Посещений:
Нуклеация Актиновых Филамент

Роль Форминов

Formin-induced nucleation of actin filaments
Sally H Zigmond (szigmond@sas.upenn.edu)
Current Opinion in Cell Biology
Volume 16, Issue 1 , February 2004, Pages 99-105

Formins are proteins best defined by the presence of the unique, highly conserved formin homology domain 2 (FH2). FH2 is necessary and sufficient to nucleate an actin filament in vitro. The FH2 domain also binds to the filament’s barbed end, modulating its elongation and protecting it from capping proteins. FH2 itself appears to be a processive cap that walks with the barbed end as it elongates.
Formins названы по мышиному гену limb deformity (ld), первому идентифицированному гену formin. Затем были идентифицированы многие гены, содержащие уникальный, высоко законсервированный formin homology domain 2 (FH2) [1]. Недавний интерес к форминам возник в результате трёх ключевых находок. Первой находкой явилось то, что индукция актиновых стрессовых волокон с помощью Rho нуждается в formin, mDia1 [2]. Во-вторых, определенный актин-содержащие структуры у дрожжей развиваются независимо от Arp2/3, но нуждаются в formin [3-5]. В-третьих, актиновые зарождаются (nucleated) при инкубации G-actin с форминовыми FH2 доменами [6-9]. Очевидно, что формины, также как и Arp2/3, м. инициировать (nucleate) филаменты in vivo, но филаменты обслуживают разные структуры. Удивительно, как формины, которые не содержат родственных актину белков, способны nucleate филаменты. Более того, как регулируется активность форминов, чтобы продуцировать филаменты в соответствующие время и место? Наконец, почему клетки нуждаются в двух nucleators?
Подробнее о структуре, функции и регуляции форминов см. [1,10-12]. Здесь будут рассмотрены новые эксперименты по FH2-индуцированной nucleation и FH2 связи с колючими концами филамент, по модуляции их элонгации и защите от др. capping белков. FH2 сам по себе, по-видимому, является поступательной (processive) шапочкой (cap), которая путешествует с колючим концом, когда он удлиняется. Т.к. FH2 домен сильно законсервирован, то его эффекты на актин, по-видимому, вносят вклад in vivo во многие formin-зависимые структуры, включая борозду дробления, актиновые кабели и стрессовые волокна. Здесь я предполагаю, что филаменты нуклеируемые форминами, выполняют отличные механические функции, по сравнению с нуклеируемыми с помощью комплекса Arp2/3 complex: formin-nucleated филаменты м. поддерживать напряжение для сокращения, тогда как Arp2/3-nucleated филаменты м. поддерживать сжатие для выпячиваний.

Structure, localization and regulation of formins


Formins являются мультидоменовыми белками, определяемыми по сильно законсервированным FH2 доменам (Рис. 1) [1]. FH2 домен у Bni1, когда он кристаллизован, формирует димер и формирует несколько более длинную версию в растворе, тетрамер (M Eck, personal communication [9,13]. При инкубации in vitro с чистым актином, FH2 оказывается необходимым и достаточным дл нуклеации актина [6-9]. FH2 домен обычно фланкирован на N-терминальной стороне FH1 доменом. Последний является богатым пролином и связывает profilin, SH3 домены (включая те, что в Src семействе, IRSp53, и DIP) и WW домены [12,14-17]. Область FH1-FH2, если экспрессируется в клетке, то функционирует как конституитивно активный формин.



Figure 1. Activation of Diaphanous-related formin by Rho-GTPase. Diagram of domains present in Diaphanous-related proteins, illustrating the conformation change that occurs upon binding Rho-GTP.

