Роль HGF/Met Сигнальной Системы

Analysis of Mlc-lacZ Met Mutants Highlights the Essential Function of Met for Migratory Precursors of Hypoxial Muscles and Reveals a Role for Met in the Development of Hyoid Arch-Derived Facial Muscrles C.Prunotto, T.Crepaldi, P.E. Forni, A.Ieraci, R.G.Kelly, S.Tajbakhsh, M. Buckingham, C.Ponzetto Dev.Dyn. - 2004.- Vol. 231, No 3, P. 582-591
Табл.1 Effect of MetD/D Mutation on Skeletal Muscle Development	Все скелетные мышцы тела кроме головных происходят из дорсальной половины сомитов, которые во время развития становятся дермомиотомами. Т.к. epaxial (глубокие спины) мышцы развиваются in situ из медиальных половин дермомиотомов, то hypaxial (большей части тела и конечностей) мышцы возникают из латерального домена (Christ,Ordhal, 1995; Brand-Saberi, Christ, 1999). Последние развиваются двумя способами: мышцы языка, диафрагмы и конечностей происходят из предшественников, которые вычленяются в окципитальной, шейной и на уровне конечностей от вентральных губ дермомиотомов и мигрируют в качестве отдельных клеток к местам своего предназначения (Dietrich, 1999; Christ, Brand-Saberi, 2002). Напротив, межреберные и вентральной части тела мышцы происходят из непрерывно растущих вентролатеральных 'muscle buds' с флангов, которые остаются эпителиальными и в конечном итоге сливаются по вентральной срединной линии (Christ, Ordahl, 1995). Идентифицированы некоторые гены, которые контролируют миграцию миогенных предшественников (Birchmeier, Brohmann, 2000; Buckingham, 2001; Buckingham et al., 2003). Среди этих генов транскрипционный фактор Рах3 (Splotch;Goulding et al., 1994; Tremblay et al., 1998) и HGF/Met пара лиганд-рецептор. Их инактивация приводит к отсутствию миграции всех мышц (Bladt et al., 1995; Schmidt et al., 1995; Maina et al., 1996; Yang et al., 1996). У Met и HGF нокаутных моделей эти клетки неспособны вычленяться и остаются в сомитах (Dietrich et al., 1999). У мышей Splotch? у которых мутирован Рах3 дефект более серьёзный и презумптивные клетки-предшественники погибают от апоптоза, вызывая разрушение эпителиальной структуры сомитов (Borycki et al., 1999). Имеются доказательства, что с-met и Рах3 генетически связаны. Промотор с-met включает сайт связывания Рах3 и управляет транскрипцией репортерного гена в клетках, экспрессирующих Рах3 (Epstein et al., 1996). Оба гена коэкспрессируются в вентролатеральной губе дермомиотома. Транскрипты с-met редуцированы у мутантов Splotch, хотя потеря клеток осложняет интерпретацию, т.к. с-met избыточно экспрессируется в присутствии сильного транскрипционного активатора Pax3-FKHR (Relaix et al., 2003). Хотя экспрессируемый во всех сомитах Met и обеспечивает вычленение только на соотв. аксиальных уровнях, это обусловлено тем, что адекватные количества HGF присутствуют только в мезодерме зачатков конечностей или фарингеальной области (Dietrich et al., 1999). HGF экспрессируется также на высоком уровне вдоль маршрутов, используемых миграторными клетками для достижения septum transversum или языка, где они дают диафрагму или мышцы языка. Это указывает на то, что он м.