Эукариотические клетки выделяют и организуют специфические молекулы, которые выполняют специфические функции в органеллах. Органеллы - напр., ядро, endoplasmic reticulum (ER) и комплекс Гольджи - являются динамическими связанными с мембранами компартментами, которые имеют определенные структуры и функции. Пузырьки и трубочки транспортируют белки и липиды между органеллами, это приводит в результате к тому, что органеллы имеют постоянно меняющийся молекулярный состав. Липидные бислои формируют барьер между просветом органелл и цитоплазмой и эти бислои содержат множество трансмембранных белков, которые могут взаимодействовать с компонентами цитоскелета и сигнальными путями. Органеллы состоят из молекул, которые присутствуют почти всё время ('resident' молекулы), молекулы, которые находятся транзитом и молекулы, которые временно взаимодействуют с органеллой, чтобы вополянть определенные функции. Подходы к идентификации и вычленению всех этих молекул д. предоставить данные, необходимые для понимания функции органелл.

В пост-геномную эру крупно-масштабные протеомные технологии и инструменты делают исследования в масштабах органелл выполнимыми и становятся мощными методами для изучения органелл, их компонентов и динамики^1-5. Исторически присутствие бислоев ограничивает технологии белковой химии, которые могут быть приложимы, но появляются новые стратегии для идентификации и характеристики белков интегральных мембран^6-8. Эти методы и стратегии создают предпосылки для полной характеристики разных типов трансмембранных белков, включая получение информации о белковых доменах и пост-трансляционных модификациях⁷. Комбинирование исследований крупно-масштабной протеомики с традиционными техниками клеточной биологии создаёт стратегию для функциональной характеристики органелл и молекул, с помощью которых они взаимодействуют с цитоплазмой, напр., молекулами сигнальных путей⁹.

протеомные исследования органелл начинались с выделения с помощью классических техник клеточной биологии (Box 1) обогащенных фракций, которые содержали интересующие органеллы. Это позволило идентифицировать белки, которые выделялись с органеллами с помощью протеомных техник (Boxes 2,3). Имеется 5 важных предостережений относительно этого анализа. Во-первых, степень обогащения может варьировать и молекулы, которые не являются bona fide компонентами органелл могут присутствовать в фракции и и быть идентифицированы как участники протеома (Box 4). Во-вторых, упомянутый выше состав органелл всегда меняется, т.к. молекулы высвобождаются и транспортируются из органелл с помощью пузырьков и трубочек. Эта доставка обеспечивается компонентами цитоскелета - actin, tubulin и промежуточными филаментами - а также моторными и акцессорными молекулами, которые функционируют с каждым из цитоскелетных компонентов. Эти компоненты могут выделяться, а могут и не выделяться вместе с органеллами, это даёт в результате варьирующие, редко логические данные, которые могут использоваться для классификации этих молекул, когда они идентифицируются с помощью протеомных исследований. В-третьих, многие молекулы в цитоплазме взаимодействуют с органеллами, выполняющими определенные функции, особенно сигнальные молекулы, которые специфически активируются гормонами, ростовыми факторами и др. сигналами. В этом случае, будут ли такие молекулы ассоциировать со специфическими органеллами, зависит от предыдущей истории клеток. В-четвертых, состав органелл из разных клеток и разных тканей варьирует. И, наконец, многие белки в органеллах, а также трансмембранные белки и цитоплазматические белки, которые ассоциированы с органеллами, модифицируются пост-трансляционно. Понимание таких пост-трансляционных модификаций является первостепенным для выячснения их функций. Хотя сегодня имеется множество методов для изучения пост-трансляционных модификаций, исчерпывающие методы для выяснения всех пост-трансляционных модификаций требуют много времени и, по-видимому, никогда не станут исчерпывающими.

Анализ органелл с использованием методов протеомики является активным полем деятельности, где достигнут существенный прогресс в определении протеомов органелл. Опубликовано достаточно большое количество протеомных исследований органелл после первоначального 'shock and awe', которые окружали протеомные технологии.

Органеллы и др. крупные клеточные структуры были проанализированы с использованием протеомных технологий (Box 5). Однако, не было предпринято системных или организованных усилий, чтобы охарактеризовать субклеточный протеом определенных клеток. Скорее использовался не исчерпывающий анализ одного типа клеток, а были выбраны типы клеток, организмы, исходя из интересов исследований, удобства приготовления выборок и их отношения к болезням.

