Последнее обновление: 01/26/2025 06:43:24  Меню и поиск на этом сайте   ЗДЕСЬ  Дополнительная информация   ЗДЕСЬ!!
WMZ: Z191701361450
WMR: R209318204033


Без рекламы только Браузер Uran (скачать )
   Посещений:
Репарация ДНК

Роль р53
p53: TRAFFIC COP AT THE CROSSROADS OF DNA REPAIR AND RECOMBINATION
Sagar Sengupta, Curtis C. Harris
Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 44-55 (2005); doi:10.1038/nrm1546
p53 mutants that lack DNA-binding activities, and therefore, transcriptional activities, are among the most common mutations in human cancer. Recently, a new role for p53 has come to light, as the tumour suppressor also functions in DNA repair and recombination. In cooperation with its function in transcription, the transcription-independent roles of p53 contribute to the control and efficiency of DNA repair and recombination.


Рис.1.
 | p53 functions as a 'molecular node' in the DNA-damage response.


Рис.2.
 | Role of p53 in nucleotide-excision repair.


Рис.3.
 | Role of p53 in base-excision repair.


Рис.4.
 | Role of p53 in homologous recombination.

Табл.1 The effect of p53 on DNA-repair and -recombination pathways

Links

DATABASES
Entrez: BLM | RECQ4 | Terc | WRN
OMIM:
Bloom syndrome | HNPCC | Rothmund–Thomson syndrome | Werner syndrome | Xeroderma pigmentosum
Swiss-Prot:
APE1 | ATM | ATR | ATRIP | CHK2 | CSA | CSB | DNA ligase IV | Jun | Ku70 | Ku80 | MDM2 | MLH1 | MSH2 | MSH6 | p48DDB2 | p53 | p127DDB1 | PCNA | PMS2 | RAD23B | RAD51 | RAD52 | Sp1 | XPA | XPB | XPC | XPD | XPF | XRCC4

Супрессор опухолей p53 функционирует прежде всего как транскрипционный фактор и м. обеспечивать свои разные нижестоящие функции посредством активирования или репрессирования большого числа генов1-4. p53 является одним из наиболее распространённых мутантных генов при раке у людей, который ведет к генерации мутантного белка с измененными аминокислотными последовательностями обычно в ДНК-связывающем домене5,6. Клеточные белки, такие как мышиный double minute-2 (MDM2) и вирусные белки, такие как human papilloma virus-16 E6 (HPV-16 E6), м. деградировать дикого типа p53 и ограничивать его активность. Потеря функции дикого типа p53 происходит также при избыточной экспрессии мутантного p53 в результате его доминантно-негативного эффекта7. Помимо этой своей роли в регуляции транскрипции менее исзвестны его независимые от транскрипции роли в обеспечнии, по крайней мере, некоторых из его нижестоящих эффектов, включая апоптоз, репарацию ДНК и рекомбинацию ДНК.
p53 соединяется с высоко законсервированным p53-связывающими последовательностями, которые обычно присутствуют в промоторах его генов-мишеней2, p53 соединяется также 'non-sequence specifically' с различными структурами ДНК8. Анализ с использованием различных ДНК-связывающих подходов показал, что сродство p53 к неправильно спаренной и вспученной (bulged) ДНК одинаково с или даже выше, чем это имеет место в MISMATCH REPAIR (MMR) комплексе человека, MSH2- MSH6, при тех же самых условиях9. Вообще-то более подходяще в in vivo контексте p53 м. соединяться с NUCLEAR MATRIX. Это сродство связывания увеличивается вследствие генотоксических стрессов10 и является скорость-лимитирующим фактором в репарации структур ДНК более высокого порядка11.
У эукариот 5 основных процессов рапарации ДНК: NUCLEOTIDE-EXCISION REPAIR (NER), BASE-EXCISION REPAIR (BER), MMR, NON-HOMOLOGOUS END-JOINING (NHEJ) и HOMOLOGOUS RECOMBINATION (HR)12-17. Хотя только независимая от трансактивации функция p53 участвует в регуляции HR, опухолевый супрессор модулирует почти все др. процессы репарации ДНК с помощью как зависимых от трансактивации, так и независимых путей (Рис. 1). Следовательно, p53 м. функционировать как 'молекулярный узел'2,который располагается на пересечении выше стоящих сигнальных каскадов и ниже стоящих путей репарации и рекомбинации ДНК (Табл. 1).