Функция формина регулируется факторами, которые соединяются с дополнительными доменами. Напр., в formins, родственных Diaphanous, Rho GTPase соединяется с N-терминальным GTPase binding domain (GBD). Это соединение редуцирует ингибирующее взаимодействие между GBD и C-терминальным DAD (Diaphanous autoregulatory domain) [1,9,10,18]. Делеция или GBD или DAD даёт конституитивно активный формин [2,14,18]. Специальная Rho GTPase, которая активирует Diaphanous-related формины, варьирует [2,19-23]. Некоторые формины лишены распознаваемого GBD и их регуляция остаётся неясной [1,10].
Локализация формина в клетке зависит от дополнительных доменов. N-терминальные домены, такие как FH3 [10] и PDZ закрепляют некоторые формины на субклеточных структурах; напр., PDZ домен закрепляет delphilin на пост-синаптической мембране клеток Пуркинье [24]. Растительные формины м.б. подразделены на два подсемейства, определяемые по присутствию или отсутствию N-терминального трансмембранного домена [25]. В некоторых случаях активация формина является результатом ассоциации формина с индуцированными филаментами [22].
Зависимые от формина функции варьируют у разных организмов и в разных типах клеток. В большинстве клеток они вносят вклад в полярность и цитокинез [26-29]. У дрожжей контрактильное кольцо и актиновые кабели формируются независимо от Arp2/3, но нуждаются в форминах. Эти кабели прикрепляются к определенным местам (напр., к кончику или шейке почки (bud) и служат в качестве скоростных трасс для миозином-обеспечиваемого транспорта пузырьков и др. органелл к этим местам.
Геном млекопитающих содержит , по крайней мере, 9 генов формина [9], a некоторые экспрессируют множественные сплайс-варианты [14,30]. Стрессовые волокна, индуцируемые с помощью Rho, нуждаются в Rho-kinase, а также в формине - mDia1 или mDia2 [2]. Волокна, индуцированные экспериментально прикладываемым натяжением, нуждаются в mDia1, но не в Rho-kinase [31]. Различные формины участвуют в клеточных движениях [32,33], в формировании филоподий [21], эндоцитозе, перемещении эндосом [14], движении мейотического веретена [34] ив фокальных контактах [31], a также в сигнальных путях, активируемых с помощью Rho [35], Src [15,36], Wnt [16], insulin [30] и сыворотки [37].
Некоторые факторы осложняют выполнение функции форминами in vivo. Во-первых, многие клетки экспрессируют множественные формины с перекрывающимися функциями. Напр., у Saccharomyces cerevisiae, формин Bni1p обычно продуцирует актиновые кабели, но в его отсутствие др. формин, Brn1p, м. оказаться достаточным [20.o]. В клетках млекопитающих стрессовые волокна м.б. индуцированы или с помощью Rho's активации mDia1 или mDia2 или с помощью Rac's активации третьего формина, FHOD1 [2,22,33]. Во-вторых, разные члены семейства Rho м. влиять на данный формин. Т.о., хотя Rho3 и является преимущественным активатором Bni1p, но и Rho4 м. активировать его достаточно, чтобы поддержать жизнеспособность так, как м. избыточно экспрессируемый Cdc42 [20]. Наконец, потеря или избыток формина вызывают множественные вторичные эффекты [21]: formin-индуцированная полимеризация актина затрагивает экспрессию генов [37]; formin-индуцированные филаменты обеспечивают контракцию стрессовых волокон, которые в свою очередь м. затрагивать фокальные контакты и распределение микротрубочек [31]; а некоторые формины м. менять уровень активных Rho, это в свою очередь м. влиять на Rac и множественные нижестоящие мишени для этих Rho GTPases [38].

FH2 mediates actin nucleation


FH2 необходим и достаточен для нуклеации [6,9]. Механизм, по-видимому, участие в стабилизации димеров (Рис. 2) [8,9]. Это контрастирует со спонтанной нуклеацией, при которой первыми промежуточными образованиями, которые м. удлиняться подобно колючим концам, являются тримеры. Т.к. FH2 домены сами по себе олигомеризуются [9,13], две молекулы FH2, по-видимому, стабилизируют актиновый димер. FH2-actin комплекс из димеров м. возникать за счёт захвата FH2 димеров предварительно сформированных актиновых димеров или за счёт последовательного связывания двух актиновых мономеров. Т.к. концентрация свободного G-актина в цитоплазме низка (~0.5 μM), а актиновые димеры очень нестабильны, то концентрация спонтанно образующихся димеров чрезвычайно мала [40]. Поэтому наиболее вероятным механизмом является последовательное связывание мономеров [39].



