Посещений:
Миофибриллогенез

Роль Титина

A Targeted Deletion of the C-Terminal End of Titin, Including the Titin Kinase Domain, Impairs Myofibrillogenesis
G.Miller, H.Musa, M.Gautel, M.Peckham
J.Cell Sci. V. 116, No 23, P. 4811-4819, 2003




Рис.  |  This picture shows a normal myotube immunostained for titin

Titin: A giant protein that controls muscle elasticity






Скелетные мышечные волокна формируются благодаря слиянию одноядерных миобластов в многоядерные миотрубки. Непосредствено перед и сразу после слияния собираются первые миофибриллы из вновь экспрессируемых скелетьных мышце-специфических белков, таких как скелетный миозин, скелетный актин и титин. В результате базирующийся на актине цитоскелет полностью реорганизуется в высоко организованную структуру, обнаруживаемую в скелетных мышцах.
Titin один из самых больших из известных белков (более 3MDa) играет, как полгают, важную роль в миофибриллогенезе рядом способов. Он важен для организации Z-линий, для организации миозин-содержащих толстых филамент в мышечные саркомеры идля организации М-линий. Кодирующая последовательность примерно в 90 kb даёт белок длиной в 1µm, идущий от Z-линии до М-линии в мышечном саркомере. N-терминальная область титина обнаруживается в Z-линии, область I-диска является омновным источником мышечной эластичности, а область А-диска, как предполагают, регулирует длину толстых филамент. Область М-линии титина с белками М-линии, такими как миомезин.
На конце А-диска, вблизи М-линии титин содержит киназный домен (ТК). Эта киназа состоит из каталитического домена и регуляторного домена (который блокирует связывание АТФ). Она активируется фосфорилированием Y170 (номер киназного остатка титина) с помощью неизвестной тирозин киназы и с помощью связывания Са2+ /calmodulin. Одним из известных субстратов для этой киназы является telethonin ( наз. также t-cap). Чтобы фосфорилировать telethonin ТК д.б. активирован и находиться вблизи telethonin, это достигается или благодаря тому, что telethonin рекрутируется в М-линию, чтобы быть фосфорилированным, или ТК фосфорилрует telethonin, прежде чем он будет включен в мышечный саркомер в раннем развитии. Этот тонкий пространственный и временной контроль активности ТК указывает на то, что он м.б. также важным в контроле и регуляции обмена на поздних стадиях. Избыточная экспрессия изолированного ТК ведет к разрушению структуры миофибрилл, это согласуется с идеей, что ТК играет критическую роль в контроле миофибриллогенеза.
Мутации титина, как известно, вызывают болезни серда, такие как дилятированная кардиомиопатия, болезни скелетных мышц, такие как тибиальная мышечная дистрофия, а также дефекты сердечной и скелетных мышц у рыбок данио, дрозофилы и в культивируемых клетках. Миофибриллогенез тяжело нарушается в в культивируемых DYR клеткаХ в которых отсутствует титин, в мышцах дрозофил, в которых делетирован ген титина и в культивируемых кардиальных клетках, трансфицированных антисмысловой ДНК титина. Недавно условные деленции двух экзонов (Мех1 и 2) вблизи М-линии титина давали тяжелые дефекты сердечных и скелетных мышц. Т.к. титин важне для многих аспектов фибриллогенеза и поддержания миофибрилл, то это не является неожиданным. Если титиновая киназа сулщественн для инициации фибриллогенеза благодаря своему фосфорилированию telethonin и др. субстартов, то м.б. предсказано, что укорочение титина, исключающее киназный домен и нижестоящие последовательности, будет нарушать фибриллогенез, т.к. титин киназа не сможет больше фосфорилировать субстраты и контролировать миофибриллогенез и будет влиять на нормальную функцию титина в М-линии. Мутации в telethonin, как известно, вызывают слабую мышечную дистрофию поясов конечностей типа 2G.
Авт. использовали генный таргетинг в культивируемых миобластах, чтобы укоротить ген титина в средине киназного домена и исследовли эффекты на первичным миофибриллогенез. Получен только один такой изменённый аллель титина. Однако т.к. многие сердечные и скелетных мышц заболевания (Hein and Schaper, 2002) являются аутосомно доминантными, то и одного аллеля достаточно, чтобы нарушить функцию мышц.
Полученные результаты показали, что целенаправленное укорочение гена внутри киназного домена, которое разрывает титин киназу и изменяет рамку считывания всех последовательностей титина ниже киназного домена, нарушает миофибриллогенез. И это несмотря на тот факт, что одна копия нормального титина всё ещё экспрессируется, какпо-видимому, и укороченный белок титина. Полученные результаты ётко демонстрируют, что разрыв титинового гена вблизи 3' конца достаточен для нарушения миофибриллогенеза и подчёркивает важность всех функциональных доменов титина в организации контральтильных белков в мышечном саркомере.