Nucleotide-excision repair and p53


Наиболее разносторонняя форма репарации ДНК, NER, оперирует с поврежденными основаниями и нарушенным спариванием оснований, вызываемым УФЛ или оксидативными повреждениями, которые ведут к изменениям в структуру дуплексной ДНК. Имеются два NER пути, которые частично отличаются по специфичности к субстрату. В то время как global genomic repair (GGR) сканирует весь геном, transcription-coupled repair (TCR) распознает повреждения, которые ассоциируют с транскрипцией12,13. NER распознает широкий круг разнообразных повреждений ДНК, включая индуцированные УФЛ CYCLOBUTANE PYRIMIDINE DIMERS (CPDs) и pyrimidine (6-4)pyrimidone фотопродукты ((6-4) PHOTOPRODUCTS). Во время повреждений УФЛ индуцируется экспрессия UV-damage DNA-binding белка (UV-DDB) - который состоит из двух субъединиц, p127DDB1 и p48DDB2. Предполагается, что p48DDB2 необходим для активации латентной связывающей активности у p127DDB1, и как только p127DDB1 приобретает эту активность, то p48DDB2 оказывается не нужным17.
Xeroderma pigmentosum complementation group C (XPC)-RAD23B является GGR-специфическим комплексом, который участвует в идентификации нарушенных спариваний пар оснований. Соединение с (6-4) фотопродуктами с помощью XPC-RAD23B является прямым. Однако, соединение с CPDs с помощью XPC-RAD23B м. нуждаться в предварительном связывании UV-DDB комплекса. XPC не нужен во время TCR; однако, во время этого процесса застрявшая RNA polymerase II д.б. смещена и повреждение основания д.б. специфически распознано с помощью, по крайней мере, двух TCR-специфических факторов, Cockayne syndrome group B (CSB) и CSA.
Последующие стадии в GGR и TCR м.б. идентичными. Нарушение распознавания сопровождается связыванием некоторых др. белков: XPA и replication protein A (RPA; оба они усилвают распознавание оснований), и transcription factor (TF)IIH субкомплекса RNA polymerase II (который разматывает ДНК с помощью XPB и XPD helicases вблизи повреждения ДНК). Две NER-специфические endonucleases, XPG и ERCC1/XPF, соединяются и расщепляют ДНК с 3' и 5' до места повреждения. Репаративный синтез и последующая репликация (которая обеспечивается с помощью DNA polymerases α или ε, proliferating cell nuclear antigen (PCNA), RPA и replication factor C (RFC)) сопровождаются повторным связыванием (re-ligation).
Пациенты с дефектным NER страдают от xeroderma pigmentosum (XP), редким аутосомно-рецессивным нарушением, которое характеризуется чувствительностью к солнечному свету и преждевременными злокачественными карциномами и неоплазмами. XP генетически гетерогенна: имеется 8 комплементационных групп, обозначенных от XP-A до XP-G и XP-variant (XP-V). В то время как XP-A - XP-G соответствуют генетическим альтерациям в одном из 7 генов, которые вовлечены в NER, XP-V обусловливается дефектами пострепликационно-репаративной кухни (machinery), а NER не нарушена. Следовательно, XP-V пациенты имеют нормальную эксцизионную репарацию, но обнаруживают дефектную репликацию ДНК после УФЛ радиации. Это потому, что ген, который кодирует XP-V, DNA polymerase ε, делает возможным синтез ДНК через индуцированные УФЛ TT-димеры свободным от ошибок способом в нормальных условиях. Гены XP групп A, B, D, F и G необходимы и для TCR и GGR, тогда как гены для групп C и E необходимы для GGR, но не для TCR17.
Влияет ли p53 на NER in vivo? Потеря p53 в клетках человека вызывает снижение репарации индуцированных УФЛ повреждений ДНК18-20. Интактные клетки, которые гетерозиготны по мутации p53 обнаруживают нормальную репарацию (6-4) фотопродуктов, но пониженную инициальную скорость удаления CPD, по сравнению с нормальными клетками19. Следовательно, возможно, что p53 затрагивает NER in vivo, оказывая влияние на функцию (или функции) белков, которые вовлечены в этот процесс. Напр., p53 регулирует транскрипцию p48DDB2 и XPC21,22. В свою очередь, p48DDB2 непосредственно регулирует уровни белка p53 после облучения УФЛ, это указывает на то, что имеются действительно регуляторные взаимодействия между этими двумя белками23. Рекрутирование и XPC и TFIIH на эти сайты CPDs и (6-4) фотопродукты облегчается с помощью дикого типа p53, но не мутантного белка24. p53-индуцибельный p48DDB2 является ключевым ниже стоящим фактором, который ответственен за транспорт XPC к месту повреждения ДНК в облученных клетках25,26. Это возможно объясняет, почему p48DDB2 и XPC, но не p53, ко-локализуются с местами индуцированных УФЛ повреждений ДНК27 (Hbc. 2A).
Помимо упомянутых выше зависимых от трансактивации функций м. ли p53 влиять на NER и независимым от трансактивации способом? Очищенный p53 , по-вимдму, не стимулирует NER в воссозданном in vitro NER подходе28. Однако, было показано, что p53 м. влиять на NER путём соединения с субъединицами TFIIH helicase, XPB и XPD, модулируя тем самым их геликазную активность20,29. Затем было обнаружено, что XPB и XPD helicases являются также компонентами p53-обусловленного апоптического пути29,30 (Рис. 2Ba). Механистически мутант p53 является менее эффективным ингибитором как XPB- так и XPD-опосредованных helicase и транскрипционных активностей. Итак, в целом очевидно, что p53 влияет на NER и transactivation-independent способом.
Дальнейшим указанием на его независимую от трансактивации роль м.б. функция p53 в качестве CHROMATIN-ACCESSIBILITY FACTOR при NER. В ответ на локальное субъядерное облучение УФЛ, после детекции и инициального распознавания ассоциированных с транскрипцией повреждений (с помощью TCR), происходит p53-зависимая релаксация хроматина, которая последовательно распространяется на весь геном31. Предполагается, что глобальная релаксация хроматина, в свою очередь, ведет к выявлению повреждений по всему геному с помощью GGR системы. Интерсно, что индуцированная УФЛ релаксация хроматина достигается с помощью p53-обеспечиваемого ацетилирования гистона H3. Т.к. неизвестно, что p53 обладает внутренне присущей histone acetyltransferase (HAT) активностью, то он скорее рекрутирует p300 (и возможно др. HATs) на сайты NER, чтобы осуществить функцию ацетилирования (Рис. 2Bb).
В то время как роль p53 в GGR общепринята32, p53 м. также облегчать TCR20,33,34, т.к. клетки человека с нарушенной функцией p53 обнаруживают дефекты и TCR20,33. Однако, роль p53 в TCR противоречива, т.к. описано, что клетки млекопитающих, которые гомозиготны по мутациям p53, являются дефектными по GGR, но нормальными по TCR35-37. Это кажущееся расхождение между разыми исследованиями м.б. обусловлено использованием разных источников для облучения УФЛ. Было показано, что хотя потеря функции p53 существенно снижает эффективность TCR благодаря обработке полихроматичными UVB (290-324 nm), но p53 оказывается существенным для GGR и безразличным для TCR, когда клетки обрабатываются 'germicidal', монохроматическими UVC (254 nm), которые действительно отсутствуют в земном солнечном свете38. Однако, механистические основы роли p53 в УФЛ-зависимой регуляции удаления CPD остаются неизвестными. Др. компонент комплекса TFIIH, который необходим только для TCR, CSB, взаимодействует с p53 in vitro и in vivo20,39. Предполагается, что активированный p53 секвестрирует и инактивирует CSB белок, останавливая тем самым транскрипционный комплекс, локально блокируя конденсацию хроматина и вызывая специфичную для метафаз ломкость генов человека39.

