эта привела к тому, что некоторые были потомками двух цитоплазматических родителей, так и двух хромосомных родителей (ДНК спермия и ооцита). Это м. приводить в дальнейшем к спонтанным или селективным абортам из-за синдрома Тёрнера (46,Х0) и к началу первазивных нарушений развития (Barrit et al., 2001b). Исследования на мышах показали, что чужеродная мтДНК, инъецированная или в ооцит или зиготу, м. передавать варьирующие количества , напр., 5-80% (Laipis 1996), 0-30% (Jenuth et al., 1996) и 16-100% (Мeirells & Smith 1997), подтверждая, что эти внесенные молекулы м. передаваться со случайными частотами.
Состояние гетероплазмии м. также возникать как следствие NT, где также м. происходить передача мтДНК, также как и ядерной ДНК, от донорской клетки, т.к. имеется несколько тысяч мтДНК геномов в большинстве соматических клеток. Характер наследования мтДНК не согласуется у потомков, полученных с помощью NT, т.к. процесс обходит обычный однородительский механизм наследования мтДНК. Следовательно, NT потомки м. обладать одним из 3-х паттернов получения мтДНК, а именно, гомоплазмия, получаемая исключительно от реципиентного ооцита, гомоплазмия, получаемая исключительно от донорской соматической клетки и гетероплазмия, возникающая в результате слияния партнёров.
Наблюдались обе гомоплазмии и варьирующие степени гетероплазмии. Гомоплазмия м. возникать в результате неспособности донорских митохондрий вступать в ооплазму вследствие электрофузии. Напротив, донорские митохондрии м. активно разрушаться с помощью механизма, сходного с убиквитинированием митохондрий спермиев, как показано при межвидовых скрещиваниях вследствие естественного оплодотворения или IVF. Существование гетероплазмии показывает, что в противоположность исключению мтДНК спермия при половом наследовании клонирование м. дать смешение и со-существование родительских мтДНК. Донорская мтДНК обнаруживается между ) и 59% от общей клеточной мтДНК в проанализированных тканях (Табл. 1). Использование эмбриональных клеток разных стадий развития м. приводить к меньшему внесению донорской мтДНК во вновь реконструируемый ооцит. однако, имеется существенная вариабельность между диссоциированными бластомерами, что и объясняет варьирующие уровни трансмиссии. В недавнем исследовании мтДНК у NT телят чётко продемонстрированы репликативные преимущества донорской мтДНК над мтДНК реципиентного ооцита, хотя важно отметить отличия в композиции мтДНК между тканями одного и того же клонируемого индивида (Табл.1). Это находится в контрасте с др. сообщением, где не наблюдалось преимуществ в отношении донорской мтДНК. Эта изменчивость в композиции мтДНК м.б. связана с различиями NT процедуры или с различиями в ядерно-цитоплазматических взаимодействиях. Пропорция донорской мтДНК м.б. связана с количеством цитоплазмы донорских клеток, присутствующим после реконструкции. Это хорошо согласуется с протоколом активного разрушения цитоплазмы донорских клеток перед инъекцией в реципиентный ооцит (Wakayama & Yanagimachi 2001).
Haw is mtDNA transmission regulated following non-invasive assisted reproduction?
Примордиальные фолликулы содержат до 10 митохондрий, а молекулы мтДНК внутри них клонально амплифицируются, начиная с оогеназа вплоть до полного созревания в метафазе II. Эта клональная экспансия даёт в результате более 100000 копий, присутствующих в ооците, способном к оплодотворению и поддержанию эмбрионального развития. Ограничение немногими копиями мтДНК на стадии примордиального фолликула даёт в результате генетически "бутылочное узкое горлышко". Это генетическое событие ограничения, как полагают, происходит в результате случайного генетического дрейфа и/или ненаправленной сегрегации, способствующей гомоплазматической передаче мтДНК насколько это возможно. Любой из этих процессов м. объяснить огромные различия в мутантном грузе, наблюдаемом в сериях ооцитов из одного овариального источника - от 0 до 95% - неравными уровнями мтДНК, присутствующей в индивидуальных сегрегирующих бластомерах.