Прерываение гена титина в киназном домне д. вести или к потере белка или к продукции укороченного белка со всеми домена ми выше киназного. Выявлено наличие и укороченного белка и снижение уровня экспрессии. Это ведет к уменьшению уровня титиновой киназы и доменов С-терминальнее от киназного домена, куда входят область М-линии, важная для связывания миомезина, а также сайт KSP, который онтогенетически фосфорилируется. Мы не показали, что укороченный титин способен интегрироваться в мышечный саркомер, но мы подозреваем, что он делает это, по крайней мере, со своей имеющейся секцией А-диска.
Т.к. снижение уровней экспрессии титина сопровождается снижением уровня миозина, а слияние миобластов менее эффективно, то возникают более коротные мышечные трубки. Мутации в титине также влияют на слияние у дрозрофилы (Zhang et al., 2000). Более того, делеции экзона Мех1 титина и Мех2, которые содержат киназный домен титина, дают меньшее количество мышечных волокон. Всё это указывает на то, что С-терминальная область титина важна в сигнальном пути, который участвует в контроле миофибриллогенеза и оборота белка в мышечных трубках и мышцах. Предполагается, что актиность киназы титина и/или связывание белков М-линии, таких как миомезин, связаны с С-терминальными доменами титина.
Не является сюрпризом, что интеграция укороченного титина без доменов М-линии в мышечные саркомеры вызывает образование менее урорядеченных М-линий. Неожиданно obscurin также оказывается неправильно локализованным, это говорит о том, что доставка в М-линию м. зависеть от еще неустановленного взаимодействия титина. Сборка de novo мышце-специфических белков в мышечные саркомеры всё ещё плохо изучена. Возможно сначала формируются пре-миофибриллы, это согласуется с тем, что Z-линии и мышце-специфический актин находятся вместе с немышечным миозином и титином (Sanger et al., 2002), а белки толстых саркомерных филамент постепенно обмениваются на пер-миофириллы, чтобы сформировать саркомеры. В подтверждение этой концепции структуры, сходные со стрессовыми волокна, содержаoие титин и др. белки толстых филамент за исключением саркомерного миозина, формируются первыми, а затем вставляется саркомерный миозин, чтобы сформировать мышечные саркомеры (Van der Ven et al., 1999). Dj второй модели формирование цитоскелетной поддержки инициируется с помощью ассоцииации титин. актина и α-актинина в Z-линии, это сопровождается ассоциацией титина с миомезином в М-линии, прежде чем миозиновые филаменты будут собрнаы в саркомеры (Ehler et al.,1999; Van der Ven et al., 1999). Следовательно, разрушение М-линий м. затрагивать интеграцию миозина в мышечные саркомеры, т.к. поддерка м.б. сформирована не полностью и это м. объяснить меньшую упорядоченность саркомеров. Сходное нарушение М-линии описано у мышей с условным нокаутом Мех1 и Мех2 экзонов титина (Gotthaкве уе al.n 2003). Мы нашли, что окрашивание по миомезину, который соединяется с титином в М-линии затрагивается мало. Это м. указывать на то. что сборка миомезина на М-линии происходит раньше и не зависит от полного набора титиновых молекул в А-диске и что один нормальный аллель достаточен для поставки.
Мы также ожидали, что нарушение титоновой киназы будет вызывать снижение фосфорилирования её субстрата, такоеого как telethonin, который обнаруживается в Z-линиях взрослых кардиальных и скелетных мышц. Однако было установлено, что telethonin не находится в Z-линиях развивающихся мышечных трубок, а имеет точечную цитоплазматическую локализацию. Эта цитозольная локализация обнаруживается также в эмбриональногм сердце мышей in situ. Myostatin является членом семейства TGFβ, который является негативным регулятором мышечного роста, он обнаруживается в кардиальных и скелетных мышцах. Секреция миостатина ведет к снижению пролиферациии и дифференцировки миобластов. Это открывает интерсную возможность, что одним из нижестоящих эффектов титинового киназного экзона, как полагают, м.б. снижение фосфорилирования yelethonin? это м. приодить к его неправильной агрегации, что в свою очередь м. влиять на серкуцию миостатина в этих ранних мышечных трубках. М. ожидать что будет общий нокаут на эффект слияния миобластов и раннюю дифференцировку.
Неожиданно мы нашли, что разрушение С-терминальной области титина влияет на организацию Z-линий. Это влияет также на организацию obscurin, который локализуется как в Z-дисках, так и и М-полосах. Т.к. образование Z-линий явлется ранним процессом и происходит до образования саркомеров, то м. ожидать, что Z-линии будут формироваться нормально в targeted клетках. Следовательно, С-терминальная область титина является важной для организации z-линий. Возможным объяснением м.б. то, что снижение киназной активности вызывает снижение фосфорилирования telethonin и уменьшение его связи с Z-линиями путём взаимодействия с FATZ, белком, который также связывает α-актинин и филамин в Z-линиях. Однако. это моловероятно. т.к. мы не нашли чёткой локализации телетонина в Z-линиях ни у нормальных, ни у targeted клеток. Эффекты м.б. обусловлены изменением активности неизвестного субстрата киназы, важного для образования Z-линий. Идентифицировано большое количество белков, которые связаны с Z-линиями а также связываются с титином.
Сайт создан в системе uCoz