Base-excision repair and p53


BER защищает клетки млекопитающих от повреждений, которые наносятся клеточным метаболизмом (включая повреждения, которые возникают в результате метилирующих и окисляющих агентов) и за счёт спонтанных depurinations. Большое количество гликозилаз с узкой, частично перекрывающейся специфичностью к субстрату, endonucleases и ДНК polymerases вовлекается в этот репаративный процесс. BER осуществляется с помощью, по крайней мере, двух путей: 'short-patch-repair' пути, который связан с репарацией одиночных нуклеотидов, и 'long-patch-repair' путь, который связан с репарированием 2-15 nucleotides12,14.
Недавнее изучение apurinic или apyrimidinic (AP) endonuclease-1 (APE1/REF1) показало, что трансактивация функции p53 м.б. изменена за счёт изменений BER энзимов. APE1/REF1 ассоциирует с p53, потенциирует связывание ДНК с помощью p53 и усиливает трансактивацию, останавливает рост и апоптические функции p53 in vivo. Подавление APE1/REF1 вызывает редукцию в способности p53 трансактивировать его родственные промоторы40.
Влияет ли p53, в свою очередь, на BER? Первым указанием in vivo на роль p53 в BER было наблюдение с использованием экстрактов из клеток, экспрессирующих p53 дикого типа, усиливающих реакцию BER41. То, что p53 облегчает BER в клетках установлено с помощью уровней повреждений ДНК. В то время как низкие дозы γ-облучения или платиновое соединение cisplatin (которое вызывает образование поперечных связей внутри нити между соседними гуанинами) приводят к немедленному усилению активности BER, высокие дозы тех же самых ДНК-повреждающих агентов вместо этого ведут к снижению BER и к индукции p53-зависимого апоптоза42. Активность BER ассоциирует с двумя отдельными фазами в ходе клеточного цикла в клетках, не подверженных стрессу: G0-G1 и G2-M фазы. Воздействие γ-облучения усиливает G0-G1 BER-ассоциированную активность и ослабляет G2-M BER-ассоциированную активность. Более подходяще то, что альтерации активности BER после γ-облучения регулируются с помощью дикого типа p53, но не с помощью его мутантных форм, происходящих из опухолей43.
Rotter и др. установили, что влияние p53 на 3-methyladenine (3-MeAde) ДНК гликозилазу, первый энзим, который был идентифицирован в short-patch-repair BER пути, зависит от типа стресса. Дикого типа p53 подавляет транскрипцию и активность 3-MeAde ДНК гликозилазы после воздействия nitric oxide (NO), предупреждая тем самым создание mutator фенотипа44 (Рис. 3a). Напротив, γ-облучение увеличивает p53-зависимую активность 3-MeAde-DNA-glycosylase44. Присутствие p53 дикого типа усиливает удаление окисленных оснований, таких как 8-oxoG, во время экспозиции реактивными видами кислорода45 (Рис. 3b).
Итак, является ли p53 абсолютно необходимым для BER или только играет стимулирующую роль в этом процессе? Установлено, что промежуточные супени BER м. индуцировать p53-независимые цитотксические и генотоксические реакции46, которые указывают на то, что опухолевый супрессор м. и не играть ферментативной роли в этом процессе. Однако, BER стимулируется с помощью рекомбинантного дикого типа p53 в восстанавливающей системе in vitro. p53-зависимая стимуляция BER коррелирует с его способностью взаимодействовать непосредственно с APE1/REF1, ДНК полимеразой β и 8-oxoguanine glycosylase (OGG1)45,47. OGG1 обладает гликозилазной активностью, которая удаляет основания в ДНК, такие как 8-oxoG и активирует AP сайты. AP сайты распознаются с помощью мультифункционального энзима APE1/REF1, который обладает и эндонуклеазной (APE1) и окислительно-восстановительной (REF1) активностью. In vitro, p53 существенно усиливает эксцизию 8-oxoG нуклеотидов из ДНК путём усиления последовательной активности OGG1 и APE1/REF1 (Ref. 45). Интересно, что уровень DNA polymerase β заметно снижен у p53-мутантов или в p53-нулевых клетках. Это указывает на возможность того, что DNA-polymerase-β-p53 комплекс м. влиять на стабильность полимеразы и что эта стабилизирующая активность отсутствует в p53-дефицитных клетках48. Интеграция N-, центральных и C-терминальных доменов опухолевого супрессора необходима для его правильной локализации и различных взаимодействий p53 с разными компонентами BER machinery47.
Вопрос всё ещё остаётся открытым, необходима ли p53-зависимая трансактивация для его роли в BER. In vitro генерированный, неспособный к трансактивации мутантный p53, ка было показано, более эффективен в модуляции активности, чем дикого типа p53 (Ref. 49). Однако, та же самая мутация p53(22,23) вызывает также, как было предположено, и потерю способности стимулировать BER из-за потери взаимодействий с DNA-polymerase-β47 (Рис. 3b).
Selenomethionine (SeMet), который является основным источником selenium в нашей пище выявляет др. связь между p53 и APE1/REF1, т.к. он регулирует p53 с помощью APE1/REF1-зависимого окислительно-восстановительного механизма. Инкубация с SeMet активирует p53 и повышает его трансактивационный потенциал благодаря изменениям его конформации, обусловленными APE1/REF1-опосредосанным восстановлением (reduction)50. ДНК-связывающая активность p53 усиливается в присутствии APE1/REF1 дикого типа, но не кго мутантной формы. Активированный p53 становится способным усиливать кухню ДНК-репарации без каких-либо эффектов, супрессирующих рост. И как результат эти клетки м. переносить более высокие дозы иррадиации УФЛ, когда растут в присутствии SeMet (Рис. 3b). Следовательно, p53 м. вносить вклад в геномную стабильность путём эффективной индукции репарации ДНК , но не за счёт постоянного ареста или апоптоза.

