Посещений:
Ядерные Поры

Сборка и Разборка

Dynamics of nuclear pore complex organization through the cell cycle
Gwenael Rabut, Peter Lenart and Jan Ellenberg (jan.ellenberg@embl.de)
Current Opinion in Cell Biology 2004, 16:314­321

In eukaryotic cells, all macromolecules that traffic between the nucleus and the cytoplasm cross the double nuclear membrane through nuclear pore complexes (NPCs). NPCs are elaborate gateways that allow ef.cient, yet selective, translocation of many different macromolecules. Their protein composition has been elucidated, but how exactly these nucleoporins come together to form the pore is largely unknown. Recent data suggest that NPCs are composed of an extremely stable scaffold on which more dynamic, exchangeable parts are assembled. These could be targets for molecular rearrangements that change nuclear pore transport properties and, ultimately, the state of the cell.


Рис.1.  |  Ядерные поры


Рис.2.  |  Транспорт рибосом



Electron Microscopy: Nuclear Pore Complex A three-dimensional image of the nuclear pore complex (NPC), revealed by electron microscopy.
A-B The NPC in yeast. Figure A shows the NPC seen from the cytoplasm while figure B displays a side view.
C-D The NPC in vertebrate (Xenopus). Figure A shows the NPC seen from the cytoplasm while figure B displays a side view.



Ядерные оболочки (NE) у всех эукариот перфорированы большими мультипротеиновыми комплексами, известными как nuclear pore complexes (NPCs). Они формируют жидкостные каналы, которые являются воротами для всего молекулярного трафика между ядром и цитоплазмой. На ультраструктурном уровне, NPCs имеют восьмигранную симметричную архитектуру. Их стержневая часть вставлена в ядерную мембрану и состоит из 8 спиц (spokes) в виде сендвича между цитоплазматическим и нуклеоплазматическим кольцами [1]. Наружу от этих колец исходят филаменты, а ядерные филаменты соединяются под дистальным кольцом в структуру, сходную с баскетбольной корзинкой. Комплекс состоит из множественных копий из ~ 30 белков, наз. nucleoporins и др. ассоциированных белкав [2,3]. В клетках позвоночных только два нуклеопорина, Pom121 и gp210, являются интегральными мембранными белками и , следовательно, служат якорями для NPCs в ядерной мембране [4]. Все остальные nucleoporins синтезируются в виде растворимых белков и большинство из них локализуется симметрично с обеих сторон NPCs [3]. Немногие из тех, что обильны или исключительно локализуются на одной из сторон NPC, вероятно составляют цитоплазматические и нуклеоплазматические филаменты. Некоторые nucleoporins тесно ассоциированы со своими соседями, формируя субкомплексы NPC, которые м.б. изолированы биохимически; они м. формировать ‘строительные блоки’ для сборки NPC [4,5]).
Прохождение через NPC очень тонко регулируется и специфично, и очень эффектно, с сотнями событий транслокаций в сек. [6,7]. Как NPCs обеспечивают столь массивный2 макромолекулярный ток, все ещё дебатируется [4]. Чёткая картина молекулярной организации и динамики NPC является одним из основных требований транспортного механизма. В данном обзоре основное внимание уделяется динамическим аспектам организации NPC.

Assembly of the nuclear pore complex


Сборка новых NPCs в NE делает возможным клеточный рост и изменения метаболической активности. Цикл удвоения в клетках млекопитающих или дрожжей количества NPCs между G1 и G2 необходим для подготовки к делению [8,9]. Сходным образом ооциты накапливают миллионы NPCs на своих NE и в цитоплазме [10–12], чтобы накопить материал для быстрых клеточных делений, которые происходят в раннем эмбриогенезе. Интерфазные клетки м. также увеличивать количаства своих NPCs в ответ на изменения их метаболической активности, напр., после стимуляции гормонами [13,14]. У высших эукариот, которые подвергаются открытым митозам разрушение и повторная сборка их NE, включая и NPCs, происходит в каждом клеточном делении [15], это нуждается в массивной и синхронной повторной сборке NPC в телофазе. Пока неясно, происходит ли сборка интерфазных и митотических NPC с помощью одного и того же механизма. Очевидно, что они происходят в двух очень разных клеточных состояниях. В то время как постмитотическая сборка происходит в M-фазной цитоплазме и перед или покрайней мере одновременно с образованием ядерной мембраны, а интерфазная сборка происходит в присутствии полной интактной двухмембранной NE и интерфазной цитоплазмы (Рис. 1).