Figure 2. Diagram of the FH2-induced nucleation mechanism. In this diagram FH2 is illustrated as a dimer that sequentially binds to G-actins to form the stabilized dimer. The stabilized dimer has an affinity for G-actin similar to that of a filament barbed end (Kd ~0.1 uM).

Сродство FH2 к G-actin и сродство formin-actin комплекса к дополнительному актину оба низки (<5 μM), так что FH2-индуцированная нуклеация в 0.5 μM G-actin очень медленна. Однако, in vivo, formin-индуцированные филаменты оборачиваются очень быстро [27], подтверждая, что дополнительные факторы ускоряют нуклеацию. Profilin является существенным кофактором in vivo для многих formin-зависимых функций [26,28]. Profilin соединяется in vitro с FH1, позволяя profilin-actin быть субстратом для нуклеации, хотя он и менее эффективен при законной (enabling) нуклеации, чем свободный G-actin [9,39,41.]. In vivo, profilin-actin присутствует в значительно более высоких концентрациях, чем свободный G-actin [42], и , следовательно, возможно, что он является преимущественным субстратом для нуклеации. Более того, высокое соотношение profilin-actin к свободному G-actin указывает, что profilin-actin объясняет большую часть элонгации. Для филамент, индуцированных с помощью Cdc12, profilin-actin's вклад даже более выражен, т.к. Cdc12 тяжело ингибирует элонгацию с помощью свободного G-actin, но не с помощью profilin-actin [8].
Др. факторы м. увеличивать сродство форминов к G-actin и/или высвобождать G-actin для formin точно также как VCA (C-конец Wiscott-Aldrich syndrome protein, WASP) высвобождающий G-actin для Arp2/3. Участниками нуклеации м.б. следующие факторы: Bud6p/Aip3p, дрожжевой взаимодействующий с актином белок [43]; VASP, который необходим для mDia-индуцированного увеличения F-actin [44]; DIP (Diaphanous interacting protein) и компоненты Src и Wnt сигнальных путей, которые соединяются с FH1 [36]; Rac, соединяется частично с FH1 формина FHOD1; и фактор элонгации 1α, который соединяется с доменом между FH1 и FH2 [1,45].

FH2 caps the barbed end and protects it from capping by capZ homologues


In vitro домен FH2 Bni1 соединяется избирательно с колючим концом. Это не объясняется фактом, что актиновые субъединицы на полимеризующемся колючем конце содержат ATP или ADP-Pi, т.к. формин также частично ингибирует деполимеризацию, когда актиновые субъединицы содержат ADP [9,39]. Кажется, что FH2 предпочитает связывающую поверхность только доступную на колючем конце.
FH2 на колючем конце ингибирует скорость и полимеризации и деполимеризации. Это ингибирование является лишь частичным, даже когда концентрация FH2 достаточно высока, чтобы насытить все колючие концы [6,9,39]. T.о., FH2 не является слабым ловцом (capper) (т.к. соединяется с низким сродством, но если соединится, то тотально ингибирует динамику колючих концов); скорее он криворукий ('leaky') ловец, допускающий полимеризацию, даже когда связан с концом [6,9,39]. Разные формины ингибируют элонгацию в разной степени. Напр., элонгация колючего конца с G-actin ингибируется ~50% с помощью Bni1p-FH2 [6] и ~90% с помощью Cdc12p-FH2. Однако, если присутствует FH1 домен, то элонгация с profilin-actin всё ещё ингибируется ~50% с помощью Bni1p, но не ингибируется с помощью Cdc12 [8] (Рис. 3 и Рис. 4). Ещё большая неожиданность, profilin облегчает ингибирование с помощью Cdc12p деполимеризации колючих концов (Рис. 4). Как profilin облегчает ингибирование остаётся неясным, но механизм не полностью удаляет Cdc12 с колючего конца, т.к отжиг филамент остаётся блокированным [8].