Mismatch repair and p53


MICROSATELLITE INSTABILITY, которая характеризуется неправильно спаренными нуклеотидами и инсерциями или делециями, является следствием проскальзывания DNA polymerase во время синтеза поврторяющихся последовательностей при репликации или рекомбинации. Метилированные основания типа O6-methylguanine (O6MeG), спариваются с C или T, корректируются с помощью MMR благодаря комбинированному действию эволюционно законсервированных специфичных для репарации белков. Среди мутаций зародышевой линии у людей MMR белки MutL homologue-1 (MLH1) и MutS homologue-2 (MSH2) совместно объясняют примерно половину всех случаев наследственных non-polyposis colorectal cancer (HNPCC)12. Однако, было установлено, что MMR система не только используется в HNPCC, но и в более широком спектре раковых опухолей у людей51.
MMR белки и p53 оказывают реципрокные эффекты на активность др. др. Ataxia telangiectasia mutated (ATM)-обусловленная стабилизация mismatch репарационного белкового MLH1-postmeiotic-segregation-increased-2 (PMS2) гетеродимера усиливает p53 активацию во время повреждений ДНК52. Этот эффект м. иметь функциональное значение, т.к. самцы p53-/- Msh2-/- double-knockout мышей обнаруживают синергизм в туморогенезе53. Так как же p53 влияет на MMR? p53 функционирует как сиквенс-зависимый трансактиватор благодаря соединению с некоторыми чувствительными элементами в промоторной области гена MSH2 человека (Ref. 54). Фактически, p53 и транскрипционный фактор Jun действуют синергично в регуляции гена MSH2 человека в ответ на воздействие УФЛ. Комплекс MSH2-MSH6 человека усиливает in vitro связывание p53 с ДНК субстратом, несущим вспученные (bulged) основания, в 3-4 раза55, это указывает на то, что MMR белки и p53 м. функционировать синергично в клетках. MMR и p53 м. кооперироваться для контроля чувствительности к цитотоксическим эффектам cisplatin и ограничивать его мутагенный потенциал в раковых клетках толстого кишечника56. Во время S фазы клеточного цикла, p53 и MSH2 эффективно связываются с ранними промежуточными образованиями рекомбинации, они ко-локализуются др. с др. с рекомбинационными белками RAD50 и RAD51, и со-существуют внутри одних и тех же ядерных ДНК-белковых комплексах. Это указывает на то, что и MSH2 и p53 рекрутируются в места ассоциированной с рекомбинацией репарации и возможно модулируют этот процесс57.
Ассоциация между отсутствием экспрессии MSH2 или MLH1 у людей и присутствием мутаций p53 наблюдалась при саркомах и non-small-cell лёгочных карциномах58,59. Интересной для клиники является корреляция между мутациями p53 или MSH2 и уменьшением величины выживаемости гепатоцеллюлярных карцином и рака головы и шеи60,61. Нестабильность микросателлитов и мутации p53 ассоциируют с аномальной экспрессией гена MSH2 при острой лейкемии взрослых62. Потеря p53 оказывает относительно незначительный эффект на MMR-осуществляющие клетки, но вызывает существенную гиперчувствительность к cisplastin у MMR-дефицитных клеток56, это указывает на то, что p53 и MMR кооперируют в ответ на повреждения ДНК. Однако, сообщалось, что p53 и MMR мутации появляются вместе в glioblastoma, но не в colorectal раковых опухолях63, это указывает на дифференциальный эффект p53 на систему MMR в разных органах.

Non-homologous end-joining and p53


NHEJ является предоминирующим процессом репарации ДНК в G1 фазе, он активен также и во всех др. фазах клеточного цикла64. В клетках млекопитающих большинство DNA double-strand breaks (DSBs) репарируется с помощью NHEJ12,15. NHEJ является 'склонным к ошибкам' процессом, т.к. нуклеотиды в разрыве м.б. добавлены или потеряны, a неправильные концы м.б. соединены. Однако, NHEJ всё ещё активно используется для репарации DSBs т.к. без неё м. накапливаться большое количество генетических повреждений. К ограниченной неаккуратности репарации клетки млекопитающих толерантны, учитывая, что высокий процент генома не кодирует белков.
NHEJ осуществляется с помощью комбинированного действия разных белков, включая DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), XRCC4 (X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells-4) и DNA ligase IV (LIG4). DNA-PK состоит из каталитической субъединицы (DNA-PKcs) и регуляторной субъединицы Ku (гетеродимера Ku70 и Ku80). DNA-PK фосфорилирует и активирует p53, это ведет к апоптозу за счёт трансактивации ниже стоящих генов-мишеней65,66. Однако, др. исследования с др. линиями DNA-PKcs мышей67 и DNA-PK-дефектных линий клеток 68 показали, что p53-обусловленная апоптическая реакция является интактной, даже в отсутствие DNA-PK. p53 и DNA-PK формируют комплекс в ответ на аналоги нуклеотидов. такие как gemcitabine, a комплекс взаимодействует с gemcitabine-содержащей ДНК. Остановка DNA-PK-p53 комплекса в месте инкорпорации лекарства стабилизирует и активирует p53, и индуцирует апоптоз69.
М. ли p53 непосредственно влиять на NHEJ, с или без взаимодействия со специфическими репаративными белками, которые контролируют процесс? И in vitro, и in vivo исследования показали, что дикого типа p53 белок способен воссоединять ДНК с DSBs, это указывает на его предполагаемую непосредственную независимую от трансактивации роль в NHEJ70,71. Предполагается, что дикого типа p53 м. облегчать точную перевязку (ligation)72. Напротив, было установлено, что воссоединение DSB увеличивается с потерей дикого типа p53 (Ref. 73). Установлено, что дикого типа p53 ингибирует NHEJ74-77. Попытка свести эти противоречивые результаты вместе позволила предположить, что p53 ингибирует склонный к ошибкам, но не свободный от ошибок, NHEJ75.
Анализ мышей с двойным нокаутом по индивидуальным NHEJ факторам и p53 предоставил увлекательную точку зрения на последствия неспособности собственно репарировать DSBs. Мыши, дефицитные по Ku, XRCC4 или LIG4 страдают от обширного апоптоза в развивающихся нейронах, так Xrcc4-/- и Lig4-/- мыши обнаруживают гибель поздних эмбрионов78-80, которая существенно восстанавливается с помощью гомозиготной делеции p53 (Refs 81,82). Однако, восстановленные double-нокаутные Xrcc-/- p53-/- и Lig4-/- p53-/- мыши, также как и Ku80-/-
p53-/-
мыши, становятся жертвами лимфом из предшественников В клеток в течение 6-16 недель после рождения. Ранняя гибель обусловлена неспособностью делеции p53 восстанавливать нормальное развитие лифоцитов у мышей, лишенных NHEJ факторов, это вызывает в результате несоответствующие V(D)J REARRANGEMENTS и последующие лимфомы, несущие клональные и повторяющиеся хромосомные перестройки, такие как амплификации генов и транслокации81-83. Следовательно, потеря факторов NHEJ приводит в результате к нерепарируемым DSBs и вызывает апоптическую реакцию с помощью p53-зависимой активации, ведущей к эмбриональной летальности. Двойной нокаут (Artemis-/- p53-/-) у мышей показал, что этот NHEJ фактор - Artemis (нуклеаза, которая мутантна в субнаборе тяжелых иммунодефицитов у людей) - и p53 кооперируют, чтобы супрессировать онкогенную амплификацию N-Myc84. Итак, Artemis-/- p53-/- мыши обнаруживают амплификацию N-Myc и становятся жертвами опухолей из предшественников В клеток.