Models of nuclear pore assembly in mitosis and interphase. At the end of mitosis NPC components (mainly nucleoporins of the stable scaffold) may bind to the chromatin surface first. These ‘prepores’ would then be surrounded by the endoplasmic reticulum and serve as platforms for assembly of peripheral NPC components (a). Alternatively, chromatin is first surrounded by a continuous double membrane into which NPCs are inserted by membrane fusion (b). Finally lamins are imported through the already functional NPCs and polymerize underneath the NE. See text for further details. The mechanism of interphase NPC assembly is unknown. In principle both mitotic mechanisms can function in interphase as well. However in this case prepore formation requires the import of scaffold nucleoporins and the insertion of the ‘NPC seed’ into the NE (c). The membrane fusion mechanism could function exactly as in mitosis (d). Another possibility for interphase NPC formation is that new NPCs form by splitting of a pre-existing complex (e). Red/orange denotes NPC; yellow denotes nuclear membranes; brown denotes lamina; blue denotes chromatin.

Для выяснения механизма сборки NPC разработаны бесклеточные методы, чтобы воспроизвести их до прикрепления к мембране, наблюдая с помощью электронной микроскопии [16,29]. Недавно было установлено, что Nup107 и Nup133 (и возможно весь Nup107–160 комплекс) ассоциирует с хроматином рано в анафазе [28,30], до продукции белков внутренней ядерной мембраны. Иммуноистощение Nup107–160 комплексов ингибирует сборку NPC in vitro, в результате образются ядерные мембраны без пор [28,31]. Однако, очищенные Nup107–160 комплексы, добавляемые обратно до того как мембраны будут замкнуты вокрух хроматина, восстанавливают сбоорку NPC [28]. Это указывает на то, что Nup107– Nup160 комплекс является частью структуры предпор на хроматине. Необходимо проверить, участвуют ли дополнительные нуклеопорины в формировании предпор и как они последовательно инкорпорируются в ядерные мембраны.
Эти два механизма инициации сборки NPC, слияние мембран и формирование предпор, м. в принципе также оперировать в интерфазе (Рис. 1). однако в контексте интактной NE третий, хотя и спекулятивный механизм, также возможен. В этом случае, предсуществующие NPCs м. служить в качестве метриц для образования новых NPC с помощью ‘splitting’ механизма (Рис. 1c).
В дополнение к роли нуклеопоринов, имеются надёжные доказательства, что Importin-band RanGTP непосредственно участвует в регуляции инициации сборки NPC [32–35]. RanGTP м. высвобождать Importin-b из Nup107 и Nup153 и индуцировать образование комплексов более высокого порядка из этих нуклеопоринов [32], которые и инициируют сборку NPC. Т.к. Ran концентрируется на хроматине [36], то это д. гарантировать, что сборка NPC будет пространственно ограничена. Слишком малые количества RanGTP или слишком большие количества Importin-b ингибируют сборку NPC, тогда как слишком большие количества RanGTP или слишком малые количества Importin-b индуцируют эктопическую цитоплазматическую сборку NPC [32]. Если сборка начата, то разные компоненты NPC, по-види мому, добавляются ступенчатым образом в ранней телофазе, за известным исключением Tpr и gp210, которые, по-видимому, добавляются только после начала активности по импорту [24,25,37–39]. Хотя определенные структурные промежуточные образования м. наблюдаться в ЭМ [40,41], точная молекулярная последовательность механизма сборки остаётся неясной. Т.к. митотическая сборка NPC является очень быстрым процессом, то для разрешения этого ключевого вопроса необходимы количественные in vivo imaging assays, в идеале непосредственно скомбинированные с ультраструктурными подходами.