Exosomes. Многие из пузырьков, которые транспортируют липиды и белки в клетках, были изучены с использованием различных протеомных подходов. EXOSOMES (Box 5) являются пузырьками, которые выделяются во внеклеточную среду, когда мультивезикулярные эндосомы сливаются с плазматической мембраной. Недавние исследования изучали роль экзосом в иммунной реакции^10-13, это привело к гипотезе, что эти секретируемые пузырьки играют роль во внутриклеточной передаче сигналов¹⁴. Чтобы проанализировать это экзосомы очищали из супернатанта, полученного из клеточной линии меланомы и анализировали с помощью двумерного (2D) gel electrophoresis (2DGE) параллельно с mass spectrometry (MS/MS)¹⁵. Анализ 49 белковых пятен, которые отсутствовали в контрольных лизатах клеток, привел к идентификации 41 самостоятельных белков, некоторые из которых уже были идентифицированы в экзосомах, но некоторые были новыми для экзосом - напр., p120 catenin, radixin и immunoglobulin-superfamily member-8. В др. исследовании экзосомы, происходящие из urinary эпителиальных клеток от 6 нормальных добровольцев мужчин, были проанализированы с помощью одномерного (1D) SDS-PAGE параллельно с nanospray жидкостной хроматографией (LC)-MS/MS, это позволило идентифицировать 295 уникальных белков¹⁶ (Box 5). Из них 73 были известными membrane-trafficking белками, в основном эндосомными, это ещё больше подтвердило предположение об эндосомном происхождении экзосом. Кроме этого, идентифицирован ряд белков, которые, как было известно, участвуют в специфических заболеваниях почек, это указывает на то, что анализ, экзосом, экскретируемых в мочу, м. служить методом для раннего выявления болезней почек.

Phagosomes. Фагоцитоз используется клетками, чтобы интернализовать большие макромолекулярные комплексы, особенно патогены, для деградации. Комплекс или патоген соединяется с рецепторами клеточной поверхности, это приводит в результате к инвагинации плазматической мембраны и интернализации комплекса или патогена. Как упоминалось в Box 1, интернализация латексных кусочков, являющаяся модельной системой фагоцитоза, делает фагосомный компартмент значительно обогащенным и пригодным для протеомного анализа. Используя эту стратегию, было идентифицировано в целом 520 PHAGOSOME белков⁹. Т.к. фагосомы сливаются с органеллами эндоцитотического и биосинтетического пути, то разделение стадий созревания затруднено и белки, которые идентифицируются, возможно представляют собой несколько стадий процесса фагоцитоза. Интересной и новой находкой при данном протеомном анализе было присутствие многих ER белков в протеоме PHAGOLYSOSOME, хотя не известно очевидной связи phagosome-ER. Однако, исследование Desjardins с соллегами позволило предположить, что часть фагосомной мембраны происходит из ER^17,18 и с помощью протеомной стратегии они показали, что фагосомы обладают полной cross-presentation machinery для экзогенных антигенов¹⁹ (Box 5). Дальнейшие протеомные исследования изучали роль protein kinase Cα (PKCα) в регуляции биогенеза phagolysosome. Фагосомы, изолированные из макрофагов, избыточно экспрессирующих доминантно-негативную kinase-dead мутантную PKCα, обнаруживали ингибирование рекрутирования фагосомных компонентов Rab7, cathepsin-D и cathepsin-S по сравнению с фагосомами, выделенными из контрольных мышиных макрофагов. Эти данные указывают на то, что PKCα играет роль в биогенезе phagolysosome²⁰.

Clathrin-coated vesicles. Покрытые клатрином пузырьки (сlathrin-coated vesicles) (CCVs) (Box 5), которые образуются с использованием adaptor protein-1 (AP1), участвуют в транспорте из trans-Golgi network (TGN) в эндосомную систему. Adaptor protein-2 (AP2)-позитивные CCVs функционируют в пределах эндоцитотических процессов, которые начинаются на плазматической мембране. Они включают приём сигнальных рецепторов, насосов плазматических мембран и питательных веществ.

Протеомный анализ фракции CCV из головного мозга крыс с использованием 1D SDS-PAGE и LC-QUADRUPOLE TIME-OF-FLIGHT-MS/MS, идентифицировал 209 белков, включая 8 новых белков^21,22. Эти белки были классифицированы в соответствии с их количествами путём подсчета количества фрагментированных пептидов, от каждого из белков. Используя этот метод, наблюдали ожидаемую 1:1 stoichiometry для тяжелой цепи клатрина и лёгкой цепи клатрина. Интересно, что 3:1 stoichiometry была обнаружена для AP2 по отношению к AP1, это указывает на то, что большинство CCVs в головном мозге действуют скорее в эндоцитозе, чем в отпочковании от TGN²². Эти данные согласуются с идентификацией известных белковых компонентов протеома CCV. Т.к. важной функцией CCVs в головном мозге является рециклинг синаптических пузырьков, то протеомные данные подтверждают модель полного слияния для экзоцитоза синаптических пузырьков²². Более того, были идентифицированы enthoprotin/epsinR и adaptin ear-binding coat-associated protein-2 (NECAP2) и было показано, что они являются новыми компонентами CCVs, которые образуются на TGN и плазматической мембране, соотв.^21,23. Др. исследования показали, что эти белки взаимодействуют с AP1 и AP2, соотв. посредством ранее нераспознанных новых пептидных мотивов, которые располагаются вокруг последовательностей с θXXθ сердцевиной (θ представляет собой большой гидрофобный остаток, а X представляет любую аминокислоту)²⁴. Это увеличивает известную сложность молекулярной сортировки, которая осуществляется с помощью CCVs. Наконец, как упоминалось выше, этот протеомный анализ открыл белок enthoprotin, который, по-видимому, ответствен за чувствительность к субтипу шизофрении²⁵.