б. также необходим для поддержания мигрирующих клеток недифференцированными или для обеспечения их пролиферации. Необходимо отметить, что Рах3 и с-met коэкспрессируются в дорсальной губе всех сомитов и в вентральной губе сомитов в области между конечностями. Однако, хотя у Splotch мышей формирование epaxial и стенки тела мышц также нарушено (Tajbakhch et al., 1997; Tremblay et al., 1998), но фенотип ранних мышц у мутантов hgf и с-met ограничивается отсутствием мышц, которые мигрируют (Dietrich et al., 1999). Ранее была получена серия сигнальных мутантов Met рецепторов с мышечным фенотипом разной тяжести. У наиболее тяжелых мутантов (Met^D/D) сигнальная трансдукция отсутствовала полностью из-за превращения в фенилаланин двух критических остатков тирозина в С-терминальном хвосте рецептора (Maina et al., 1996; 2001). Met^D/D эмбрионы были функционально эквиваленты нокауту и отсутствию миграторных гипаксиальных мышц. У др. мутантов, три аминокислоты ниже двух тирозинов были модифицированы, чтобы преимущественно активировать PI-3kinase (PI-3K, Met^2P/2P) или Src (Met2^S/2S; Maina et al., 2001). У этих мутаций с частичной потерей функции мышцы, происходящие из миграторных предшественников, были существенно редуцированы. Здесь изучали роль Met в раннем развитии мышц путём скрещивания с-met сигнальных мутантов с трансгенными мышами, экспрессирующими n-lacZ полд контролем регуляторных элементов гена миозина Mlc3f (Mlc-lacZ; Kelly et al., 1995). Это позволяло визуализовать развивающиеся мышцы Met мутантных эмбрионов с помощью окрашивания β-галактозидазы. Анализ показал, что у наиболее тяжелых Met мутантов поверхностные мышцы головы были или редуцированы или отсутствовали. Т.к. эти мышцы возникают из клеток, происходящих из гиоидной дуги, то это наблюдение распространяет роль HGF и Met и на развитие субнабора пресомитных мезодермальных предшественников. DISCUSSION Анализ Splotch/Met^D/D компаундных мутантов подтвердил, что Splotch фенотип включает в себя Met-вызываемые дефекты и что с-met стоит иерархически ниже Рах3 в сомитных миогенных клетках. К такому же выводу пришли исследователи knock-in мышей, экспрессирующих "суперактивный" трансактиватор Pax3-FKHR вместо Рах3 (Relaix et al., 2003). Экспрессия Met активируется в дермомиотоме таких эмбрионов и это ведет к несоответствующему вычленению клеток из сомитов между конечностями. Это также подтверждает, что c-met является непосредственной мишенью Рах3 in vivo . Анализируя эмбрионов на ст. Е14.5, удалось идентифицировать точно гипаксиальные мышцы, которые отсутствуют у мутантов Met^D/D. Помимо аппендикулярных и плечевых мышц наши результаты особенно наглядно продемонстрировали отсутствие поверхностной дермальной мышцы cutaneous maximus и потерю большинства intrinsic и некоторых extrinsinc мышц языка. Присутствие некоторых мышц языка в недоразвитой форме при отсутствии др. указывает на существование субнабора предшественников, способных колонизировать язык в отсутствии передачи сигналов Met, т.