Во время нейруляции эмбриональная эктодерма оказывается подразделенной на нервную пластинку и проспективный эпидермис. Пограничная область между этими тканями становится нервным гребнем, что предопределяется экспрессией разнообразных специфических маркеров. Сюда входят транскрипционные факторы, такие как Slug или Snail, AP-2, Foxd3, PAX3, twist, Sox9, Zic5, и т.д., которые, по-видимому, у разных видов действуют на разных ростро-каудальных уровнях оси. Взаимодействия между нервной пластинкой и вкладом мезодермальных сигналов лежат в основе ранней экспрессии специфичных для гребня признаков. Доказательства получены первоначально на эмбрионах Xenopus , они показали, что два независимых сигнала обеспечивают эти взаимодействия на разных фазах этого многоступенчатого процесса, BMP сигнал, который д.б. модулирован с помощью ингибиторов, и отдельные входящие импульсы, которые могут быть или каноническими Wnt сигналами, FGF или ретиноевой кислотой. Вовлечение эти х факторов и комбинаций факторов документировано и представлено в обзорах (Kalcheim, 2000, Wu et al., 2003, Knecht and Bronner-Fraser, 2002 and refs. therein). Поэтому мы рассмотрим только новые данные о возможной роли специфических транскрипционных факторов в образовании нервного гребня.

Члены семейства Snail, которые включают Snail и Slug транскрипционные факторы, находятся среди самых ранних маркеров развития нервного гребня и , следовательно, их экспрессия широко используется для указания на появление презумптивного нервного гребня. Это необходимо рассматривать с осторожностью, т.к. клетки в дорсальных частях нервных складок, которые экспрессируют Slug, обладают потенциалом давать клоны как нервной трубки, так и гребня (Collazo et al., 1993; Selleck and Bronner-Fraser, 1995), и транскрипция Slug подавляется в туловище на уровне, где премиграторный нервный гребень всё ещё продуцируется (Sela-Donenefeld and Kalcheim, 1999). Участие Slug в продукции клеток нервного гребня впервые было установлено у цыплят при использовании антисмысловых олигонуклеотидов к мРНК Slug, которые предупреждали эмиграцию клеток вообще-то из-за ранних дефектов в их спецификации (Nieto et al., 1994). Напротив, избыточная экспрессия Slug приводит к увеличению продукции клеток гребня, эффект, которые ограничен краниальными уровнями оси (Del Barrio and Nieto, 2002). У мышей происходит обмен местами экспрессии Slug и Snail в домене гребня если сравнивать с эмбрионами птиц (Jiang et al., 1998; Sefton et al., 1998), указывая тем самым, что функция Snail у мышей такая же как Slug у кур. Функциональным доказательством возможной роли Snail в формировании гребня является то, что отсутствие его у мышей, обусловливает раннюю летальностью эмбрионов во время гаструляции (Carver et al., 2001). Тем не менее очевидно, что подобно Slug, Snail , по крайней мере, способен запускать эпителиально-мезенхимные превращения в культивируемых эпителиальных клетках млекопитающих (Cano et al., 2000), а летальность мышей, лишенных активности гена Snail может быть фактически обусловлена неспособностью мезодермальных клеток отделяться от первичной полоски. Наиболее строгим доказательством влияния этих факторов на образование нервного гребня является то, что ингибирование у Xenopus функции Slug на ранних стадиях предупреждает образование предшественников гребня, тогда как ингибирование на более поздних стадиях мешает эмиграции клеток (LaBonne and Bronner-Fraser, 2000). Способность отличать во времени эти два последовательных события делает аргументы неотразимыми. Aybar et al., (2003) разработали этот вопрос далее и недавно показали, что Snail также необходим для спецификации нервного гребня у Xenopus и, более того, способен индуцировать транскрипцию Slug, а также дополнительные специфичные для гребня маркёры как у целых эмбрионов, так и в анимальных шапочках в отсутствие сопровождающих структур. Кроме того, эффект доминантно негативного Snail может быть устаранён избыточной экспрессией Slug но не vice-versa. Вместе эти результаты подтверждают, что Snail расположен выше Slug в генетическом каскаде, ведущем к формированию клеток нервного гребня. В согласии с тем, что Slug является непосредственной мишенью передачи сигналов Wnt у Xenopus, регуляторная область промотора гена Slug была выделена и охарактеризована в отношении связывания Lef/β-catenin и продемонстрирована его необходимость для управления экспрессией в клетках нервного гребня (Vallin et al., 2001).