Mitochondria. Митохондрии участвуют в окислительном фосфорилировании и продукции АТФ во всех клетках, но их белковый состав варьирует в зависимости от типа клеток, условий и состояния болезни. Протеомный анализ может внести ясность в отношении того, как митохондрии физиологически адаптируются.

В четырех протеомных анализах митохондрий, выделенных от трех разных видов, выявили 416-750 ассоциированных с митохондриями белков^26-30. Исследование протеома митохондрий из сердца человека выявило 615 белков при использовании 1D SDS-PAGE подхода для фракционирования белков²⁶ и multidimensional-liquid-chromatography-MS/MS для получения расширенного охвата (coverage) этого протеома^27,28, используя комбинацию 2DGE и двумерной liquid chromatography (LC/LC)-MS/MS, чтобы идентифицировать 750 белков в митохондриях из in Saccharomyces cerevisiae, тогда как в исследовании Prokisch et al.³⁰, использовавших 'SHOT GUN' PROTEOMICS STRATEGY для идентификации 546 митохондриальных белковS. cerevisiae. Из 546 белков, идентифицированных Prokisch et al.³⁰, 337 перекрывались с таковыми в исследовании Sickmann et al.²⁸, а большинство из оставшихся белков были классифицированы как белки с низким содержанием^28,30. Mootha et al.²⁹ осуществили протеомное исследование митохондрий мыши и получили список из 591 митохондриального белка.

И Mootha et al.²⁹ и Prokisch et al.³⁰ интегрировали данные из анализа экспрессии, скрининга делеционных фенотипов, анализа белковых взаимодействий, компьютерных предсказаний и исследований субклеточной локализации, чтобы всестороннего представления о митохондриях. Mootha et al.²⁹ выделяли митохондрии из головного мозга, сердца, почек и печени мышей, анализировали переваренные белки, используя LC-MS/MS, и сравнивая протеомные данные с профилями экспрессии РНК в тех же самых тканях. Эти данные пролили свет как на ткане-специфические отличия состава митохондрий, так и на корреляцию между уровнями белков и РНК²⁹. Они идентифицировали 591 митохондриальный белок, включая 163 белка, которые ранее не связывали с этими органеллами²⁹. Важным аспектом этого исследования было интегрирование данных протеомики и экспрессии РНК с генотипическими данными от пациентов с французко-канадским типом LEIGH SYNDROME, и это позволило идентифицировать одиночного гена кандидата для этой болезни, LRPPRC³¹ (Box 5).

Такие протеомные исследования предоставили важные сведения о функции митохондрий - напр., они сделали более глубоким понимание белков, которые являются важными для этой органеллы и оказались в состоянии идентифицировать предсказанные энзимы репарации ДНК для небольшого митохондриального генома. Эти базы данных позволили исследователям сравнить белковые ортологи у разных видов и лучше понять процессы, происходящие в митохондриях.

Peroxisomes. Эти повсеместные органеллы специализируются на оксидативных реакциях, которые продуцируют peroxide водорода, и связаны с многочисленными функциями, включая метаболизм жирных кислот и синтез PLASMALOGEN. Протеомные стратегии были использованы для дискриминации загрязнений от bona fide пероксисомных белков у S. cerevisiae, и было признано 70 белков, относящихся к пероксисомам³². Важным оказалось открытие Rho1 на пероксисомных мембранах. Получены первые доказательства связи между peroxisomes и акиновым цитоскелетом, это указывает на то, как регулируется локализация и перемещение пероксисом в клетке (Box 5).

Endoplasmic reticulum. мРНК трансмембранных и секреторных белков транслируются на ER, а вновь синтезированные белки последовательно поступают в белок-упаковывающую 'factory' просвета ER. Протеомный анализ содержимого просвета ER, которое было фракционировано из печени Balb/C мышей, выявил 141 белок³³ (Box 5). Белки из просвета были разделены с помощью 2DGE, a matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS и MALDI MS/MS были использованы для анализа вырезанных пятен. Из 141 белков были идентифицировано 6 новых, включая ERp19 и ERp46. Эти белки содержат thioredoxin мотивы, которые являются функциональными заменами для protein disulphide isomerase у S. cerevisiae. Это указывает на то, что ERp19 и ERp46 являются protein disulphide isomerases. Это семейство белок-упаковывающих энзимов катализирует продуктивную укладку белка путем окисления и восстановления дисульфидных мостиков в субстратных белках до тех пор, пока они не приобретут правильной четвертичной структуры. Открытие двух новых энзимов указывает на специфичность к субстратам, существует в molecular-chaperone функции этих белок-укладывающих энзимов.