е. отдельных от с-met зависимо вычленяющихся предшественников из окципитальных сомитов (Dietrich et al., 1999). Эти предшественники, однако, м. всё ещё нуждаться в Met для своей пролиферации, это подтверждается и в работе Amano et al (2002), которые недавно показали. что HGF способствует пролиферации миогенных клеток во время раннего развития языка. Немиграторные гипаксиальные мышцы присутствовали все у мутантов Met^D/D, подтверждая их независимость от передачи сигналов Met. Функция Met в предшественниках этих мышц остаётся неясной. Экспрессия Met м. метить клетки, которые во время первичного миогенеза избегают дифференцировки и остаются дремлющими, такие как плодные миобласты или предшественники сателлитных клеток. Неожиданно у поздних Met^D/D эмбрионов субнабор головных мышц, происходящих из гиоидной дуги и необходимых для выражения лица, оказывается или сильно редуцированным или отсутствует. Напротив, жевательные мышцы, которые происходят из мандибулярной дуги, присутствуют. Эти две группы мышц происходят из предшественников краниальной параксиальной мезодермы, которые сначала перемещаются в бранхиальные дуги, а позднее подвергаются дальнейшей миграции вследствие разных онтогенетических программ (Hacker, Guthrie, 1998; Carvajal et al., 2001). Хотя hgf экспрессируется на высоком уровне в мезодерме бранхиальных дуг (Andermarcher et al., 1996; Caton et al., 2000) ни мы , ни др. оказались неспособны выявить с-met-позитивные клетки в бранхиальных дугах с помощью гибридизации in situ. Однако, небольшие количества с-met-позитивных миогенных предшественников м. избегать обнаружения. Или из-за того, что эти клетки не подвергаются ступени вычленения и на ранних стадиях они м.б. независимыми от экспрессии Met. Транскрипты с-met, которые мы нашли в предполагаемых миогенных предшественниках, происходящих из гиоидной дуги, на поздних стадиях (Е12.5-Е13.5) м. указывать на то, что передача сигналов Met м. вность вклад в их миграцию и пролиферацию. Изучение двух гипоморфных мутаций PI-3kinase (PI-3K, Met^2P/2P) или Src (Met2^S/2S; Maina et al., 2001) показало, что у этих мышей миграция предшественников в конечности сильно нарушена. На ст. Е11.5 у этих мышей не обнаруживаются и следы дифференцированных клеток в передних конечностях. В ходе дальнейшего развития некоторые мышцы конечносте развиваются. Следовательно, индивидуальные группы мышц, по-видимому, по разному затрагиваются у этих мутантов и не все предшественники одинаково зависят от передачи сигналов Met. Существование раннего паттернирования предшественников мышц конечностей подтверждается и фенотипами мышц у др. мутантов, таких как Lbx1 и Mox2 нокаутов, которые обусловливают отсутствие или уменьшение определенных групп мышц конечностей. Неожиданным свойством этих гипоморфных мутантов стало существенное восстановление мышц конечностей на ст. Е14.5 по сравнению с ранними стадиями, когда не выявляются следов дифференцированных клеток. Это восстановление м.б. обусловлено поздней миграцией клеток или компенсаторной пролиферацией тех немногих клеток, которые первоначально колонизировали конечность. Эксперименты in vitro подтвердили бы наличие компенсаторной пролиферации Met-позитивных миогенных предшественников, уже присутствующих в конечностях. Однако, количества Х-gal-позитивных клеток не увеличивались во время культивирования. Поэтому остаётся открытым вопрос о восстановлении в результате поздно-мигрировавших Met-позитивных клеток предшественников. Однако, мы оказались неспособны обнаружить их в эмбриональных конечностях с помощью in situ гибридизации с с-met зондом.