Consequences resulting from the transvission of two genomes - competitivness of one genome over anoter
И СТ и NT обходят это раннее генетическое событие ограничения и приводят к гетероплазматическому распределению во многих типах тканей и в будущих поколениях. Однако, следует иметь в виду, что репликация мтДНК не происходит вплоть до стадии развития вылупления бластоциста. До этой стадии каждая митохондрия и её копия мтДНК д. передаваться только одному бластомеру. Эта сегрегация продолжается пока бластомеры делятся. Многими исследованиями на мышах было показано, что чужеродная мтДНК, инъецированная в кариопластимеет тенденцию распределяться поровну между дочерними бластомерами, тогда как митохондрии, инъецированные в цитопласт сегрегируют преимущественно в одну дочернюю клетку или др. Это, по-видимому, обусловлено тем, что мтДНК, инъецированная в кариопласт, находится очень близко к ядерномну генетическому материалу, который всегда делится на равные части между дочерними бластомерами. Предполагается, что м внутри специфических регионов клетки мтДНК имеет предпочтение к репликации. Однако, недавно было установлено, что предпочтительная репликация возникает только благодаря высокому количеству митохондрий, окружающих ядро, и не связана с предпочтительной локализацией репликации мтДНК. Показано. что репликация мтДНК происходит по всей клеточной цитоплазме в разных соматических клетках человека. Положение митохондрий внутри ооцита определенно играет важную роль в предопределении, где они будут локализованы у развивающегося эмбриона и потомков. Это м.б., следовательно, обусловлено или предпочтительной репликацией или просто сегрегацией во время клеточных делений. В любом случае это имеет важное значение для решения, куда инъецировать дополнительные митохондрии во время цитоплазматического переноса.
Предполагается, что некоторые потомки, полученные с помощью NT, обнаруживают предпочтительную репликацию мтДНК ядерного донора, вообще-то благодаря присутствию соотв. ядерных факторов, напр., TFAM. В этих исследованиях тестирование пропорции разных мтДНК генотипов после NT и СТ дало варьирующие результаты как внутри, так и между индивидами. Границы изменчивости от полной гомоплазмии до равных пропорций двух или более мтДНК генотипов. Ранги гетероплазмических состояний м.б. обусловлены рядом факторов, таких как ядерно-цитоплазматическая несовместимость. Идеальным бы исходом для СТ было бы наделение ооцита мтДНК того же самого генотипа.
Use of cybrid technology as means of evaluating nucleo-cytoplasmic interactions
Цибриды, цитоплазматические гибриды, используются для изучения ядерно-цитоплазматических взаимодействий у людей. Недавно была проанализирована судьба популяции мтДНК на разных ядерных фонах. Обычно гомоплазматические цибриды формируются в результате слияния энуклеированной клетки (цитопласта) с мтДНК-истощенной клеткой, обладающей соматическим ядром (кариопласт). Гетероплазматические цибриды м.б. получены или за счёт слияния гетероплазматического цитопласта, содержащего, напр., смесь мутантных и дикого типа мтДНК с мтДНК-depleted клеткой, или за счёт слияния цитопласта с клеткой, содержащей мтДНК, продуцирующей цибрид с донорской и реципиентной мтДНК. Технология цибридов используется также для анализа трансмиссии мтДНК потомкам путём внесения мтДНК в в одноклеточные эмбрионы, а также в бластоцисты. Табл. 2 демонстрирует изменчивасть в репликации и транскрипции мтДНК, которая м. возникать благодаря ядерно-цитоплазматической изменчиваости. Особый интерес представляют результаты, полученные в результате генерации межвидовых цибридов, в которых мтДНК крыс эффективно реплицируется, транскрибируется и транслируется на мышином ядерном фоне, хотя OXPHOS функция является компромиссной, по сравнению с затруднениями у цибридов мышь-мышь. Также реплицируется только мтДНК приматов, когда собственная мтДНК клеток человека элиминируется. Затруднением является также вариабельность последовательностей мтДНК двух популяций, которое м.б. результатом несовместимости аминокислот и дисфункции ЕТС со снижением уровней АТФ. Такой исход д.б. сходен с теми человеческими фенотипами, ассоциироваными с mtDNA depletion синдромами, возникающими в результате снижения уровней экспрессии TFAM, понижающего количество копий мтДНК. В самом деле, мутации мтДНК , которые характены для mtDNA depletion, вызывают фенотипические изменения у животных, включая рост и качество молока у коров Holstein. Такие исходы определенно делают необходимым установление ядерно-цитоплазматической совместимости перед осуществлением NT и СТ. Это особенно важно в свете недавнего сообщения о human embryonic stem cells (hESCs), полученных с помощью аутологическгого SCNT. Следовательно, цибриды человек-человек представляют собой прекрасную модель для изучения разнообразия определенных соматических ядер в отношении эмбионального генома. Это м. также пролить свет на совместимость ядра из одного типа клеток с цитоплазматическим фоном от др. индивида.
Could upstream epigenetic errors impact on mitochondria numbers in cells and respective copies of mtDNA per mitochondrion?