ERGIC. Транспорт по экзоцитотическому пути от ER к Golgi обеспечивается с помощью промежуточного компартмента, который состоит из тубуло-везикулярных структур и известен как endoplasmic-reticululm-Golgi intermediate compartment (ERGIC). Этот компартмент был выделен из клеточной линии гепатомы человека HepG2 для протеомного анализа с использованием affinity техники³⁴. Клетки обрабатывали BREFELDIN A, чтобы индуцировать слияние комплекса Golgi с ER, и оставить после себя резистентный к brefeldin-A компартмент ERGIC. ERGIC выделялся с помощью субклеточного фракционирования с помощью NYCODENZ градиентов и иммуноочистки, используя намагниченные кусочки, которые оказывались связанными с цитоплазматически экспозированным эпитопом KDEL RECEPTOR. После триптического переваривания составляющих его белков использовали 1D SDS-PAGE гель для разделения белков и MALDI-time-of-flight MS и nanospray MS/MS для анализа пептидов.

Было идентифицировано 24 белка, включая 2, которые ранее не были охарактеризованы - SURF4 (Surfeit locus protein-4) и ERGIC-32 (Box 5). ERGIC-32 имел последовательности, гомологичные S. cerevisiae белкам ER vesicle-41 (Erv41) и Erv46, и как было установлено является новым мембранным белком, который круговращается между ER и Golgi. Erv белки являются составляющими пузырьков, которые происходят из ER S. cerevisiae , как показал анализ пузырьков, переносящих вновь синтезированный груз в Golgi. Эти белки являются кандидатами на роль рецепторов вновь синтезированного груза и они также были охарактеризованы с помощью протеомной техники³⁵. В исследовании Breuza et al.³⁴, ERGIC-32 был локализован в ERGIC с помощью иммунофлюоресцентной микроскопии. RNA interference (RNAi) ERGIC-32 увеличивала оборот ERV46 человека, это указывает на то, что эти белки могут формировать комплексы, стабильность которых нуждается в присутствии обоих белков. Интересно, что новый белок SURF4 имеет последовательности, гомологичные Erv29, который также действует как рецептор груза³⁶. Полный набор молекул, которые необходимы для перемещения груза между ER и Golgi не определен и поэтому неясно, где инициируется в динамических ERGIC-Golgi компартментах ретроградный транспорт. Дальнейшие исследования (Ref. 36), в 'well-timed' системах позволят решить эти вопросы.

Golgi complex Комплекс Golgi является центральной органеллой экзоцитотического пути. Он ответственен за многие из постр-трансляционных модификаций вновь синтезированных белков и липидов, а также за сортировку этих молекул к местам их функционирования. Опубликованы 4 протеомных исследования комплекса Golgi из печени крыс и эпителиальных клеток молочных желез, в двух был использован 2DGE^37,38, в одном 1D SDS-PAGE³⁹ и ещё в одном использована multidimensional protein-identification technology (MudPIT)⁴⁰. Исследования Taylor, Wu и др.^37,38,40 явились результатом сотрудничества двух групп и представили усиленную, утонченную протеомную технологию. Стартовый материал - фракции аппарата Гольджи - для исследований Bell et al.³⁹ и Taylor, Wu и др.^37,38,40 выделялся разными методами, но использованные фракции Гольджи были обогащены уложенными в пачки плоскими цистернами в обоих случаях. Bell et al.³⁹ сначала экстрагировали фракции Гольджи в Triton-X 114, чтобы обогатить их мембранными белками и затем разделяли белки detergent-phase, используя 1D SDS-PAGE. И традиционное EDMAN SEQUENCING и MALDI MS выявили 81 белок, 45 из которых уже считались белками Гольджи и 24 были загрязнителями в основном из ER и mitochondria. Многие (32) из 81 белков не были трансмембранными белками, а были, по-видимому, белками, которые взаимодействуют с трансмембранными белками и которые не диссоциируют и не распадаются на части в детергентной фазе. Важно, что были идентифицированы некоторые новые белки т группа сконцентрировалась на одном из них, названным Golgi peripheral protein of 34 kDa (GPP34). Тот же самый белок был идентифицирован Taylor, Wu и др. Он был назван Golgi matrix protein of 33 kDa (GMx33), и подвергся экстенсивному исследованию^37,41 и было предположено, что он является членом нового семейства периферических trans-Golgi белков.