Все скелетные мышцы тела кроме головных происходят из дорсальной половины сомитов, которые во время развития становятся дермомиотомами. Т.к. epaxial (глубокие спины) мышцы развиваются in situ из медиальных половин дермомиотомов, то hypaxial (большей части тела и конечностей) мышцы возникают из латерального домена (Christ,Ordhal, 1995; Brand-Saberi, Christ, 1999). Последние развиваются двумя способами: мышцы языка, диафрагмы и конечностей происходят из предшественников, которые вычленяются в окципитальной, шейной и на уровне конечностей от вентральных губ дермомиотомов и мигрируют в качестве отдельных клеток к местам своего предназначения (Dietrich, 1999; Christ, Brand-Saberi, 2002). Напротив, межреберные и вентральной части тела мышцы происходят из непрерывно растущих вентролатеральных 'muscle buds' с флангов, которые остаются эпителиальными и в конечном итоге сливаются по вентральной срединной линии (Christ, Ordahl, 1995).

Идентифицированы некоторые гены, которые контролируют миграцию миогенных предшественников (Birchmeier, Brohmann, 2000; Buckingham, 2001; Buckingham et al., 2003). Среди этих генов транскрипционный фактор Рах3 (Splotch;Goulding et al., 1994; Tremblay et al., 1998) и HGF/Met пара лиганд-рецептор. Их инактивация приводит к отсутствию миграции всех мышц (Bladt et al., 1995; Schmidt et al., 1995; Maina et al., 1996; Yang et al., 1996). У Met и HGF нокаутных моделей эти клетки неспособны вычленяться и остаются в сомитах (Dietrich et al., 1999). У мышей Splotch? у которых мутирован Рах3 дефект более серьёзный и презумптивные клетки-предшественники погибают от апоптоза, вызывая разрушение эпителиальной структуры сомитов (Borycki et al., 1999). Имеются доказательства, что с-met и Рах3 генетически связаны. Промотор с-met включает сайт связывания Рах3 и управляет транскрипцией репортерного гена в клетках, экспрессирующих Рах3 (Epstein et al., 1996). Оба гена коэкспрессируются в вентролатеральной губе дермомиотома. Транскрипты с-met редуцированы у мутантов Splotch, хотя потеря клеток осложняет интерпретацию, т.к. с-met избыточно экспрессируется в присутствии сильного транскрипционного активатора Pax3-FKHR (Relaix et al., 2003). Хотя экспрессируемый во всех сомитах Met и обеспечивает вычленение только на соотв. аксиальных уровнях, это обусловлено тем, что адекватные количества HGF присутствуют только в мезодерме зачатков конечностей или фарингеальной области (Dietrich et al., 1999). HGF экспрессируется также на высоком уровне вдоль маршрутов, используемых миграторными клетками для достижения septum transversum или языка, где они дают диафрагму или мышцы языка. Это указывает на то, что он м.б. также необходим для поддержания мигрирующих клеток недифференцированными или для обеспечения их пролиферации.

Необходимо отметить, что Рах3 и с-met коэкспрессируются в дорсальной губе всех сомитов и в вентральной губе сомитов в области между конечностями. Однако, хотя у Splotch мышей формирование epaxial и стенки тела мышц также нарушено (Tajbakhch et al., 1997; Tremblay et al., 1998), но фенотип ранних мышц у мутантов hgf и с-met ограничивается отсутствием мышц, которые мигрируют (Dietrich et al., 1999).

Ранее была получена серия сигнальных мутантов Met рецепторов с мышечным фенотипом разной тяжести. У наиболее тяжелых мутантов (Met^D/D) сигнальная трансдукция отсутствовала полностью из-за превращения в фенилаланин двух критических остатков тирозина в С-терминальном хвосте рецептора (Maina et al., 1996; 2001). Met^D/D эмбрионы были функционально эквиваленты нокауту и отсутствию миграторных гипаксиальных мышц. У др. мутантов, три аминокислоты ниже двух тирозинов были модифицированы, чтобы преимущественно активировать PI-3kinase (PI-3K, Met^2P/2P) или Src (Met2^S/2S; Maina et al., 2001). У этих мутаций с частичной потерей функции мышцы, происходящие из миграторных предшественников, были существенно редуцированы.

Здесь изучали роль Met в раннем развитии мышц путём скрещивания с-met сигнальных мутантов с трансгенными мышами, экспрессирующими n-lacZ полд контролем регуляторных элементов гена миозина Mlc3f (Mlc-lacZ; Kelly et al., 1995). Это позволяло визуализовать развивающиеся мышцы Met мутантных эмбрионов с помощью окрашивания β-галактозидазы. Анализ показал, что у наиболее тяжелых Met мутантов поверхностные мышцы головы были или редуцированы или отсутствовали. Т.к. эти мышцы возникают из клеток, происходящих из гиоидной дуги, то это наблюдение распространяет роль HGF и Met и на развитие субнабора пресомитных мезодермальных предшественников.

DISCUSSION

Анализ Splotch/Met^D/D компаундных мутантов подтвердил, что Splotch фенотип включает в себя Met-вызываемые дефекты и что с-met стоит иерархически ниже Рах3 в сомитных миогенных клетках. К такому же выводу пришли исследователи knock-in мышей, экспрессирующих "суперактивный" трансактиватор Pax3-FKHR вместо Рах3 (Relaix et al., 2003). Экспрессия Met активируется в дермомиотоме таких эмбрионов и это ведет к несоответствующему вычленению клеток из сомитов между конечностями. Это также подтверждает, что c-met является непосредственной мишенью Рах3 in vivo .