Homologous recombination and p53


HR является фундаментальным и аккуратным процессом, который участвует в поддержании интегральности генома и законсервирован у всех организмов. Во время HR, последовательности, которые теряются из одной двунитчатой молекулы ДНК, замещаются с помощью физического обмена сегмента из второй идентичной копии ДНК12. После детекции DSB, разрыв вырезается из ДНК в 5'→ 3' направлении и возникающий в результате 3' одно-нитчатый хвост покрывается первоначально с помощью RPA, который, в свою очередь, стимулирует полимеризацию pro-recombinogenic белка, RAD51, и его последующее взаимодействие с ДНК (эта фаза обозначается как пресинаптическая фаза; Рис. 4). RAD52 стимулирует полимеризацию RAD51. Полимеризованный RAD51 разыскивает гомологию с помощью RAD54, члена семейства SWI2/SNF2 (SWI обозначает переключение типа спаривания у дрожжей, а SNF является аббревиатурой sucrose non-fermenting) helicases, который м. соединяться с RAD51 stoichiometrically, стабилизируя комплекс белок-ДНК и тем самым стимулируя инвазию нити85. Как только гомология оказывается локализованной дуплекс захватывается и RAD51 филамента проникает в дуплекс гомолога, чтобы сформировать структуруHETERODUPLEX (синаптическая фаза). ДНК-зависимая ATPase, RAD54, способствует этому процессу с помощью временной денатурации пар оснований ДНК. Затем происходит расширение гетеродуплекс-ДНК и branch миграция, которые составляют постсинаптическую фазу реакции. Интактная двунитчатая копия используется в качестве матрицы для синитеза ДНК с помощью DNA polymerases. DNA ligases присоединяет вновь синтезированные фрагменты и HOLLIDAY JUNCTIONS разрешаются с помощью специфических endonucleases, которые известны как resolvases.
p53 контролирует HR и in vitro и in vivo, a его инактивация приводит к увеличению спонтанных и индуцированных стрессами HR86-93. p53-дефицитные мыши обнаруживают повышенные частоты HR на разных стадиях развития94. Более того, p53 мутациями в горячих точках в кодонах 281, 273, 248, 175 или 143 вызывают тяжелые дефекты, с частотами рекомбинации, которые повышаются более чем в 26 раз75. Это, по-видимому, из-за того, что мутантные p53 выделенные из раковых опухолей (такие как 273H) м. не распознавать Holliday junctions95. В клеточной линии, которая ко-экспрессирует мутантный p53, частота делеций была в 5-20 раз выше, чем в клетках, экспрессирующих только дикого типа p5390. p53-зависимое подавление HR оказывается максимальным между последовательностями из коротких гомологий75. Идентифицированы критические аминокислотные остатки, которые необходимы для p53-обусловленной трансактивации96. Мутации в этих остатках ведут к генерации мутантов, дефицитных по трансактивации, p53(22,23). Установлено, что p53 регулирует и спонтанную и индуцированную иррадиацией HR независимо от его активности как сиквенс-специфического транскрипционного фактора и его последующего вовлечения в G1-S checkpoint контроль89,93,97-99.
Эффект p53 на HR м.осуществляться или самим или в ассоциации с HR-специфическими белками или при комбинации обоих. Этот эффект на HR м. сказываться или не hetero-duplex структуре или на Holliday junctions (совместно с RECQ HELICASES. Дикого типа p53 сам м. проверять точность HR событий с помощью распознавания специфических mismatch в промежуточных гетеродуплексных образованиях86, и ограничивать обмены ДНК между неполностью гомологичными последовательностями и тем самым супрессировать туморогенные перестройки генома. Специфичность связывания дикого типа p53 с промежуточными образованиями рекомбинации гетеродуплексного соединения зависит от остатков внутри центрального ДНК-связывающего стержневого домена и в С-терминальных областях tetramerization p53. Тетрамеризованный p53 стабильно соединяется с регионами strand-transfer, позволяя белку давать exonucleolytically корректные гетеродуплексные промежуточные образования рано после инвазии нити95.
p53 взаимодействует с несколькими белками, которые участвуют в HR кухне и одним из наиболее изученных является его взаимодействие с и контроль RAD51. Показано, что RAD51-обусловленные повышенные уровни HR, которые обнаруживаются в подходах по реактивации в клетках-хозяевах, м. контролироваться с помощью дефицитных по трансактивации p53 (Ref. 97,100). In vitro картирование показало, что RAD51 м. соединяться с двумя регионами p53; один между аминокислотами 94 и 160, и второй между аминокислотами 264 и 315. Сайт связывания p53 на RAD51 между аминокислотами 125 и 220 высоко консервативен у бактерий и людей и необходим для полимеризации101,102. В этом контексте уместно отметить, что p53 взаимодействует также и физически с RAD54 и соединяется посредством своего крайнего С-терминального домена100 - той самой области, которая ощущает также неправильные спаривания внутри HR промежуточных образований89. Дикого типа p53 (но не мутантные его формы, происходящие из опухолей) устраняет полимеризацию дикого типа RAD51. Мутантный RAD51 с редуцированным связыванием с p53 повышает HR т не ингибирует полимеризацию даже в присутствие ко-экспрессируемого дикого типа p53 (Ref. 100). Мутант p53 (273H) обнаруживает редуцированную способность ассоциировать с RAD51-DNA комплексом, даже в условиях, которые поддерживают связывание ДНК102,103. Эти результаты указывают на то, что p53 контролирует HR путём непосредственного взаимодействия с ингибированием RAD51 (Рис. 4).
Помимо функции p53 по контролю RAD51 во время пресинаптической фазы, два белка м. также взаимодействовать во время синаптической фазы HR. Предполагается, что p53 и RAD51 м. взаимодействовать во время или вскоре после strand transfer. In vitro комплекс p53-RAD51 м. распознавать гетеродуплексные соединения более эффективно, чем один p53, a RAD51 вовлекается в доставку p53 к этим соединениям. RAD51 стимулирует врожденную 3'→>5' экзонуклеазную активность p53, которую p53 использует для нуклеолитической деструкции гетеродуплексов, которые включают неправильно спаренные основания103. Вне синаптической фазы p53-RAD51 взаимодействие м. также функционировать во время постсинаптической фазы HR. Напр., in vitro дикого типа p53, но не мутантные p53 белки p53(248P) и p53(273P), ингибирует branch миграцию, обеспечиваемую RAD51 (Ref. 104) (Рис. 4).
Необходимо отметить, что многие из непосредственных эффектов RAD51 на p53 были получены в in vitro экспериментах. Имеется определенная степень противоречий относительно того, м. ли p53 в самом деле действовать во внехромосомной модельной системе, было предположено, что регуляция HR с помощью p53 ограничивается структурами высоко упорядоченного хромосомного хроматина105. Более того, было также предположено, что вместо ингибирования RAD51-обусловленной HR, p53 м. защищать клетки млекопитающих от ассоциированных с репликацией ДНК DSBs, возможно путём супрессии образования вызывающих рекомбинацию повреждений106.