Wu et al.⁴⁰ использовали LC/LC-MS/MS, чтобы получить более исчерпывающую информацию о протеоме Golgi. Они идентифицировали 421 белок, 41 из которых обладает неизвестной функцией. Большинство известных в качестве ER белков (96) было идентифицировано как известные Golgi белки (110). Оставшиеся 215 белков были рассортированы на основании их известной локализации и функции. Многие из этих белков могут функционально взаимодействовать с Golgi, но верификация их функционального значения требует дальнейшей их локализации и функциональных исследований.

Эти протеомные исследования идентифицировали новые белки, которые могут быть целью дальнейших функциональных исследований и вообще наиболее поучительной находкой является то, что огромное число белков были идентифицированы как ER белки. Морфологические исследования показали, что ER плотно прилегает к многочисленным trans-Golgi цистернам^42-44, a протеомные данные указывают на то, что ER действительно слипается и изолируется вместе с уложенными пачками фракциями аппарата Гольджи. Известно, что эти взаимодействия могут обеспечиваться с помощью CERT (ceramide ER transfer protein), который переносит ceramide из ER к sphingomyelin synthetase в Golgi⁴⁵.

Др. биологическая информация получена из разработки MudPIT данных для пост-трансляционных модификаций⁴⁰. Новая цитоплазматическая пост-трансляционная модификация - идентифицированная у 10 Golgi и 5 ER белков, a один из новых белков, локализованных в Golgi, как предполагается является methyltransferase, которая сама себя dimethylated по аргининовому остатку (Box 5). Т.к. эта пост-трансляционная модификация, как известно, является важной дл ядра, то её присутствие в цитоплазме указывает на её функциональное значение. В будущем MudPIT данные будут проанализированы детальнее и мы надеемся, что это позволит получить больше информации и пост-трансляционных модификациях. Протеом Golgi должен отличаться в разных типах клеток и тканей и в разных физиологических состояниях. Данные этих исследований д., следовательно, функционировать как базисная линия для сравнения с результатами будущих исследований.

Chloroplast envelope. У растений и водорослей хлоропласт является органеллой, в которой осуществляется фотосинтез. Две мембраны, окружают хлоропласты и формируют их оболочку. Была разработана специализированная процедура для получения высоко очищенных оболочек хлоропластов из Arabidopsis thaliana, и эти мембраны были подвергнуты трем различным процедурам экстракции, чтобы довести до максимума количества мембранных белков, которые могли бы быть идентифицированы с помощью LC-MS/MS⁴⁶. В результате этих трёх экстракций было идентифицировано 112 белков, из которых 89 были предсказаны как подлинные белки оболочки. Эти предсказания были сделаны на основании литературы и методов биоинформационных предсказаний, чтобы определить белковую гидрофобность, присутствие TRANSIT PEPTIDES и гомологию с ранее идентифицированными белками хлоропластов (Box 5). Из 89 белков 32% участвуют - или предположительно участвуют - в транспортных функциях, но даже биоинформатика не может предсказать функцию 30% из этих белков. Некоторые из транспортных белков участвуют в транспорте фосфатов, который особенно имеет отношение к регуляции уровней стромальных фосфатов и инициации CALVIN CYCLE. Остальные 38% были классифицированы как метаболические белки или как имеющие др. функции, которые ещё предстоит выяснить ⁴⁶. Эти исследования подтвердили важную роль мембран оболочки хлоропластов в липидном метаболизме, включая десатурацию жирных кислот и синтез регуляторов липидного роста и защитных молекул.

Lysosomes. Лизосомы являются основным вызывающим деградацию компартментов и представляют собой конечную точку эндоцитотического пути. Они содержат множество разнообразных гидролитических энзимов, котрые даградируют клеточные макромолекулы. Протеомный анализ лизосом - особенно Triton-WR1339-заполнеенных лизосом, которые известны как 'tritosomes' - идентифицировал 215 белков⁴⁷ (Box 5). Для обогащения мембранными белками использовали обработку alkaline sodium carbonate вместе с дальнейшим фракционированием, что делало возможным идентификацию вероятных грузовых белков (напр., Golgi glycosyltransferases , а также белки доставки, слитые белки и транспортеры). Обилие белков липидных плотиков в лизосомных мембранах подтверждено присутствием этих доменов, которые ранее были идентифицированы в фагосомах⁴⁸. Выявлено также большое количество ER белков. Это расширило более ранние достижения в области протеомики лизосом (rev. 9), были идентифицированы сигнальные белки, такие как CREG (cellular repressor of E1A-stimulated genes), GTPase LRG-47 и mitogen-activated-protein-kinase kinase (MEK)-binding protein MP1. Продолжающиеся попытки расширить характеристики лизосомных мембранных белков, белков просвета и белков, которые связаны с цитоплазматической поверхностью этих органелл могут помочь идентифицировать белки, которые регулируют количества и локализацию лизосом.