Помимо Slug, каскад Snail-индуцируемых генов представлен также Zic5, FoxD3, Twist и Ets1 (Aybar et al., 2003). В согласии с этим мнением, что эти гены также являются частью генетического репертуара по продукции клеток гребня, было продемонстрировано, что избыточная экспрессия Zic5 индуцирует маркеры нервного гребня за счёт эпидермальных, а эксперименты по потере функции подтвердили, что он необходим для этого процесса, но не для индукции передних нейральных маркеров, свойство общее у др. членов семейства Zic(Nakata et al., 2000). Неожиданно в отличие от Aybar et al., (2003), в данной работе сообщалось, что Zic5 индуцирует транскрипцию Snail и Slug у Xenopus и что доминантно негативная конструкция мешает экспрессии Slug (чего не отмечалось для Snail), указывая тем самым, что Zic5 расположен выше генов, которые рассматривались как самые ранние маркеры развития гребня.

Семейством транскрипционных факторов, которое, как было показано, играет важную роль в спецификации клеток и сегрегации клонов, является winged-helix или forkhead класс (Kaufmann and Knochel, 1996), недавно переименованных в Fox белки из-за forkhead box (Kaestner et al., 2000). Один из членов семейства был клонирован у кур, FoxD3, и было установлено, что он экспрессируется в нервных складках, а позднее в рано мигрирующих клетках нервного гребня (Kos et al., 2001, Dottori et al., 2001). Избыточная экспрессия в нервной трубке даёт расширяющийся HNK-1-позитивный домен и увеличение количества эмигрирующих клеток, это указывает на то, что FoxD3 склоняет нейроэпителиальных предшественников в направлении судьбы нервного гребня. В соответствии с этой возможностью Dottori et al., (2001) установили, что сопутствующее развитие интернейронов супрессируется. Внутри самого клона нервного гребня FoxD3, как было установлено, играет роль в балансе между детерминацией раннего (нейрального и глиального) и позднего (меланоциты) фенотипа в пользу первого (Kos et al., 2001). У Xenopus, FoxD3, который, как было предположено, является нижестоящим сигналом по отношению Snail и Slug (Aybar et al., 2003), как было установлено, действует как репрессор транскрипции, в свою очередь подавляя Slug а также Cadherin 11 , а также свою собственную экспрессию. Тем самым формирование нервного гребня редуцируется (Pohl and Knochel, 2001). Эти результаты трудно интерпретировать в свете позитивного эффекта Snail и Slug на образование нервного гребня и в свете своевременной экспрессии FoxD3 на презумптивной территории нервного гребня. Первоначальные исследования потери функции FoxD3 не выявили очевидных дефектов. Необходим анализ дополнительных мутаций в этом гене, т.к. одной из возможностей является то, что точная доза этого фактора необходима для баланса между первичными эффектами на развитие нервной пластинки vis-a-vis на границе нервной пластинки, ведущими к образованию гребня.

Это наблюдается также и в отношении др. транскрипционного фактора, Sox9, делеция которого, как было показано, вызывает тяжелые черепно-лицевые аномалии. Xenopus Sox9 экспрессируется матерински и накапливается сразу после гаструляции на боковых краях нервной пластинки, в области образования нервного гребня. На поздних стадиях он персистирует в мигрирующих клетках гребня в краниальных регионах, когда они занимают фарингеальные дуги. Истощение Sox9 с использованием антисмысловых morpholinos ведет к потере клеток нервного гребня, это также отражается в снижении транскрипции Slug и в компенсаторном расширении территории нервной пластинки (Spokony et al., 2002). Т.о., Sox9 может быть частью каскада, участвующего в развитии структур лица и черепа из нервного гребня.

Вместе с Sox9 транскрипционный фактор AP2 α также участвует в развитии краниальной части нервного гребня, т.к. генный таргетинг AP2 α у мышей приводит к тяжелым черепно-лицевым аномалиям (Schorle et al., 1996, Zhang et al., 1996). AP2 α обнаруживается у Xenopus ещё на стадии открытой нервной пластинки, когда его транскрипты обильны в основном в краниальной области, но обнаруживаются и в проспективном нервном гребне туловища. Подобно Sox9 и Slug, AP2 α также находится под позитивным контролем сигнальных путей Wnt и BMP и необходим для формирования нервного гребня. Снижение активности гена AP2 α редуцирует транскрипцию и Slug и Sox9, следовательно, позитивная петля обратной связи, как полагают, соединяет AP2 α, Slug и Sox9 и это может лежать в основе инициального образования, а позднее и поддержания фенотипа нервного гребня (Luo et al., 2003).