Figure 3. Diagram showing properties of the Bni1pFH1FH2 barbed-end leaky cap. Bni1pFH1FH2 slows elongation but protects the barbed end from capping. Each panel 2 represents a later time point relative to panel 1. (a) Normal elongation with G-actin in the absence of capping protein or Bni1pFH1FH2. (b) Capping protein is a 'tight capper' that allows no elongation when bound. (c) Bni1pFH1FH2 is shown as a dimer that partially inhibits elongation by G-actin (and by profilin-actin, not shown), acting as a 'leaky cap'. (d) Bni1pFH1FH2 at the barbed end protects that end from capping protein, allowing elongation even in the presence of capping protein.

FH2 на колючем конце конкурирует с capping белками высокого сродства, такими как capZ гомологи и gelsolin [13]. В устойчивом состоянии, фракция концов, связанная с каждым capper, д. зависеть от относительной концентрации сродства capper's; тогда в массе цитоплазмы ловцы с очень высоким сродством м. превалировать. Однако, формины м. доминировать в местах, где они находятся в высокой концентрации; напр., Bni1p концентрируется на высоком уровне в кончиках почек дрожжевых клеток. Во всяком случае, т.к. филаменты нуклеируются с помощью формина, то остаётся предположить, что формин на этих колючих концах остаётся в течение некоторого времени, пока продолжается элонгация, более продолжительное, чем на свободных колючих концах. Это вносит вклад в способность форминов увеличивать уровень F-actin.

How does a leaky cap work?


Leaky cap, продуцируемая с помощью FH2 (Bni1p) м. поддерживаться, даже тогда, когда филаменты удлиняются на >30 мономеров в секунду. Это не возможно объяснить высокой скоростью FH2's 'on' и 'off' на колючем конце [13,46]; скорее всего FH2 является поступательной (processive) шапочкой (cap), которая перемещается вместе с концом по мере его удлинения (Рис. 3 и Рис. 4; см. также анимацию в [13.o]). Это действие, по-видимому, зависит от способности FH2' димеризоваться или мультимеризоваться [9,13]. Как только колючий конец присоединяет следующий мономер, то актин, который связан с FH2 переходит из 'конца' во 'внутреннюю' позицию, это снижает его сродство к FH2. В результате этого FH2 высвобождается, второй FH2 остаётся прикрепленным к филаменте, это позволяет свободному FH2 снова присоединиться к новому концу. Так как 'перемещение' является эффективным благодаря внутренней перестройке существующего молекулярного комплекса, то скорость его 'вкл' не зависит от общей массы диффузии жидкости; это д.б. кинетика первого порядка без теоретических ограничений.