Nucleus. Белки комплекса ядерных пор и ядерной оболочки у S. cerevisiae и в клетках млекопитающих были идентифицированы с помощью протеомных исследований^49-51 (Box 5). Изучение комплексов ядерных пор у S. cerevisiae выявило базирующуюся на протеомике Brownian-affinity-gating модель ядерного транспорта⁴⁹. Анализ ядерной оболочки осложнён сопредельной природой наружной ядерной мембраны и ER. Schirmer et al.⁵¹ использовали SUBTRACTION STRATEGY для анализа ядерной оболочки (Рис. 1). Обстоятельный протеомный анализMICROSOMAL MEMBRANE FRACTION был осуществлен и белки, которые были идентифицированы в ER, выделялись из протеома ядерной оболочки ⁵¹. Все ранее идентифицированные белки ядерной оболочки (13 в целом) были идентифицированы в этом исследовании, а также 67 новых белков. 8 из них были tagged и их локализация на ядерной оболчке была подтверждена с помощью иммунолокализации. На основании хромосомной локализации гомологов этих белков у человека Schirmer et al.⁵¹ предположили, что некоторые из этих новых белков ядерной оболочки могут участвовать в DYSTROPHIES, которые ещё не были сцеплены с болезненными генами (ряд дистрофий, как полагают, связан с мутациями белков ядерной оболочки). 23 из человеческих гомологов были картированы в областях геномов, которые сцеплены с различными дистрофиями. Эти данные представляют собой прекрасную стартовую точку для выяснения, какова эта очень сложная структура внутренней ядерной мембраны и каково её отношение к болезням. Оценка локализации остальных 59 новых белков ещё предстоит, чтобы вычленить полный состав и функцию белков, специфичных для ядерных мембран.

Изучение ядрышка недавно описано Andersen и др.⁵². Ядрышко является областью ядра, генерирующей рибосомы, где транскрипция скоординирована с процессингом рибосомальной РНК и биогенезом рибосом. Ядрышки были выделены из клеток HeLa с использованием стандартного протокола, а смеси белков от индивидуальных 1D гелевых пластинок подверглись перевариванию в геле. Возникающие в результате смеси пептидов анализировали с помощью LC-MS/MS, а также с помощью ion-trap-Fourier-transform масс спектрометрии. Идентифицировано свыше 11,000 уникальных пептидов, которые привели к идентификации 692 белков, которые стали рассматриваться как ядрышковые. Интересно, что 90% из ранее охарактеризованных ядрышковых белков у S. cerevisiae⁵³ соответствовали тем, что были найдены в данном исследовании (более высокий %, чем выявлено соотвествия в предыдущем исследовании⁵⁴), это подчеркивает высокую степень консервации фундаментальной природы этого компартмента. Было идентифицировано 489 белков, которые рекрутировались в или терялись из ядрышка вследствие ингибирования транскрипции или ингибирования протеосом (Box 5). Существенные изменения обнаружены в количестве рибосомальных белков, которое снижалось вследствие ингибирования транскрипции и повышалось вследствие ингибирования протеосом. Роли всех этих белков в морфологии и функции ядрышков исследуются.

Пост-трансляционные модификации являются важным способом регуляции клеточных процессов, а протеомные методы начинают концентрироваться на идентификации различных форм пост-трансляционных модификаций. Большинство исследований, сфокусированнных на фосфорилировании и широкомасштабной характеристике phosphoproteins, может предоставить информацию о регуляции процессов, которые специфичны для органеллы. Beausoleil et al.⁵⁵ разработали стратегию для крупно-масштабной идентификации phosphopeptides и использовали ей для анализа ядер клеток HeLa. Используя strong cation-exchange хроматографию для обогащения phosphopeptides, они идентифицировали 2002 сайтов phosphorylation в 967 идентифицированных белках⁵⁵. Это позволило определить специфичность киназ, которые ответственны за эти события фосфорилирования и было показано, что proline-directed киназы (напр., extracellular signal-regulated kinase-1) и ацидофильные киназы (напр., casein kinase-I и -II) ответственны за 77% наблюдаемых событий фосфорилирования.

Plasma membrane. Важной задачей протеомики и методов субклеточного фракционирования, является характеристика белков клеточной поверхности, в частности, в свете заболеваний. Важный успех был достигнут Oh et al.⁵⁶, которые охарактеризовали белки плазматических мембран эндотелиальных клеток лёгких крыс, которые были выделены, используя разработанную silica-coated-bead методологию⁵⁶. Они идентифицировали 2000 белков и показали, что 2 были специфичны для клеток легочного эндотелия и располагались на клеточной поверхности. Сравнение этих данных с информацией о белках плазматических мембран клеток легочного эндотелия от крыс с аденокарциномами молочных желез выявило 12 белков, которые встречались на высоком уровне в плазматических мембранах опухолевого эндотелия. Одним из этих 12 белков был annexin A1, a инъекции антител против annexin A1вызывали ремиссию опухолей. Такое использование протеомики плазматических мембран для терапии рака подтверждено и работой Shin et al.⁵⁷ по протеому клеточной поверхности опухолевых клеток, а также исследованиями Tam et al.⁵⁸, Zhang et al.⁵⁹ и Nuhse et al.⁶⁰ га разных плазматических мембранах. Недавно Nielsen et al.⁶¹ использовали вариацию DIGITONIN SHIFT протокол⁶², чтобы охарактеризовать 862 белков плазматической мембраны коры головного мозга мышей и 1685 белков плазматической мембраны гиппокампа мышей (Box 5). В целом эти исследования пролили свет на белки, которые важны для коммуникаций между клеточными поверхностями внеклеточным матриксом и внутриклеточной средой в контексте передачи сигналов^59,60 и болезней^56-58.