Effect of p53 on RecQ helicases


RecQ helicases представляет подсемейство 3'→5' DNA helicases? которые высоко законсервированы в эволюции и необходимы для поддержания геномной интеграции. Мутации в трёх генах RecQ-helicase у людей, BLM, WRN and RECQ4, вызывают нарушения, связанные с предрасположенностью к раковым опухолям - Bloom syndrome (BS), Werner syndrome (WS) and Rothmund-Thomson syndrome (RTS), соотв.107. Клетки пациентов BS имеют повышенные частоты хромосомной нестабильности и HR, т.к. характеризуются повышенными скоростями SISTER-CHROMATID EXCHANGES, инсерций, делеций, теломерных ассоциаций и QUADRIRADIALS107. In vitro рекомбинантный BLM белок м. модулировать события CROSSING-OVER вместе с TOPOISOMERASE III (Ref. 108). WS клетки также обнаруживают аберрантную HR. Дефект проявляется на стадии разрешения этого процесса, это указывает на то, что WRN участвует в разрешении рекомбинационных структур109.
Взаимная регуляция между p53 и RecQ helicases осуществляется на разных уровнях. Напр., транскрипционным фактором Sp1-обусловленная экспрессия WRN модулируется с помощью p53 на уровне транскрипции. Мутации Sp1-связывающих сайтов в промоторе WRN предупреждают репрессию с помощью p53, это указывает на то, что p53-Sp1 комплекс м. предупреждает Sp1 от соединения с промотором110. На пост-транскрипционном уровне C-терминальная область p53 взаимодействует или с N-терминальным регионом BLM или с C-терминальным регионом WRN in vitro111-114. In vivo, и BLM и WRN физически взаимодействуют с p53 - возможно как часть мультибелкового комплекса, который участвует в репликации, рекомбинации и репарации97,112-115.
Функциональная связь между p53 и RecQ helicases была установлена, когда было выявлено, что эктопическая ко-экспрессия p53 с WRN в p53-дефицитных клетках увеличивает уровень транскрипционно активного p53. Это согласуется с увеличением уровня стоящего ниже p53 эффектора p21 и p53-обусловленного апоптоза114,116. После IONIZING RADIATION, p53-зависимый апоптоз ослабляется в BS и WS клеточных линиях и совпадает с физическим взаимодействием между p53 и BLM или WRN112,113.
p53 v/ также влиять на функции, которые обеспечиваются RecQ helicases. Дикого типа p53, но не его мутантная форма, модулирует экзонуклеазную активность дикого типа WRN, но не мутантного белка WRN с С-терминальной делецией117. Фрагмент p53 в 10 аминокислот (аминокислоты 373-383) также м. ослаблять раскручивание Holliday соединений с помощью BLM или WRN in vitro, тогда как фосфорилирование p53 по Ser376 и Ser378 полностью устраняет это ингибирование. Некоторые их мутантов p53, выделенных из раковых клеток, редуцируют или устраняют способность и WRN и BLM соединяться с и расплетать Holliday соединения115. Это м. иметь биологическое значение, т.к. латентный p53 фосфорилирован по Ser376 и быстро дефосфорилируется с помощью клеточных стрессов118. Благодаря функции helicase и ядерной локализации BLM или WRN, необходимых для восстановления остановленной репликативной вилки во время репликативного стресса97,117, не является сюрпризом то, что эмбриональные фибробласты p53-нокаутных мышей обнаруживают лекго выявляемые DSBs после обработки hydroxyurea (HU)106. In vivo инактивация p53 в клетках BS вызывает достоверное увеличение обменов сестринских хроматид по сравнению с BS клетками, которые содержат дикого типа p53, это указывает на то, что p53 и BLM кооперативно влияют на HR и обмены сестринских хроматид97.