NT соматических клеток использует дифференцированные клетки в качестве источника хромосомной ДНК, которая нуждается в репрограммировании до первого клеточного деления. Генотип серий клеток от индивидуального организма идентичен, но клеточно-специфическая экспрессия генов даёт в результате индивидуальные клетки, качественные особенности которых связаны с их функцией и морфологией. Следовательно, эти донорские ядра д.б. репрограммированы, чтобы адаптироваться к характеристикам только что оплодотворённой зиготы, которая осуществляет или заканчивает рекомбинацию мужского и женского пронуклеуса. Естественно или
in vitro оплодотворенные ооциты подвергаются серии эпигенетических событий. Сюда входят метилирование и деацетилирование, регуляторы инпринтинга, которые являются ключевыми в онтогенетических событиях. Однако, доказательства, получаемые от IVF и intra cytoplasmic sperm injection (ICSI) показывают, что правильный паттерн импринтинга является существенным для нормального развития. Как следствие, синдром Beckwich Wiedemann с нарушением импринтинга, описанный во многих серьёзных примерах после искусственного воспроизведения (Maher et al., 2003). Важно, что нарушения импринтинга м.б. фенотипически летальными. Кроме того, др. ключевые маркёры ранней дифференцировки, такие как некоторые плюрипотентные гены, экспрессируются во время нормального развития, хотя они не обязательно м. присутствовать у соматически клонируемых эмбрионов и не будет происходить их вклада в соматическое ядро. Наиболее изучен Oct-4 и ассоциированные члены семейства, включая Dppa1, Pramel4, Pramel5 и Pramel6 (Bortvin et al., 2003).
Мы полагаем, что неспособность соматических донорских ядер экспрессировать ключевые маркёры незапрограммированного ядра указывает на то, что аберрантная экспрессия генов или молчание нарушают раннее эмбриональное развитие, которое м. отклоняться существенно от ожидаемого паттерна. Это лучше всего описанное нарушение высоко регулируемого ядерно-цитоплазматического взаимодействия. Следовательно, ядро, которое регулирует транскрипцию и репликацию мтДНК благодаря экспрессии его специфических транскрипционных факторов, напр., TFAM, м. давать в результате то, что последующие бластомеры будут адаптировать фенотип клеточного типа ядерного донора, давая в результате клетки внутренней массы и те, что вносят вклад в пллод, фенотипически экспрессирующие митохондриальную морфологию и количество копий мтДНК, характерных для определенного клеточного типа. Это д. влиять на морфологию митохондрий и количество копий мтДНК и количество митохондрий на клетку и тем самым на способность OXPHOS для органов и тканей. Это является особенно критическим, тк. число митохондрий и количество копий М является уникальным для каждого типа клеток и связано с потребностями в OXPHOS.
Множественные копии мтДНК генома обнаруживаются в индивидуальных митохондриях соматических клеток, хотя только единичная копия обнаруживается в митохондриях ооцита. Степень множественных копий, как полагают, регулируется за счёт потребности в АТФ индивидуальной клеткой. Напр., в тканях крыс среднее количество копий мтДНК на митохондрию для желудка составляет 0.7, для печени 2.7, для красных мышц 0.9 и для белых мышц 1.9. Более того, количество копий мтДНК на клеточный тип, как было установлено, существенно отлично для разных типов клеток. Напр., в скелетных и сердечных мышцах имеется 3650+620 и 6790+920 копий мтДНК на диплоидный ядерный геном, соотв. Количество копий мтДНК в моноядерных клетках периферической крови составляет 409+148 на клетку, а в подкожном жире - 2049+391, а в культивируемых фибробластах 823+71 копий на клетку. Интересно, что имеется 2.6х10
5 копий на телячий ооцит, тогда как фибробласты сердца плода телёнка содержат 2.6х10
3 копий на клетку. Существенная изменчивость демонстрируется также в тканях крыс, ткани желудка имеют 279х10
9 мтДНК копий на грамм ткани, печень 743х10
9 , красные мышцы 230х10
9 и белые мышцы 116х10
9. Неспособность ядра полностью репрограммироваться м.б. результатом неспособности соответствующей сегрегации мтДНК во время эмбриогенеза и м. затрагивать продукцию АТФ и клеточное развитие. Следовательно, исходы от добавления мтДНК д. тестироваться в условиях регуляции эмбрионального и соматических ядер геномов в ходе всего раннего эмбриогенеза.
Транскрипция и репликация мтДНК обеспечивается с помощью кодируемых ядром транскрипционных факторов, которые импортируются в митохондрии. Транскрипция осуществляется с 2-клеточной стадии в развивающемся эмбрионе мыши, хотя количество копий мтДНК постоянно вплоть до стадии бластоциста. Количество копий мтДНК, по-видимому, поддерживается с помощью nuclear respiratory factor (NRF)-1. Гомозиготные нулевые мыши по этому фактору доживают до Е6.5. однако. происходит постоянно разбавление мтДНК генома в каждом вновь генерируемом бластомере до тех пор, пока не начнётся репликация после имплантации. Одним из главных регуляторов этого события является TFAM. У гомозиготных нокаутных TFAM эмбрионов мыши наблюдается тяжелая деплеция мтДНК, эмбрионы доживают до Е10.5. Это контрастирует с гетерозиготными потомками, у которых обнаруживается кардиомиопатия, тяжелое ослабляющее нарушение мтДНК.
Сайт создан в системе
uCoz
R.E.I.Lloya, E.J.Bowles, E.C.Thomas, S.El Shourbagy