Membrane domains and lipid rafts. Специфические функциональные домены обнаруживаются в мембранах всех органелл. LIPID RAFTS являются фокусом недавних многчисленных исследований и противоречивых высказываний⁶³. Эти домены являются чрезвычайно динамичными и предполагается, что это позволяет им функционировать в качестве сортирующих и сигнальных платформ⁶³. Они обычно экстрагируются из клеток с помощью TritonX-100 при 4°C, a экстрагированные домены только частично отражают структуры in vivo, которые означают, что интерпретация результатов протеомных исследований, касающихся этих структур, не являются прямолинейными.

Использование SILAC (мечение стабильным изотопом с помощью аминокислот в культуре клеток) метода позволяет осуществить широко-форматный протеомный анализ липидных платформ⁶⁴. SILAC метод представляет собой количественную стратегию, в которой, в этом случае, лейциновые остатки, каждый из которых содержит три атома deuterium, инкорпорируются в белки. Пептиды, которые возникают из этих меченных белков легко идентифицируются, т.к.они были отягощены тремя mass units для каждого лейцинового остатка. Все белки одной из двух популяций были метаболически помечены с помощью deuterium-замещенного лейцина и одна популяция была обработана холестерол-разрушающим лекарством, чтобы дестабилизировать липидные платформы. С помощью этого подхода идентифицировано 241 белок, специфичный для липидных платформ (Box 5).

Проблема по идентификации белков липидных плотиков, которые чрезвычайно гидрофобны, решается использованием SDS-aided high-performance-LC-MALDI-MS/MS протеомного подхода⁶⁵, который избегает 1D гелей и переваривания внутри геля белков. Эта техника позволила идентифицировать 71 гидрофобный белок плотиков, из которых 45 ранее не были выявлены с помощью экспериментов переваривания белков в геле⁶⁵. В др. исследовании динамическая природа протеома липидных платформ была выявлена благодаря запуску T-cell receptor (TCR) с использованием 2DGE и MALDI-time-of-flight MS⁶⁶. Будучи ограниченным в результате проблем с выборками 2D гелей, это исследование оказалось замечательным и показало, что TCR triggering обеспечивает регулируемую во времени поставку белков, которые участвуют в передаче сигналов TCR в липидные платформы.

Помимо изучения органелл и транспортных промежуточных образований, протеомные технологии успешно используются для изучения крупных клеточных структур, таких как цитоскелет и CENTROSOME. Цитоскелет взаимодействует со всеми органеллами и многие цитоскелетные белки идентифицируются в протеомах органелл. Исследования, которые специально концентрировались на цитоскелете и цитоскелетных организующих центрах важны для идентификации регуляторных молекул, которые функционируют в интерфейсе между цитоскелетом и органеллами.

Cytoskeleton. Цитоскелет является сложной сетью филамент, ассоциированных с моторными и регуляторными молекулами. Новые протеомные подходы были использованы для изучения цитоскелета. Tubulin-affinity хроматография была использована для выделения tubulin-связывающих белков из A. thaliana⁶⁷. Связанные белки разделяли, используя 2DGE и идентифицировали, используя LC-MS/MS. В целом было идентифицировано 122 белка в 86 пятнах исходного 2D геля и они были подразделены на 6 функциональных категорий: ассоциированные с микротрубочками белки, трансляционные факторы, РНК-связывающие белки, сигнальные белки, метаболические энзимы и белки с иными функциями. Половина идентифицированных белков, как было показано ранее, взаимодействует с микротрубочками. Интересной находкой оказалась идентификация модификационных энзимов клеточной стенки, таких как endo-1,4-glucanase и endoxyloglucan glycosyl transferase, которые модифицируют архитектуру клеточной стенки и необходимы для элонгации клеток и созревания плодов (Box 5).