Итак, растут доказательства, подтверждающие участие множественных генов в образование на разных уровнях оси. Природа взаимодействий между этими генами ещё не установлена в общем контексте нейральной индукции, а также в контексте формирования и поддержания презумптивного нервного гребня. Различия между генетическими каскадами, ведущими к спецификации нервного гребня в голове по сравнению с туловищем уже очевидны в смысле ограниченной экспрессии определенных генов {напр., Noelin (Barenbaum et al., 2000) и Id2 (Martinsen and Bronner-Fraser, 1998)}. В этом отношении большинство исследований сконцентрировано на формировании нервного гребня в краниальной области.

Члены семейства Notch экспрессируются клетками нервного гребня грызунов (Weinmaster et al., 1991; Williams et al., 1995), а также гены Notch и Delta экспрессируются у птиц в краниальной части нервной пластинки и эпидермальной эктодерме (Endo et al., 2002), указывая тем самым, что они могут участвовать в образовании нервного гребня. В последних исследования было предположено, что умеренные уровни Notch необходимы для поддержания экспрессии BMP4 в эктодерме, это в свою очередь влияет на образование и/или поддержание фенотипа нервного гребня. У рыбок данио нарушение активности гена Delta вызывает снижение образования нервного гребня, но ведет к образованию добавочных Rohon-Beard нейронов, эффект, который, по-видимому, ограничен осью на уровне туловища (Cornell and Eisen, 2000). Сигналы Delta/Notch, по-видимому, не влияют непосредственно на спецификацию клеток нервного гребня, а скорее косвенно, путём регуляции уровней neurogenin 1, который экспрессируется в клетках Rohon-Beard и необходим для их дифференцировки (Cornell and Eisen, 2002 and see below). Следовательно, детерминация этих альтернативных судеб на границе нервной пластинки у рыбок данио нуждается в передаче сигналов Delta/Notch, которые действуют путем репрессии экспрессии пронейральных генов (Simpson, 1997; Blader et al., 1997, Ma et al., 1996).

Итак, передача сигналов BMP и Wnt/FGF обеспечивает инициальную экспрессию ранних маркёров нервного гребня, признака, который характеризует образование презумптивного нервного гребня на границе между нервной пластинкой и эктодермой, которая позднее станет дорзальной срединной линией в сомкнувшейся нервной трубке. В краниальных регионах оси у эмбрионов птиц эмиграция специфицированных клеток нервного гребня из нейрального примордия занимает приблизительно 10-15 ч. Однако, на уровне туловища процесс более продолжителен и продолжается в течение двух дней (Erickson et al., 1992, Reedy et al., 1998, Burstyn-Cohen and Kalcheim, unpublished data). Продолжительная эмиграция происходит в результате последовательных волн эмигрирующих клеток, которые достигают области сосредоточения между нервной трубкой и сомитами в течение 4-5 ч. после выделения слоя (Burstyn-Cohen and Kalcheim, 2002), а затем миграция продолжается вплоть до заполнения различных зачатков, производных нервного гребня, в вентральном и дорсальном направлении (rev. Le Douarin and Kalcheim, 1999). Более того, клетки нервного гребня в туловище вычленяются синхронным образом из нервной трубки, когда они вступают в S фазу клеточного цикла (Burstyn-Cohen and Kalcheim, 2002 and see next section). С точки зрения непрерывной эмиграции клеток нервного гребня из своего источника возникает вопрос о механизмах, ответственных за восполнение дорсального пула премиграторных клеток. Одна из возможностей заключается в том, что после инициальной спецификации возникает локальная популяция стволовых клеток нервного гребня в дорсальной срединной линии, которая затем прогрессивно подвергается асимметричным клеточным делениям, дающим две дочерние клетки, базальную и апикальную. В таком случае, после завершения митоза базальная дочерняя клетки будут вычленяться после перехода из G1 в S, тогда как апикальная клетка будет продолжать циклы делений внутри эпителия как стволовая клетка, снова давая одну отделяющуюся и одну резидентную подобную стволовой клетку, соотв. Такой механизм кажется маловероятным по нескольким причинам. Во-первых, после начала вычленения пропорция клеток в дорсальной срединной линии, синтезирующих ДНК, низка (примерно 25%) по сравнению с соотв. значениями в вычленившихся клетках (80-85%), указывая тем самым, что этот механизм д. вызывать очень быстрое истощение пула предполагаемых стволовых клеток в области дорсальной срединной линии, если это единственный источник нервного гребня. Более того, это не согласуется с наблюдениями, что вычленение всё ещё продолжается на стадиях HH18-20 в туловище (Erickson et al., 1992, Reedy et al., 1998). Во-вторых, несмотря на наблюдение как вертикальных, так и горизонтальных плоскостей деления в дорсальной срединной линии (our unpublished observations, see also Erickson, 1993), нет доказательств асимметричных клеточных делений в этой области.