Анализируя эмбрионов на ст. Е14.5, удалось идентифицировать точно гипаксиальные мышцы, которые отсутствуют у мутантов Met^D/D. Помимо аппендикулярных и плечевых мышц наши результаты особенно наглядно продемонстрировали отсутствие поверхностной дермальной мышцы cutaneous maximus и потерю большинства intrinsic и некоторых extrinsinc мышц языка. Присутствие некоторых мышц языка в недоразвитой форме при отсутствии др. указывает на существование субнабора предшественников, способных колонизировать язык в отсутствии передачи сигналов Met, т.е. отдельных от с-met зависимо вычленяющихся предшественников из окципитальных сомитов (Dietrich et al., 1999). Эти предшественники, однако, м. всё ещё нуждаться в Met для своей пролиферации, это подтверждается и в работе Amano et al (2002), которые недавно показали. что HGF способствует пролиферации миогенных клеток во время раннего развития языка.

Немиграторные гипаксиальные мышцы присутствовали все у мутантов Met^D/D, подтверждая их независимость от передачи сигналов Met. Функция Met в предшественниках этих мышц остаётся неясной. Экспрессия Met м. метить клетки, которые во время первичного миогенеза избегают дифференцировки и остаются дремлющими, такие как плодные миобласты или предшественники сателлитных клеток.

Неожиданно у поздних Met^D/D эмбрионов субнабор головных мышц, происходящих из гиоидной дуги и необходимых для выражения лица, оказывается или сильно редуцированным или отсутствует. Напротив, жевательные мышцы, которые происходят из мандибулярной дуги, присутствуют. Эти две группы мышц происходят из предшественников краниальной параксиальной мезодермы, которые сначала перемещаются в бранхиальные дуги, а позднее подвергаются дальнейшей миграции вследствие разных онтогенетических программ (Hacker, Guthrie, 1998; Carvajal et al., 2001). Хотя hgf экспрессируется на высоком уровне в мезодерме бранхиальных дуг (Andermarcher et al., 1996; Caton et al., 2000) ни мы , ни др. оказались неспособны выявить с-met-позитивные клетки в бранхиальных дугах с помощью гибридизации in situ. Однако, небольшие количества с-met-позитивных миогенных предшественников м. избегать обнаружения. Или из-за того, что эти клетки не подвергаются ступени вычленения и на ранних стадиях они м.б. независимыми от экспрессии Met. Транскрипты с-met, которые мы нашли в предполагаемых миогенных предшественниках, происходящих из гиоидной дуги, на поздних стадиях (Е12.5-Е13.5) м. указывать на то, что передача сигналов Met м. вность вклад в их миграцию и пролиферацию.

Изучение двух гипоморфных мутаций PI-3kinase (PI-3K, Met^2P/2P) или Src (Met2^S/2S; Maina et al., 2001) показало, что у этих мышей миграция предшественников в конечности сильно нарушена. На ст. Е11.5 у этих мышей не обнаруживаются и следы дифференцированных клеток в передних конечностях. В ходе дальнейшего развития некоторые мышцы конечносте развиваются. Следовательно, индивидуальные группы мышц, по-видимому, по разному затрагиваются у этих мутантов и не все предшественники одинаково зависят от передачи сигналов Met. Существование раннего паттернирования предшественников мышц конечностей подтверждается и фенотипами мышц у др. мутантов, таких как Lbx1 и Mox2 нокаутов, которые обусловливают отсутствие или уменьшение определенных групп мышц конечностей.

Неожиданным свойством этих гипоморфных мутантов стало существенное восстановление мышц конечностей на ст. Е14.5 по сравнению с ранними стадиями, когда не выявляются следов дифференцированных клеток. Это восстановление м.б. обусловлено поздней миграцией клеток или компенсаторной пролиферацией тех немногих клеток, которые первоначально колонизировали конечность. Эксперименты in vitro подтвердили бы наличие компенсаторной пролиферации Met-позитивных миогенных предшественников, уже присутствующих в конечностях. Однако, количества Х-gal-позитивных клеток не увеличивались во время культивирования. Поэтому остаётся открытым вопрос о восстановлении в результате поздно-мигрировавших Met-позитивных клеток предшественников. Однако, мы оказались неспособны обнаружить их в эмбриональных конечностях с помощью in situ гибридизации с с-met зондом.