Seaman, M. N. J. Cargo-selective endosomal sorting for retrieval to the Golgi requires retromer. J. Cell Biol.165, 111–122 (2004) | | | |
Arighi, C. N. et al. Role of the mammalian retromer in sorting of the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. J. Cell Biol.165, 123–133 (2004) | | | |
Yeast have a protein complex known as 'retromer' that retrieves the receptor (vacuolar protein sorting-10) from endosomes and returns it the Golgi. In mammalian cells, endosome-to-trans-Golgi-network (TGN) retrieval is poorly understood, although several proteins or protein complexes are thought to be involved in the endosome-to-TGN retrieval of mannose-6-phosphate receptors (MPRs) — the mammalian counterparts of Vps10. So, might the mammalian retromer be one of the protein complexes involved?
Две работы The Journal of Cell Biology отвечают на этот вопрос звучным "да". В первой работе Matthew Seaman показал, что , субъединица retromer млекопитающих, локализуется в мембранах эндосом. Т.к. эта локализация согласуется с предполагаемой ролью retromer млекопитающих, то она затем изучала endosome-to-TGN retrieval (возвращение) в клеточной линии, которая происходила от Vps26-/- мышей и в HeLaM клетках, которые обрабатывались small interfering RNA (siRNA) против VPS26.
Seaman нашла, что в обоих случаях потеря экспрессии VPS26 нарушает трафик катион-независимых MPR (). В клетках мышей Vps26-/- выявляется повышенная деградация CI-MPR в лизосомах, тогда как в обработанных siRNA клетках, наблюдался увеличенный оборот (cycling) CI-MPR между эндосомами и клеточной поверхностью. Это различие, по-видимому, обусловлено специфичными для типа клеток путями переноса (trafficking) для CI-MPR.
В финальной части своего исследования Seaman использовала репортёрную конструкцию и antibody-uptake assays, чтобы показать, что CI-MPR репортёрная конструкция перемещается с клеточной поверхности в Гольджи посредством VPS26-позитивных эндосом и что в anti-VPS26 siRNA-обработанных клетках эта конструкция сохраняется в эндосомах. Эти данные "...provide compelling evidence that [VPS26] (and therefore retromer) is required for efficient retrieval of the CI-MPR from endosomes to the Golgi."
Во второй работе Juan Bonifacino и др. использовали дрожжевую двугибридную системы и делеционных мутантов, чтобы показать, что две неперекрывающиеся области цитозольного домена CI-MPR м. независимо взаимодействовать с (др. retromer субъединицей млекопитающих). Это подсказало им обратить внимание на потенциальную роль ретромера в CI-MPR trafficking, они использовали иммунофлюоресцентную микроскопию, чтобы показать, что ретромер в основном локализуется в эндосомах, где он частично ко-локализуется с CI-MPR.
Используя immunogold крио-электронную икроскопию для усиления разрешения, они показали, что ретромер ассоцирует с tubular–vesicular профилями, которые выделяются ранними эндосомами, или промежуточными образованиями на пути созревания от ранних к поздним эндосомам. Они показали также, что CI-MPR м. обнаруживаться как в этих retromer-содержащих трубочках (которые, по-видимому, на пути (en route) обратно в TGN) так и во внутрипросветных (intralumenal) пузырьках эндосом.
Чтобы установить функциональную связь между retromer и CI-MPR, Bonifacino и др. использовали siRNA для истощения в клетках HeLa или VPS35. Они наблюдали, что приводи в результате к заметному снижению уровней CI-MPR, что было обусловлено увеличением его высвобождения в и деградацией в лизосомах. Это исследование, следовательно, "...indicate that retromer prevents the delivery of CI-MPR to lysosomes, probably by sequestration into endosome-derived tubules from where the receptor returns to the TGN." Обе эти работы проливают свет на retrieval роль ретромеров млекопитающих.
Characterisation of novel proteins involved in endosomal membrane trafficking: - The Retromer Complex
The endosomal/ lysosomal system of mammalian cells is a highly dynamic trafficking pathway that includes membrane transport from both the late Golgi and the plasma membrane. The primary function of endosomes is the sorting and segregation of receptors and ligands, a process that is necessary for many cellular operations. The molecular details of protein trafficking and biogenesis of the numerous subcompartments of the mammalian endosomal/ lysosomal system are poorly defined. One strategy to identify proteins that function in the trafficking of proteins from endosomes to the TGN is to characterise human homologues of proteins that have been experimentally implicated in endosomal function in other organisms predominantly yeast. The aim of this project is to gain insight into the biochemistry and membrane sorting functions of mammalian VPS protein homologues, primarily the peripheral membrane proteins Vps26p, Vps29p, Vps30p and Vps35p. The principal objective of this proposal is to determine if these mammalian VPS proteins function in an analogous manner to that in yeast. In particular, we aim to determine the intracellular compartments that these peripheral membrane proteins associate with, to determine if these proteins function in membrane transport from the mammalian endosomal system to the TGN.