Actin nucleation can explain most formin functions in vivo


Свойства фрагмента FH1-FH2 in vitro, по-видимому, объясняют функции формина in vivo. Лучше всего изучен дрожжевой формин Bni1p, который, по-видимому, одновременно нуклеирует филаменты и закрепляет их колючие концы на верхушке почки. Такие закрепленные филаменты все ещё удлиняются со скоростью ~100 мономеров в секунду за счёт вставки актиновых мономеров на верхушке почки [13,47]. Продуцируемые подобным образом актиновые кабели, связанные с помощью tropomyosin и поперечно связанные с помощью fimbrin, участвуют в поляризованном транспорте пузырьков в направлении почки, в позиционировании ядра и ориентации веретена [4,5,10,27-29,48-51]. Сходным образом, в клетках млекопитающих формином вызванная нуклеация, индуцированная с помощью Rho, объясняет in vivo перестройку форминов для образования стрессовых волокон [26,52]. Формином вызванная нуклеация, по-видимому, необходима для образования контрактильного кольца у большинства видов. Более того, имеются доказательства на Drosophila и дрожжах, что регуляторы Rho предопределяют и время и положение цитокинеза [28,53,54]. Наконец, в клетках млекопитающих и др., зависимые от формина функции, включая элонгацию клеток, расположение микротрубочек и созревание фокальных контактов, м. зависеть от индукции стрессовых волокон с помощью Diaphanous [31,55].
Др. формин-зависимые функции, хотя и менее изучены, в основном связаны с F-actin: эти функции включают образование слипчивых соединений между эпителиальными клетками [56], независимое от микротрубочек движение мейотических хромосом [34], миграция клеток [33], перемещение ранних эндосом вдоль актиновых филамент [14], и образование филоподий, микрошипов и ламеллиподий [21,33]. Даже активация serum response factor [15,36,37] нуждается в формином-индуцированной полимеризации актина. Помимо этого формины служат адапторами при сборке различных сигнальных белков [10]. Некоторые функции, приписываемые определенным форминам скорее всего неправильны [10]. Сюда входит следующее: DFNA1 в образовании стереоцилий (т.к. глухота не является врожденной, а скорее возникает из-за эндолимфатической водянки в детстве [57]); hDia в образовании акросом спермиев (компонент спермиев, взаимодействующий с hDia является внеклеточным [58]); и Formin1 в деформации конечностей (дефект скорее всего обусловлен мутацией в gremlin [59.]). Конечно, формины м. также иметь нижестоящие эффекторы и помимо актина.
В некоторых случаях формины локализуются специфически по отношению к местам своего действия. Так, в почкующихся дрожжах формин концентрируется на верхушке почки (Bni1p) и в шейке почки (Bnr1p), и оба Bni1p и Bnr1p концентрируются в контрактильном кольце [10,26,52]. В клетках млекопитающих формины концентрируются в борозде деления, где их функция очевидна. С др. стороны, они обнаруживаются также на поверхности мембран, эндосом, фагоцитических бокалов, в центрах, организующих микротрубочки, в митотических веретенах и в midbodies, где их функция не столь очевидна [14,21,60,61]. Не всё ясно, как сконцентрированный формин активируется. Так в случае индуцированных стрессовых волокон mDia1 не обнаруживает заметной локализации с ними [2,31], возможно из-за того, что активный mDia1 является небольшой фракцией от общего. FHOD1, который также вызывает стрессовые волокна, локализуется с ними, но только когда активирует [22,33].

Why two nucleators?