Dynamics of interphase nuclear pore complexes


Будучи собранными, NPCs являются, по-видимому, очень стабильными и сохраняются в течение всей интерфазы в живых клетках (Rabut and Ellenberg, unpublished). В делящихся клетках, в которых сборка NPC блокировна, количество NPC будет медленно разбавляться с помощью продолжающихся делений [28,42,43]. Однако, нет сведений, что NPCs м. разбираться не проходя митоза или апоптоза [44]. NPCs высших эукариот также полностью неподвижны в плоскости NE [39], вероятно в результате их взаимодействия с ядерной ламиной [45]. Период полужизни определен биохимически только для очень немногих nucleoporins [46]. Однако, некоторые GFP-меченные nucleoporins обнаруживаются связанными чрезвычайно длительное время в NPCs в клетках млекопитающих. Pom121 , как было установлено, замещается менее одного раза на клеточный цикл [39]. Вместе с его ранней поставкой во время сборки NPC [25,39], это указывает на то, что Pom121 функционирует как якорь для NPCs в ядерной мембране, но доказательства этому всё ещё отсутствуют. Помимо POM121, два члена комплекса Nup107–160 обнаруживают сходную стабильность [30]. Принимая во внимание их функцию в образовании предпор и их центральную локализацию в NPC [30,47], эти nucleoporins скорее всего являются конституитивной структурной поддержкой NPC’s. Разные клессы нуклеопоринов, как было установлено, только временно ассоциируют с NPCs, перемещаясь в и из в течение нескольких минут. Это Nup50 [48] (или его дрожжевой аналог Nup2p [49]), Nup153 и Nup98 [39,50,51]. Как мобильность нуклеопоринов связана с нуклео-цитоплазматическим транспортом, всё ещё неясно, но предполагаются множественные функции, включая таргетинг, транслокации, рециклинг и высвобождение транспортных комплексов из NPCs [48–54], и регуляцию малой GTPase Ran [49]. Однако, учитывая огромный поток молекул через каждую пору [6,7], диссоциация определенного нуклеопорина из NPCs возможна только в субнаборе транспортных событий.
Организация интерфазных NPCs, по-видимому, является результатом стабильной локализации каждого нуклеопорина. Пока неясно, до какой степени NPCs м.б. молекулярно модифицированы в отношении своих транспортных свойств, и м. ли такое ремоделирование происходить в одиночных NPCs или в ядре как в целом. То, что субнаборы NPCs м. обладать специальными транспортными активностями [55] противоречит наблюдениям, что большинство NPCs одновременно компететны к импорту и экспорту [56,57]. Однако, недавно было установлено у дрожжей, что NPCs вблизи ядрышек не содержат Mlp1, нуклеопорин из ядерных филамент, необходимый для ядерной удержания несплайсированных мРНК, указывает на то, что эти NPCs м. не только экспортировать mRNA [58]. Помимо существования разных типов NPC в одном ядре, имеются различия между клетками: продемонстрирована тканеспецифическая экспрессия определенных нуклеопоринов [22,23,59–62]. Более того, у дрожжей состав и проницаемость NPC м. меняться при метаболических манипуляциях [63]. В комбинации с тем фактом, что проницаемость NPC отличается между пролиферирующими и молчащими клетками [64], это указывает на то, что клетки м. модифицировать молекулярную архитектуру своих NPCs, возможно адаптируясь к разным потребностям в ядерно-цитоплазматическом транспорте. Наконец, некоторые вируся м. изменять состав NPC, нарушая трафик клеточных РНК и белков [65]. Напр., деградация Nup153 и Nup62 во время инфекции poliovirus или rhinovirus совпадает с релокализацией ядерных белков в цитоплазму [66,67].