Альтернативным источником премиграторных клеток нервного гребня могут быть, следовательно, соседние клетки дорсо-латаральной части нервной трубки. Возможно, что после непрерывного исхода клеток из области срединной линии, латерально локализованные предшественники направляются к центру, вступая тем самым в зону экспрессии BMP4, что запускает их отделение (delamination) (Sela-Donenfeld and Kalcheim, 1999) после G1/S перехода (Burstyn-Cohen and Kalcheim, 2002). Т.о., две основные модели вместе могли бы объяснить спецификацию премиграторного пула клеток нервного гребня во времени; ранним и вообще одиночным индуктивным событием является то, которое ведет к образованию клеток, сходных со стволовыми, в сравнении с непрерывной продукцией с помощью ре-локализации соседних нейроэпителиальных клеток а поле дорсальной срединной линии. Последнее д. наделять проходящие транзитом клетки свойствами клеток нервного гребня путем запуска их вычленения (delamination). Такое мнение возможно согласуется с результатами клонального анализа in vivo, который показал существование общих предшественников как для фенотипов нервной трубки, таки и нервного гребня (Mujtaba et al., 1998; Sanes, 1989; Bronner-Fraser and Fraser, 1988, 1989, Artinger et al., 1995) , это делает возможным изменения в судьбе за счет ре-локализации. Выбор между этими выше представленными возможностями может быть фундаментальным для понимания значения в дорсальной срединной линии передачи сигналов факторов BMP и Wnt для поддержания фенотипа нервного гребня вплоть до истощения этих клеток и последующей дифференцировки дорсальных предшественников в спиналные интернейроны, значения механизмов, ведущих к сегрегации клеток нервного гребня от др. клонов ЦНС, и динамики гистогенеза дорсального нейрального примордия.

Из исследований последних двух дестилетий стало ясно, что уже в начале эмиграции из нервной трубки нервный гребень состоит из гетерогенных популяций клеток, некоторые из которых плюрипотентны, а др. уже ограничены в разной степени в своём потенциале развития, включая предшественников, детерминированных к одной определенной судьбе. Эти результаты указывают на то, что средовые сигналы, встречающиеся во время миграции и в месте предназначения, скорее всего оперируют с помощью инструктивного и пермиссивного механизмов, направленных на клети мишени, с разной степенью ограничения потенциала развития.

Neurons versus glia: the role of Notch/Delta
Клетки нервного гребня дают нейроны и глию в периферических ганглиях на уровне туловища. Отметим, что эти два типа клеток генерируются последовательно, так что нейрональная дифференцировка предшествует дифференцировке глии. Т.к. передача сигналов Notch ингибирует нейрональную дифференцировку у позвоночных и беспозвоночных (Coffman et al., 1993, Fortini et al., 1993, Henrique et al., 1997), отметим, что было установлено, что Notch лиганды также вовлечены во взаимодействия, которые ограничивают судьбу клеток, производных нервного гребня. В ганглиях дорсальных корешков птиц Delta 1 экспрессируется в молодых нейронах, а активация Notch1 в культурах нервного гребня предупреждает дифференцировку нейронов , разрешая тем самым дифференцировку глиальных клеток (Wakamatsu et al., 2000). Сходным образом, Morrison et al., (2000) изолировали мультипотентных предшественников из эмбрионального sciatic нерва крыс и культивировали их в клональных условиях. Временная активация Notch в этих клональных кульурах была достаточной, чтобы вызвать потерю нейрогенного потенциала, что сопровождалось ускоренной дифференцировкой глии. Все эти результаты указывают на то, что межклеточные взаимодействия, обеспечиваемые с помощью активности Notch/Delta играют роль в сегрегации нейронального или глиального клонов. Доказательства in vivo такого переключения всё ещё отсутствуют. Важно также выяснить возможные взаимоотношения между Notch/Delta и факторами роста, участвующими в глиальной дифференцировке, таких как Neuregulins (Morrison et al., 2000 and Wakamatsu et al., 2000).

Sensory versus autonomic fates: the roles of Neurogenin genes in sensory specification
Ещё одной проблемой является спецификация сенсорного и автономного клонов, дыух крупных типов нейронов периферической нервной системы. На эмбрионах птиц было установлено, что клетки, производные нервного гребня способны давать автономные, но не сенсорные производные. Клональный анализ in vivo и in vitro идентифицировал индивидуальных предшественников, которые давали оба класса нейронов (rev. Le Douarin and Kalcheim,1999; Weston,1998).

