Посещений:
Взаимодействие Сигнальных Путей

Роль Кадхеринов

Cadherin-mediated cellular signaling
Margaret J Wheelock Keith R Johnson
Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:509–514

Recent cadherin studies focusing on cellular signaling have shown that several pathways are activated by cadherinmediated cell–cell contact. Cadherin-mediated contacts activate Rho family GTPases, regulate the availability of β-catenin to participate in Wnt signaling, and function in receptor tyrosine kinase signaling. Although different classical cadherins bind to the same cytosolic proteins via their cytoplasmic tails, one message that is clear from the recent literature is that downstream signals emanating from cadherin-mediated contacts are both cadherin-specific и cell-context-specific.
Классические кадхерины являются трансмембранными компонентами слипчивых соединений. E-cadherin найден в поляризованных эпителиальных клеточных соединениях, тогда как др. кадхерины обнаруживаются в сходных структурах др. типов клеток. Напр., сквамозные эпителиальные клетки создают слипчивые соединения, которые содержат и E-cadherin и P-cadherin, тогда как фибробласты формируют соединения, которые содержат N-cadherin, а эндотелиальные клетки формируют модифицированные слипчивые соединения, которые содержат VE-cadherin. Кадхерины представлены внеклеточным доменом, ответственным за межклеточные взаимодействия, трансмембранным доменом и цитоплазматическим хвостом, который связывает катенины; катенины служат для связи кадхеринов с актиновым цитоскелетом, а также участвуют в передаче клеточных сигналов [1-4].
Специфические пути передачи сигналов активируются ростовыми факторами с помощью взаимодействий с внеклеточным матриксом или с помощью взаимодействий с др. клетками. Изучение сигналов, которые исходят от кадхеринов осложнено тем фактом, что клетки находятся в постоянных контактах. Для преодоления этих затруднений разработано несколько модельных систем. Одна из систем связана с помещением клеток, экспрессирующих кадхерин, на субстрат, представленный соотв. кадхериновым внеклеточным доменом. Пути активируются, т.к. кадхерины, использующие субстрат, определяются по рекрутированию молекул в ведущий и ведомый края клеток. Др. модель связана с переключением кальция. Т.к. кадхерины нуждаются в кальции для совй активности, то контакт м.б. инициирован путём внезапного подъёма концентрации внеклеточного кальция. Третья модель связана с помещением клеток в рыхлые культуры и с наблюдением сигналов, которые инициируются индивидуальными клетками, устанавливающими контакт с др. клетками .

Signaling through Rho GTPases


Имеются доказательства передачи сигналов как изнутри наружу от GTPase к кахедринам, так и снаружи внутрь, инициируемой кадхеринами. Rac1 и Cdc42 позитивно регулируют адгезивную активность кадхеринов путём ингибирования взаимодействий между IQGAP1 и β-catenin. Т.к. IQGAP1 конкурирует с α-catenin за соединение с β-catenin, то ингибирование взаимодействий между IQGAP1 и β-catenin усиливает взаимодействия между β-catenin и α-catenin, укрепляя ассоциацию cadherin/catenin комплекса с цитоскелетом и способствуя адгезивным взаимодействиям между клетками [5]. Rho, как было установлено, также негативно регулирует кадхерины посредством актинового цитоскелета или посредством др. взаимодействий, не зависящих от IQGAP1 и β-catenin. кроме того, имеются доказательства того, что кадхерином обусловленные межклеточные контакты активируют Rac1 и/или Cdc42, в зависимости от экспериментальной системы, тогда как активность RhoA снижается, т.к. клетки становятся сливающимися. Соединение между кадхеринами и Rho GTPases осуществляется посредством p120 catenin. Reynolds и др. показали, что цитозольный p120 catenin ингибирует активность RhoA, действуя как ингибитор диссоциации гуаниновых нуклеотидов. Как таковой p120 catenin снуёт между мембраной, где он ассоциирует с кадхеринами, и цитозолем, где он секвестрирует RhoA в её неактивной форме.

Табл. 1 Characteristics of RhoA, Rac1 and Cdc42.