Reorganization of nuclear pore complexes during closed mitosis


Возникает парадигма, что митотическая реорганизация клеточной архитектры не только достигается фосфорилированием и деградацией белка, но также и изменениями субклеточной локализации белков. Во время интерфазы, ключевые митотические регуляторы часто отделены от своих мишеней с помощью секвестрации или в цитоплазме или в ядре и это позволяет взаимодействовать только когда они смешиваются во время митоза. Прекрасными примерами являются накопления в ядре cdc2/cyclinB [68] и доступ регулторов ядерных микротрубочек (таких как TPX2, NuMA и NuSAP) к цитоплазматическому тубулину во время NE breakdown (NEBD) [69,70]. Считается, что такая релокация достигается или с помощью специфических изменений в ядерном транспорте (вызыванном, напр., фосфорилированием nuclear localization signal [NLS]) или с помощьюнуклео-цитоплазматического перемешивания во время открытых митозов [68]. Однако, недавние исследования у грибов, которые имеют закрытые митозы, показали, что ремоделирование NPC м. менять проницаемость NE, чтобы позволить войти ключевым митотическим регулятором (Рис. 2a).
У Aspergillus nidulans митотическая киназа NIMA, по-видимому, регулирует состав и возможно структуру NPC с помощью фосфорилирования нуклеопоринов Gle2/Rae1 и Nup98 [71]. Это ремоделирование NPC необходимо для проникновения в ядро комплекса cdc2/cyclinB, a NIMA мутанты останавливаются на поздней G2 с неправильно локализованным cdc2/cyclinB [72]. NPC ремоделирование непосредственно, по-видимому, не влияет на немногие специфические важные



Prophase NPC disassembly in closed and open mitosis. (a) In the closed mitosis of Aspergillus and other fungi, tubulin is excluded from the nucleus during interphase. In prophase, NPCs are remodeled allowing nuclear entry of tubulin and other cytoplasmic factors, which is in turn essential for the formation of the intra-nuclear spindle. The NPC scaffold, however, remains intact throughout the cell division, preserving the integrity of the NE. (b) Partial NPC disassembly is also the initial step of NE breakdown in the open mitosis of many metazoa. Remodeled NPCs allow the nuclear entry of small proteins, such as tubulin, several minutes before the complete breakdown of the NE. The NPC scaffold and the lamina only disassemble later, when large discontinuities have already appeared on the NE. Red/orange denotes NPCs; yellow denotes the NE; brown denotes lamina; blue denotes chromatin; dark green denotes microtubules; pale green represents soluble tubulin.

грузы, а скорее ведет к общему увеличению проницаемости NE, это также вызывает вхождение растворимого тубулина [73]. У др. грибов вхрждение в ядро GFP наблюдалось также во время профазы [74].
Напротив, кажется, что у почкующихся дрожжей структура NPC остаётся в основном интактной, т.к. большинство нуклеопоринов и важные грузы не менядт своей стабильной локализации во время митозов [75]. Однако, имеются указания на более лёгкие изменения NPC во время митозов у этого организма. В клетках, арестованных в митозе, Nup53p меняет своих партнёров по связыванию, это в свою очередь ведет к ингибированию Kap121p-зависимого пути импорта и одновременно к высвобождению Mad2p из NPC и его последующего связывания с кинетохорами [75,76].
Итак, картина, наблюдаемая при закрытых митозах, демонстрирует, что стержневая структура (scaffold) NPC остаётся неизменной, сохраняя тем самым интеграцию NE в ходе клетосного деления. Периферические структуры NPC, однако, по-видимому. подвергаются молекулярным пересторйкам, которые позволяют ограниченное смешивание из цитоплазмы и ядра, это м.б. существенным для прогресса клеточного цикла (Рис. 2a).