Эффект p53 и BLM на HR является прямым следствием сложного внутриклетчонго транспорта этих факторов. BLM является ранним сенсором HU-обусловленных репликационных стрессов. BLM и p53 ко-локализуются и физически ассоциируют др. с др., а также с HR фактором RAD51. HU-обусловленная ре-локализация BLM в RAD51 фокусы не зависит от p53. Однако, BLM необходим для эффективного накопления p53 в этих сайтах и для физической ассоциации p53 с RAD51 (Ref. 97). В несвязанных со стрессами асинхронных культурах BLM обнаруживается в PML NUCLEAR BODIES (PML NBs)119,120, которые рассматриваются как депо для хранения белков в ядре. Клетки, которые лишены функционального p53 накапливают более низкие количества BLM в PML NBs, тогда как изогенные клеточные линии, которые имеют функциональные p53 обнаруживают нормальное накопление BLM в сходных условиях113. Это указывает на то, что в то время как BLM м.б. необходим для транспорта p53 к месту остановки на ДНК репликативной вилки, p53 обусловливает ядерную поставку BLM обратно в PML NBs.
Процесс HR испытывает влияние со стороны деликатного баланса между pro-recombinogenic факторами (напр., RAD51 и RAD54) и anti-recombinogenic факторами (такими как p53 и BLM). Активность RAD51 recombinase во время HR нуждается в тонком контроле, т.к. повышенные уровни RAD51 обнаруживаются в разных линиях опухолвых клеток, это указывает на то, что гипер-рекомбинация м. играть роль в туморогенезе121,122. Следовательно, необходима оценка и баланс, чтобы позволить врожденной аккуратной HR осуществляться при оптимальной эффективности, чтобы предупредить гипер-рекомбинацию. Описаны некоторые комплексы среди anti-recombinogenic белков, p53-BLM, p53-RAD51, p53-RAD54 и BLM-RAD54, которые возможном. модулировать и тонко настраивать реакцию и помогать удерживать HR в сбалансированном состоянии97,100,107. Недавно была повторно изучена идея функциональной взаимосвязи между p53 и RecQ helicases. Wrn-дефицитные мыши не старятся преждевременно в ранних поколениях123. Однако, Wrn-/- p53-/- двойные нокаутные мыши обнаруживают ускоренный туморогенез и формируют более широкий спектр опухолей, чем p53-/- мыши124. Более того, Wrn-/- p53-/- мыши обнаруживают ускоренную гибель по сравнению с Wrn+/- p53-/- мышами, это указывает на то, что имеются функциональные взаимодействия между p53 и Wrn генами и их генными продуктами. Установлено, что в поздних генерациях, мыши, которые являются дважды нулевыми по Wrn и telomerase RNA компоненту Terc обнаруживают дисфункцию теломеразы, которая даёт классический фенотип WS синдрома преждевременного старения125. Скрещиванияе между Wrn-/- Terc-/- и p53-/- мышами м. дать больше ответов касательно взаимозависимости p53 и WRN во время процесса старения.
Неконтролируемая гипер-рекомбинация ведет к геномной нестабильности, включая хромосомные делеции, транслокации и амплификации генов. Пока не очевидно, может ли одна потеря p53 приводить к гипер-рекомбинации или же p53 мутации, в сочетании с потерей др. нижестоящий функций приводят к увеличению HR. В подтверждение сольной роли p53, было показано и в генетических и клеточно-нокаутных системах, что устранение дикого типа p53 вызывает увеличение частоты спонтанных мутаций и различных хромосомных аберраций126-128. Эти результаты подтверждают гипотезу, что один дикого типа p53 достаточен для облегчения рекомбинационой ДНК репарации и тем самым для поддержания геномной интеграции. В качестве альтернативы этому постулату сообщалось, что целенаправленная инактивация дикого типа p53 с помощью HR не вызывает в результате ANEUPLOIDY129. Увеличение доли числовых и структурных хромосомных нестабильностей не обнаруживается в p53-дефицитных клетках. Доля сестринских хроматидных обменов и HR также остаются неизменными при p53 статусе в клетках, не подверженных стрессам. Проедполагается, что разрушение одного p53 недостаточно для вызывания хромосомной нестабильности. Однако, в этом исследовании была исследована только единственная родительская клеточная линия и возможно, что эта линия несет изменения в HR белках, которые м. маскировать эффекты изменений в статусе p53 status.

p53: the 'molecular node'