Комплекс Arp2/3 и формины нуклеируют актиновые филаменты, но их отличающиеся механизмы генерируют разные паттерны. Arp2/3 активируется с помощью существующих филамент, чтобы нуклеировать веточки от родительской филаменты, при этом Arp2/3 находится в точке ответвления. Это создаёт дендритную сеть филамент. Формины нуклеируют только из мономеров и это даёт прямые филаменты. Нуклеированные формином филаменты in vivo часто связаны в пучки, потому, что веточки, создаваемые с помощью Arp2/3 отсутствуют, Arp2/3-нуклеированные филаменты также становятся собранными в пучки. Т.о., собранные в пучки филаменты м. возникать в результате обоих механизмов.
Актиновые филаменты, нуклеированные с помощью Arp2/3 и форминов, также м. служить разным механизмам в клеточном движении. Во-первых, имеются клеточные выпячивания, которые управляются с помощью полимеризации актина. Филаменты наталкиваются на клеточную поверхность, когда они удлиняются. Этот механизм, который также движет определенные внутриклеточные пузырьки и патогены, обеспечивается с помощью Arp2/3, чья дендритная сеть, по-видимому, оптимизирована для удлинения, чтобы создавать силу выпячивания [62].
Вторым механизмом является контракция, которая управляется с помощью движений миозина вдоль актиновых филамент. Контракция (а также транспорт, усиленный с помощью миозина) использует формином индуцированные актиновые структуры, такие как стрессовые волокна, контрактильные кольца и дрожжевые кабели [50]. Филаменты в этих структурах покрыты tropomyosin, который усиливает их силу растяжения [63]. Более того, их колючие концы соединяются во время нуклеации с помощью формина, которые, в свою очередь, м.б. закреплены акцессорными белками на определенных местах (напр., в почке). Т.о., усиленные и закрепленные новые филаменты м. вызывать натяжение во время контракции. В согласии с этим общее подразделение работ, Rac и Cdc42 вносят вклад в образование выпячиваний в виде ламеллиподий и филоподий путём активирования (посредством семейства WASP) Arp2/3, тогда как Rho обеспечивает контракцию и транспорт с помощью активации форминов и миозина. С помощью независимой активации формины нуклеируют актин, а миозин обеспечивает контракцию, a Rho координирует и сборку и функцию контрактильных структур [35].
Выпячивающиеся структуры, такие как ламмелиподии содержат формины, а также ожидаемый Arp2/3 [31,64]. Это м. указывать на то, что формины участвуют в образовании выпячиваний. Возможно, что выпячивающиеся структуры м.б. контрактильными; тогда миозин м. обеспечивать движение в тыл ламеллярного F-actin, a работающие филоподии м. обеспечивать, последующее прикрепление, и подтягивание клетки вперед [21,65-67]. Т.о., филаменты, нуклеируемые с помощью Arp2/3 и форминов, м. служить разным механическим функциям.
Будучи полимеризованными актиновые филаменты, продуцированные с помощью любого пути, идентичны. Следовательно, их функции м. сдвигаться и сливаться. Филаменты, нуклерованные с помощью Arp2/3 в конечном итоге покрываются тропомиозином, поперечно связываются и перестраиваются с помощью котрактильных сил для образования актиновых дуг. Напротив, актиновые филаменты. нуклеированные с помощью форминов, м.б. организованы в пучки и поддержаны поперечными линкерами, чтобы обеспечить протрузию, возможно внося вклад в движение актиновых кабелей или филопоидных выпячиваний [21,47]. Выполняется ли предполагаемая дихотомия и участвуют ли дополнительные nucleators покажут дальнейшие исследования. Было бы интересно, выяснить, как актиновые филамент нуклеируются в структурах, где они осуществляют скелетную поддержку скорее, чем движение, напр., в кишечных микроворсинках, слуховых волосковых клетках и в щетинках у Drosophila.

Conclusions and future directions


Currently formins fit a simple conceptual model: they are activated, often downstream of a Rho GTPase, to nucleate actin filaments anchored at the barbed end. Formin-induced filaments appear to serve a different mechanical function from Arp2/3-nucleated filaments. Whereas the Arp2/3-induced dendritic network is optimized for protrusion, formin-induced filaments function with myosin (independently activated by Rho) to support contraction and organelle transport. Many cell features, including polarity, focal contacts, microtubule distribution and vesicle trafficking, may depend on this basic formin function.

How general is this model? The formin family, being large and complicated, is only partially understood. Our best understanding of in vivo function rests on genetic experiments in yeast, where both Arp2/3 components and formins can be deleted and replaced by recombinant constructs. Initial genetic experiments in C. elegans and Drosophila are also informative but in mammalian cells the tools for dissecting formin and Arp2/3 function are limited. Most mammalian studies demonstrate that an active formin can replace a particular agonist (e.g. Rho, serum) in a signaling pathway. However, the RNAi and knockout experiments that are starting to be carried out will provide new insights [21]. FRET studies will also help monitor the activation of formins and Arp2/3 as well as their interactions with other proteins [21]. Biochemical studies are needed to characterize in vitro the properties of the whole protein, including its structure and its interactions with other proteins.

Сайт создан в системе uCoz