Др. [6,7] Показали, что p120 catenin активирует Rac1 и Cdc42, вообще-то посредством активации Vav2, который является фактором обмена гуанина для этих GTPases. T. о., Rac1 и Cdc42, по-видимому, обладают сходной функцией в кадхеринами-обеспечиваемой слипчивости, тогда как RhoA выполняет отдельную функцию (Табл. 1.)
В недавних обзорах обсуждалась связь между кадхеринами и Rho семейством GTPases и поэтому мы отсылаем читателей к ним [5,8-10]. Рассаживая клетки редко и затем наблюдая, как они контактируют др. с др. случайным образом, м. изучать события, которые происходят при первых контактах клеток. В Nelson лаб. [11] трансфицировали клетки почек Madin-Darby собак функциональной GFP-Rac1 конструкцией и использовали time-lapse микроскопию, чтобы показать, что индивидуальные клетки образуют контакты др. с др., ламеллоподии фокусируются в области межклеточного контакта. Одновременно GFP-Rac1 накапливается в области контакта и уменьшается в окружающих областях, указывая на то, что он активно рекрутируется. Rac1 ограничен областями, где клетки образуют инициальные контакты, тогда как E-cadherin накапливается вдоль всей области контакта, подтверждая, что Rac1 рекрутируется и преимущественно активируется с помощью контакта, но его активация не поддерживается с помощью кадхериновых контактов.
Yap и др., использовали клетки оварий Китайского хомячка, трансфицированные E-cadherin для изучения инициальных контактов иным способом [12]. В этом случае клетки засеивали на иммобилизированные димеры внеклеточных доменов E-cadherin, а контакты между живыми клетками и иммобилизировнным субстратом использовали, чтобы воспроизвести межклеточные контакты. В этом исследовании cadherin ligation рекрутирует Rac1 в формируемые контакты на ведущем крае базирующихся на cadherin ламеллоподий и авт. приходят к заключению сходному с тем, что сделано Nelson. Исследование Yap показало, что E-cadherin ligation активирует Rac1 сигнал и что устойчивая активность Rac1 необходима для усиления cadherin контактов вследствие ligation, это контрастирует с находками в исследованиях Nelson. Yap и др. расширили свои исследования, чтобы показать что способность связывать p120 catenin является критической для способности E-cadherin's быстро активировать Rac1 [13]. Т.к. PtdIns-3-kinase является вышестоящим регулятором Rac1 и, как было показано ранее, взаимодействует с E-cadherin [14], поэтому Yap и др. исследовали её роль в активации Rac1 с помощью cadherin [13]. Они показали. что активная PtdIns-3-kinase ко-локализуется с E-cadherin на ведущих краях cadherin-based ламеллоподий. Т.к. ингибиторы PtdIns-3-kinase и доминантно-негативный Rac1 блокируют распространение по кадхериновому субстрату, то авт. предположили, что PtdIns-3-kinase стоит иерархически ниже кадхерина и выше Rac1. Чтобы подтвердить это они использовали активированный Rac1 в присутствии PtdIns-3- kinase ингибитора, чтобы показать, что cadherin-based ламеллоподии всё ещё формируются. Затем было показано, что активность PtdIns-3-kinase необходима для полной стимуляции активности Rac1, но не обязательна для раннего увеличения активности Rac1, которое происходит немедленно после кадхенинового контакта. В противоположность исследованиям Nelson было показано, что активность PtdIns-3-kinase активируется межклеточными контактами, но эта активность не обязательна ни для возникновения инициальных контактов, ни для контактов созревающих до соединений [11].
В сходном исследовании Braga и др. показали, что большинство образующихся кластеров E-cadherin с помощью антител достаточно для активации Rac1 в нормальных кератиноцитах [15]. В их исследованиях кератиноциты росли, чтобы сливаться в среде с низким содержанием кальция, так что кадхерины оставались неактивными. Как только культура оказывалась слитой кадхерины активировались за счёт подъёма кальция. Контроль эффектов кальция включал блокирование активности эндогенного кадхерина с помощью антител нарушающих функцию. Авт. установили, что Rac1 активируется в течение 5 мин. после добавления кальция и что эта активация поддерживалась до 120 мин. В этом исследовании активация Rac1в нормальных кератиноцитах не зависела от активности PtdIns-3-kinase, но зависела от передачи сигналов рецепторов epidermal growth factor (EGF) .