КПП (checkpoints) ДНК повреждений, индуцируемых клеточным циклом, являются каскадами трансдукции сигналов, которые связывают определение повреждений ДНК с разнообразными ниже стоящими реакциями. Имеются три таких сторожа (gatekeepers) в клеточном цикле эукариот: G1-S checkpoint (который ингибирует переход от G1 к S фазе в присутствии повреждений ДНК, предупреждая тем репликацию поврежденной ДНК), intra-S-phase checkpoint (который индуцируется в результате повреждений, которые появляются во время S фазы и противостоят повреждениям, который избежали G1-S checkpoint) и G2-M checkpoint (который предупреждает переход клеток от G2 к M фазе, тем самым препятствуя митозу в присутствии поврежденной ДНК). Клетки отвечают на КПП клеточного цикла или временной остановкой роста и активацией путей репарации повреждений ДНК или инициацией апоптоза. Хотя стабилизация p53 является фундаментальным событием в G1-S checkpoint, недавние результаты показали, что супрессор опухолей также играет важную роль и в intra-S-phase checkpoint.
G1-S checkpoint в первую очередь индуцируется с помощью DSBs (Рис. 1). ATM представлет собой первичный phosphoinositide-3-kinase-like kinase (PIKK) responder индуцируемых ионизирующей радиацией DSBs130. ATM фосфорилирует ключевые белки в нескольких сигнальных путях или непосредственно или косвенно через свой in vivo субстрат, checkpoint protein-2 (CHK2; Refs 130-132). Фосфорилированный H2AX (γ-H2AX) маркирует актуальные места повреждений ДНК133. Фосфорилирование p53 м.б. обусловлено непосредственно ATM или непрямо посредством CHK2. Итак, одним из наиболее важных событий в G1-S checkpoint является стабилизация и активация p53 (Refs 131,134). Эти результаты м.б. специфическими для нормальных человеческих и мышиных клеток, также как и для некоторых опухолевых клеток, CHK2 м. терять свою роль как стабилизирующего эффектора p53 (Ref. 135).
КПП intra-S-phase запускается с помощью репликационного стресса, который вызывается внутренне присущими событиями или внешними генотоксическими инсультами (напр., УФЛ или HU), он предупреждает дальнейший ход репликационной вилки (Рис. 1). Этот путь прежде всего контролируется с помощью ATR-ATRIP (ataxia-telangiectasia-and-RAD3 related-ATR-interacting-protein) комплекса136. ATR фосфорилирует и активирует CHK1, γ-H2AX137 и белки-трансдукторы, такие как BLM138. Установлено, что 53BP1 необходим для эффективного накопления и BLM и p53 в местах остановки репликации. Накопление BLM и p53 не зависит от γ-H2AX. CHK1 фосфорилирует BLM во время репликационного стресса, а фосфорилированный CHK1 необходим для аккуратной фокальной ко-локализации 53BP1 с BLM, и для последующей стабилизации BLM139. p53 м.б. активирован с помощью ATR и/или CHK1-обусловленного фосфорилирования140,141 или косвенно посредством белков-трансдукторов, таких как BLM, которые транспортируют p53 к местам остановки репликационных вилок97. Итак, сигнал во время репликационного стресса передаётся через ATR-CHK1-BLM-p53 путь97,138. Это вызывает стабилизацию p53, а , следовательно, транскрипционное ослабление p53142.
Итак, p53 функционирует как 'молекулярный узел'2 причем сигналы конвергируют в ответ на любые DSBs или остановки репликационных вилок. p53 решает , роль какого эффектора необходимо принять, возможно в зависимости от условий клеточного цикла и типа и степени повреждения ДНК. p53 м. функционировать или как трансактиватор генов, которые вызывают остановку клеточного цикла, апоптоз или старение, или как модулятор процессов репарации ДНК и рекомбинации ДНК посредством или своей независимой или зависимой от трансактивации функции. Во время процесса, независимого от трансактивации, p53 взаимодействует с белками, которые участвуют в HR, NHEJ, MMR, BER и NER, тем самым добавляется др. аспект к его известной роли в качестве белка, надзирающего за геномом (Рис. 1).

p53: the cellular rheostat


Реакция p53 зависит от его субклеточной локализации в отношении места повреждения ДНК , состояния клеточного цикла, времени повреждения ДНК и дозы и продолжительности генотоксического стресса. М. предположить, что когда степень повреждения ДНК мала, то латентный пул p53, или не модифицированный или пост-трансляционно модифицированный, м. взаимодействовать с кухней репарации ДНК - или в одиночестве или совместно с др. специфичными для репарации факторами. Преимущества такой градированный реакции в том, что она предупреждает 'избыточную реакцию' в ответ на низкий уровень DSBs и нарушения ДНК, которые м. возникать во время клеточного цикла или в ответ на экспозицию низких уровней на медиаторы повреждений ДНК. Вовремя реакции на повреждения ДНК стоящие выше сигнальные процессы играют ключевую роль по распознаванию повреждений и пост-трансляционной модификации p53. Если степень повреждения ДНК превосходит уровень, которы м. успешно залечиваться с помощью только p53, то опухолевый супрессор подвергается стабилизации, которая зависит от пост-трансляционных модификаций, и функционирует как сиквенс-зависимый транскрипционный фактор. Тем самым он активирует набор генов, которые останавливают клеточный цикл, так что процесс репарации ДНК м. успешно откорректировать повреждения. Во время этой ступени p53 м. также взаимодействовать и модулировать различные белки, специфичные для репаративного процесса. Если повреждение ДНК сохраняется иои оказывается нерепарируемым, то специфичные для апоптоза гены, индуцируемые с помощью p53, ведут к гибели клетки. Итак, p53 служит в качестве 'защитника генома'143 , функционируя как 'клеточный реостат', который модулирует её мультивариантные функции на базе специфических in vivo ситуаций (Рис. 1).
Хотя несколько и прояснились зависимые от трансактивации функции p53 во время репарации и рекомбинации ДНК, однако многие вопросы остались. Важно знать, может ли и как p53 взаимодействует с др., ещё неизвестными компонентами или вспомогательными белками, которые участвуют в различных репаративных процессах. Т.к. p53 оказывает влияние на репарацию, репликацию и рекомбинацию ДНК, то д. существовать мультибелковые комплексы в этих сайтах и координироваться с помощью взаимодействий и активности p53. Выяснение комплексов in vivo, их иерархии по важности, кинетике и динамике ассоциаций с повреждениями ДНК д. стать предметом дальнейших исследований.
Недавние исследования показали, что независимая от трансактивации функция p53 также участвует во время апоптоза144. Это м. указывать на то, что имеется взаимная регуляция между разными, независимыми от трансактвиации функциями p53.

→ | K титульной странице | K оригиналам в pdf- и html-формате
Посещений:

Сайт создан в системе uCoz