Др. важным моментом была идентификация ассоциированных с цитоскелетом функциональных комплексов - напр., 14-3-3 COMPLEXES человека⁶⁸. FLAG-TAGGED 14-3-3γ человека стабильно экспрессируется на уровне, эквивалентном эндогенным 14-3-3 изоформам в human embryonic kidney (HEK)293 клетках, a ассоциированные с ним белки выделялись с помощью иммобилизованных anti-Flag антител. LC-MS/MS анализ выявил 170 белков. которые ассоциированы с 14-3-3γ, включая 7 эндогенные 14-3-3 изоформы и др. белки с широким спектром функций, включая контроль цитоскелета⁶⁹. Блокирование способности комплексов 14-3-3 соединяться с фосфорилированными белками in vivo модифицировало динамику мембран и клеточную форму⁶⁹. Эти данные указывают на важность phospho-зависимых 14-3-3 взаимодействий для динамики мембран и функции цитоскелета (Box 5).

Изучение резистентных к детергентам фрагментов мембран из телячьих нейтрофилов подчеркнуло важность взаимодействия цитоскелетного субмембранного комплекса с трансмембранными сигнальными молекулами. MALDI-time-of-flight MS анализ выявил 19 важных белков в этом комплексе⁷⁰. Эти белки включают цитоскелетные белки fodrin, myosin-IIA, myosin-IG, α-actinin, vimentin и filamentous (F)-actin-связывающий белок supervillin. Белки липидных платформ stomatin, flotillin-1 и flotillin-2 также были идентифицированы. Всё это вместе с данными иммунофлюоресцентной микроскопии демонстрирует существование ассоциированного с липидными платформами мембранного скелета в плазматических мембранах нейтрофилов⁷⁰.

Centrosome. Центросомы человека функционируют как центры, организующие микротрубочки в INTERPHASE клетках и в качестве SPINDLE POLES во время митозов. Центросомы из интерфазных клеток были количественно проанализированы с помощью PROTEIN-CORRELATION PROFILING⁷¹. Каждая фракция из разделенных плотностей протеолитически переваривалась, а образующиеся в результате пептиды анализировались с помощью LC-MS/MS и поиска в базах данных. Специфичные для центросом белки отделяли от неспецифических белков путем отслеживания (tracking) их концентрации в профилях фракционирования пептидов, которые были идентифицированы в 5 фракциях sucrose из препаратов центросом. Консенсусные профили для пептидов, которые могли быть отнесены к известным центросомным белкам, были установлены и пептиды, которые отклонялись от этих профилей, рассматривались как неспецифичные. Если концентрации пептидов коррелировали с концентрациями пептидов из белков, которые, как было известно, локализуются в центросомах, то соотв. белки считались локализованными на центросомах. В результате такого анализа идентифицировано 50 известных центросомных белков, 41 кандидат на центросомные белки и 23 новых локализованных в центросомах компонентов (Box 5). Локализация последней группы белков на центросомах проливает новый свет на возможные функции центросом.

Mitotic spindle. Митотическое веретено представлено микротрубочками из полюсов веретена, центросомами и KINETOCHORE. Полюса митотического веретена, которые получались концентрированно из HeLa клеток были проанализированы, используя MS/MS после разделения белков на 1D SDS-PAGE гелях⁷². Всего идентифицирован 151 белок, которые уже были известны, ассоциируют с аппаратом веретена, центросомами или кинетохорами. Однако, большинство др. белков, которые были идентифицированы (644) ранее не были отмечены в связях с центросомами, а 154 из этих белков оказались не охарактеризованными. 17 из этих не охарактеризованных белков были помечены и трансфицированы в митотические клетки, это привело к идентификации 6 новых компонентов веретена⁷² (Box 5). Это подчеркивает, что не все белки, которые идентифицированы в клеточных фракциях являются bona fide компонентами изучаемого компартмента.

Midbody Во время CYTOKINESIS, когда расщепление мембраны почти полное, плазматическая мембрана борозды деления становится конусообразной, чтобы сформировать MIDBODY. Срединное тело является производным центральной части веретена и персистирует в качестве соединения между двумя дочерними клетками перед финальным отделением. Его функция никогда не была описана, но предполагалось, что оно может содержать белки, участвующие в цитокинезе. Срединные тела млекопитающих выделяли из Chinese hamster ovary клеток и анализировали с помощью MudPIT⁷³. Всего было идентифицировано 160 кандидатов на роль белков срединных тел млекопитающих и они были функционально охарактеризованы у Caenorhabditis elegans с помощью RNAi. Из 160 белков кандидатов, 147 обнаруживали очевидную гомологию у C. elegans, с RNAi-обусловленной супрессией экспрессии белков, возникающей в результате обнаружимых дефектов для 141 из этих белков. RNAi опять же 85 из 147 гомологов вызывала дефекты цитокинеза и 10 новых белков было локализовано в срединных телах клеток HeLa, используя иммунофлюоресценцию. Неожиданно, выявлена роль присутствующего в большом количестве в ER молекулярного хаперона GRP94 в сегрегации хромосом (Box 5). Эти идентификации указывают на то, что многие новые молекулы теперь могут быть тестированы в отношении их участия в процессе цитокинеза. Подтверждение протеомных результатов с использованием техники, такой как RNAi, является именно тем, что необходимо для усиления мощи протеомики.