Очевидно, что E-cadherin обусловленные контакты активируют Rac1. хотя каждая модельная система имеет собственную идиосинкразию, в соответствии с которой активация Rac1 является немедленным результатом кадхерином обусловленных контактов. Вовлекаются или нет PtdIns-3-kinase и/или рецепторные тирозин киназы в активацию Rac1 м. зависеть от типа клеток. Следовательно, использование кадхеринов зависит и от собственно кадхеринов и клеточного контекста. Это становится ещё более наглядным, если рассмотреть VE-cadherin и N-cadherin.
Миобласты дифференцируются в мышечные трубки, когда они образуют слитые культуры в присутствии кальция и эта дифференцировка зависит от N-cadherin [16]. Ероме того, RhoA позитивно регулирует миогенез путём увеличения экспрессии MyoD, тогда как Rac1 и Cdc42 ингибируют миогенез [17,18]. Gauthier-Rouviere и др. использовали мышиные миогенные C2C12 клеточные линии для изучения активации Rho семейства GTPases после N-cadherin-обусловленных межклеточных контактов [19]. В этом исследовании клетки обрабатывали поликлональными anti-N-cadherin антителами, которые воспроизводят вовлечение N-cadherin, или засеивали на иммобилизированный N-cadherin субстрат, чтобы показать, что RhoA, но не Rac1 или Cdc42, активируются после задействования Ncadherin. Кроме того, эти авт. показали, что зависимые от N-cadherin межклеточные контакты активируют мышце-специфические промоторы, которые, как было показано ранее, регулируются с помощью RhoA. Выводы из этих исследований отличаются от тех, что обсуждались выше для E-cadherin, и подчёркивают важность клеточного контекста в передаче сигналов. В лаб. Mege использовали ту же самую C2C12 систему. чтобы показать, что ингибирование Rac1 не влияет на инициальные N-cadherin межклеточные контакты, но что Rac1 является важным для соединения кадхеринов с цитоскелетом [20]. Т.о., в миобластах RhoA активируется немедленно после межклеточного контакта, активируя пути миогенной дифференцировки, а др. GTPases играют роль в реорганизации цитоскелета и стабилизации соединительных комплексов.
VE-cadherin является основным кадхеринром, обнаруженным в слипчивых соединениях эндотелиальных клеток. Чтобы изучить сигналы, стоящие ниже VE-cadherin в эндотелиальных клетках, Dejana и др. использовали генный таргетинг для продукции VE-cadherin-нулевых эндотелиальных клеток и это сопровождалось повторным внесением конструкций VE-cadherin [21]. Эта группа установила, что Rac1, но не RhoA, активируется в VE-cadherin экспрессирующих эндотелиальных клетках. Было показано, что непрерывная активация Rac1 важна для поддержания соединений эндотелиальных клеток; затем они пожелали определить, как Rac1 поддерживается в своём активном состоянии. Они показали, что экспрессия VE-cadherin увеличивает общее количество Tiam1, Rac1-специфического фактора обмена гуаниновых нуклеотидов. Кроме того, эти авт. показали. что экспрессия VE-cadherin индуцирует мембранную локализацию Tiam1 и увеличивает его ассоциацию с соединениями. Kouklis et al. использовали эндотелиальные клетки для изучения роли Cdc42 в передаче сигналов cadherin [22]. Они трансфицировали эндотелиальные клетки укороченной конструкцией VE-cadherin, которая не м. инкорпорироваться в соединения, и показали, что не попавший в соединения VE-cadherin индуцирует активацию Cdc42, которая ведёт к выпячиваниям (protrusions) мембраны. Это исследование важно, т.к. указывает на то, что VE-cadherin в передаче сигналов изнутри наружу, также как снаружи внутрь. Кроме того, это исследование и физиологическое значение, т.к. VE-cadherin м.б. вне соединений, когда клетка повреждена, индукция выпячиваний или ламеллоподий играет существенную роль в инициации организации соединений.
В лаб. Mege использованы оптические щупальцы для выяснения дальнейшей существенной роли ламеллоподий в инициации обусловленных кадхеринами межклеточных контактов [20]. В их исследовании кусочки, смоченные N-cadherin быстро и стабильно соединялись с ламеллоподиями, выпячивающимися из подвижных миобластов, экспрессирующих эндогенный N-cadherin. Однако, приложение тех же кусочков к телу клетки, которое экспрессирует одинаковые уровни N-cadherin, не ведет к стабильному связыванию, показывая тем самым, что N-cadherin-обусловленное связывание кусочков было более эффективным в ламеллоподиях. Т.о., три независимых исследования пришли к заключению, что инициальные кадхерином обусловленные контакты происходят в ламеллоподиях.