Клонирование гомологов пронейральных генов Drosophila у разных видов позвоночных предоставило уникальный инструмент для выяснения молекулярной основы сегрегации сенсорного и аутономного клонов. Neurogenins являются специфичными bHLH транскрипционными факторами, родственными Drosophila atonal (Gradwohl et al., 1996; Ma et al., 1996; McCormick et al., 1996; Sommer et al., 1996). Neurogenin как было установлено, предшествует экспрессии NeuroD. Избыточная экспрессия Neurogenin у эмбрионов Xenopus стимулирует эктопический нейрогенез и индуцирует транскрипцию NeuroD (Ma et al., 1996). Эти результаты помещают Neurogenin выше NeuroD и указывают на то, что первый является геном нейрональной детерминации, тогда как NeuroD скорее всего действует на клеточную дифференцировку. Эксперименты с потерей функции проводили на мышах, у которых были делетированы гены Neurogenins 1 и 2. Эмбрионы, лишенные функции Neurogenin 1, не способны генерировать проксимальные краниальные сенсорные ганглии, которые представляют trigeminal, vestibulo-cochlear, accesory, jugular и superior ганглии (Ma et al., 1998). Комплементарно этому фенотипу, делеция Neurogenin 2 дает в результате элиминацию дистальных краниальных ганглиев, включая geniculate и petrosal без существенного эффекта на проксимальные ганглии (Fode et al., 1998). Отметим, что nodose ганглий, который экспрессирует оба Neurogenins бывает пощажен у одиночных мутантов любого типа, указывая тем самым на взаимную компенсацию обоих генов (Fode et al., 1998). Все эти результаты демонстрируют потребность в Neurogenins для развития краниальных сенсорных ганглиев, происходящих или из нервного гребня или эктодермальных плакод или обоих. Встаёт также вопрос о роли Neurogenins в ганглиях дорсальных корешков. Сообщалось, что Neurogenin 2 в первую очередь необходим для генерации проприоцептивных и механоцептивных нейронов, которые экспрессируют trkC+ и trkB+ , тогда как trkA+ nociceptive афферентные нейроны зависят от функции Neurogenin 1 (Ma et al., 1999). Интересно, что отслеживание судьбы клонов клеток нервного гребня мышей выявило, что Neurogenin 2-экспрессирующие предшественники были в 4 раза более склонны, чем генеральная популяция нервного гребня, вносить вклад в клетки ганглиев дорсальных корешков или в нейрональные или глиальные типы, если сравнивать с симпатическими ганглиями (Zirlinger et al., 2002). Эти данные д. указывать на то, что экспрессия и функция этих генов ассоциирована, по крайней мере, со склонностью к сенсорному фенотипу. Дальнейшие доказательства в подтверждение существования специфицированных сенсорных предшественников в нервном гребне млекопитающих получены благодаря наблюдению, что экспрессия Neurogenins, NeuroD и дополнительных сенсорных маркеров не может быть ревертирована в субнаборе культивируемых клеток нервного гребня, даже когда добавляется BMP2, фактор, который индуцирует признаки автономной системы (Greenwood et al., 1999). Это не было подтверждено на эмбрионах птиц, у которых Neurogenins маркируют субнаборы вентрально мигрирующих клеток нервного гребня. Эктопическая экспрессия этих генов склоняет клетки нервного гребня локализоваться в сенсорных ганглиях и даже индуцирует экспрессию сенсорных маркеров в инфицированной мезодермальной ткани, такой как дермомиотом (Perez et al., 1999). Сходные результаты были получены на рыбках данио, где все периферические сенсорные нейроны зависели от функции Neurogenin 1 (Cornell and Eisen, 2002). Итак, строгие доказательства подчеркивают функцию Neurogenins по спецификации сенсорной судьбы. Ранняя экспрессия этих генов в субнаборах мигрирующих предшественников также подтверждает, что эти особые клетки могут быть уже сегрегированными от генеральной популяции, чтобы давать сенсорные скорее, чем автономные производные. Передача сигналов Wnt, действующая посредством β-catenin и возможно оперирующая уже в премиграторных клетках нервного гребня в дорсальной части нервной трубки, как сообщалось действует иерархически выше Neurogenin каскада, чтобы индуцировать сенсорный фенотип у эмбрионов мышей (Hari et al., 2002, Lee et al., 2004).