Nuclear pore complex disassembly during open mitosis


Недавно было показано, что частичная разборка NPC является первой ступенью NEBD в ооцитах морских звезд [77,78]. Во время ранней профазы периферические нуклеопорины (такие как Nup98, Nup153 и Nup214) последовательно высвобождаются из NPC, тогда как поддерживающие nucleoporins (напр., Pom121) остаются стабильно ассоциированными [78] (Рис. 2b). Имеются указания на то, что сходные механизмы действуют также и соматических клетках млекопитающих ([38]; Lenart and Ellenberg, unpublished). Соответ. на ультраструктурном уровне общая структура NE остаётся интактной с цилиндрическим кольцевым комплексом, внедренным в NE всё ещё различимым, хотя NPCs постепенно теряют периферические структуры как у морских звезд, так и у Drosophila [40,78]. В то же время, NLS-содержащие репортерные структуры высвобождаются из ядра одновременно с увеличением проницаемости в отношении инертной диффузии маркёров [78]. Asin Aspergillus, cdc2/cyclinB и растворимй тубулин также вступают в ядро в это же время [79]. Т.о., инициальная ступень и закрытого и открытого митоза, по-видимому, одинакова, это говорит о законсервированном механизме разборки NPC в профазе. Эта митотическая разборка NPC, как полагают, в основном управляется с помощью фосфорилирования. Некоторые нуклеопорины фосфорилируются в митозе [80–82] и фосфорилирование м. изменять транспортные свойства NPC in vitro [83]. Идентификация киназ, действующих in vivo , всё ещё не осуществлена. In vitro, cdc2 м. фосфорилировать некоторые нуклеопорины, а Aspergillus NIMA, экспрессируемая в клетках млекопитающих и ооцитах Xenopus ведет к разборке NE [84];однако, такой эффект пона не наблюдался при использовании любого из гомологов NIMA позвоночных.
При открытых митозах у большинства метазоа первая частичная разборка NPC сопровождается полным разрывом NE и дисперсией даже центральных нуклеопринов (Рис. 2b). Это, по-видимому, необходимо, т.к. крепкая структура NE метазоа стабилизирована с помощью ламины, лишенной эластичности, необходимой для деления ядра, и это даёт цитоплазматическим микротрубочкам достаточный доступ к хромосомам [15]. Как удаляется стержневая часть NPC из NE не совсем ясно, предложены две модели. У эмбрионов Drosophila мембранные поры исчезают после удаления стержневой части NPC, как полагают за счёт слияния; разрывы мембраны, обнаруживаемые позденее, д.б. независимыми от разборки NPC [40]. В ооцитах морских звезд, по-видимому, открытие и расширение стержневого кольца NPC и является главным источником больших фенестраций, наблюдаемых на поздних стадиях мейотической прометафазы [78]. Кроме того, недавно было показано, что компоненты coatomer machinery участвующие в цитоплазматическом мембранном переносе, таком как β-COP, м. участвовать в NEBD [85]. Прямые наблюдения разборки одиночных NPCs и образвания фенестраций мембран в живых клетках с помощью imaging в комбинации с correlative electron microscopy д. позволить сделать выбор между этими моделями в будущем.
В соматических клетках млекопитающих большие куски NE, содержащие остатки NPC и фрагменты ламины персистируют во время полной ядерной проницаемости и бысто устраняются из хромосом с помощью микротрубочек и перемещаются в направлении центросом [86]. В это время продолжается разборка NPC и на ст. метафазы все нуклеопорины диспергируют в цитоплазму за исключением двух мембранных белков, gp210 и Pom121, которые гомогенно распределяются в эндоплазматическом ретикулёме, а часть некоторых нуклеопоринов релокализуется в кинетохоры [30,31,87,88].

Conclusions


A new view of the dynamic organization of NPCs is currently appearing. Their scaffold is extremely stable and contains nucleoporins that are required for NPC assembly, while other nucleoporins are dynamically asso­ciated with NPCs. We suspect that the association of those nucleoporins with NPCs can be altered to modify NPC composition and transport properties, thereby changing the nucleocytoplasmic distribution of cellular proteins in different physiological contexts. Until now, only a few examples of such modi.cations have been described, during cell differentiation, stimulation or viral infection, at speci.c cell cycle stages, or even in speci.c regions of the NE in a single cell. Are those only isolated cases or do they reveal an emerging paradigm? Answer­ing this question will be challenging and will require quantitative tools enabling measurements of nucleo­porin stoichiometry in NPCs in intact cells as well as systematic ways of monitoring the impact of structural changes to the NPC on the nucleocytoplasmic balance of the proteome.
Сайт создан в системе uCoz