The Wnt pathway


Когда Wnt соединяется со своим рецептором, то инициированные сигналы, вызывают транскрипцию генов, которые регулируют клеточный рост и дифференцировку. β-catenin участвует в этом пути в качестве гетеродимера с T-cell factor (TCF) транскрипционными факторами. В отсутствие Wnt сигнала цитозольный β-catenin деградирует посредством пути, который зависит от adenomatous polyposis coli (APC). Однако, после стимуляции пути Wnt цитозольный β-catenin стабилизируется. Путь Wnt тонко регулируется в нормальных клетках, но его регуляция часто нарушается во время туморогенеза [23].
Т.к. связывание β-catenin с кадхеринами и с TCF взаимно исключительно, то кадхерины д. регулировать передачу сигналов Wnt путём секвестрации β-catenin. Ben-Ze'ev и др. проверяли эту идею, трансфицируя фрагменты цитоплазматического домена Drosophila E-cadherin в 293T клетки и тестируя их способность ингибировать β-catenin-TCF-обусловленную транскрипционную активность [24]. Было установлено, что фрагменты цитоплазматического домена E-cadherin самые маленькие в 26 аминокислот оказались эффективными ингибиторами до тех пор, пока они сохраняли способность ко-иммунопреципитироваться с β-catenin.
Foisner и др. идентифицировали систему, в которой E-cadherin м. регулировать эндогенную транскрипционную активность β-catenin-TCF [25]. Эпителиальные клетки молочных желез мышей, экспрессирующие слитый белок, состоящий из c-Fos и estrogen рецептора, формируют эпителиальный монослой в культуре. Если c-Fos активируется с помощью добавления estradiol, то клетки подвергаются классическому эпителиально-мезенхимному переходу (EMT). Экспрессия E-cadherin теряется и β-catenin-TCF транскрипционная активность повышается. Временная трансфекция полной длины E-cadherin в мезенхимные клетки снижает эту транскрипционную активность. Foisner's лаб. использовала эту экспериментальную систему, чтобы показать, что эктопическая экспрессия фрагмента E-cadherin, который сохраняет свой β-catenin-связывающий сайт, не только снижает транскрипционную активность β-catenin-TCF, но и также супрессирует рост этих клеток [26]. Эта экспериментальная система EMT воспроизводит изменения, которые происходят во время туморогенеза и эти авт. полагают, что потеря E-cadherin опухолевыми клетками возможно стимулирует передачу сигналов β-catenin-TCF и тем самым усиливает клеточную пролиферацию.
Schutte и др. предположили, что если E-cadherin участвует в пути Wnt в раке молочных желез у людей, то клеточные линии, которые мутантны по E-cadherin, так что β-catenin не соединяется или так, что транскрипционно замалчиваемый ген E-cadherin д. вызывать конституитивную β-catenin-TCF обусловливаемую транскрипцию [27]. Они проверяли эту гипотезу, оценивая транскрипционную активность TCF чувствительного репортёрного гена в 15 клеточных линиях, включая 6 E-cadherin-мутантных клеточные линии и 4 клеточные линии с транскрипционным молчанием гена E-cadherin. Ни одна из клеточных линий не обнаруживала TCF-обусловливаемой транскрипционной активности, это привело к заключению, что E-cadherin не участвует в Wnt пути в раковых клетках молочных желез человека.
История м.б. несколько иной при раке толстого кишечника. APC является белком, который играет существенную роль в регуляции цитозольного пула β-catenin, и раковые клетки колона часто имеют мутации потери функции в APC, которые обусловливают накопление цитозольного β-catenin. В лаб. Gumbiner использовали клетки SW480 карциномы колона с мутантным APC для выявления, м. ли E-cadherin модулировать передачу сигналов Wnt [28]. Когда они трансфицировали конструкцию E-cadherin в клетки SW480, то передача сигналов β-catenin-TCF ингибировалась и рост клеток супрессировался. Эта активность была adhesion-зависимой и чтобы быть активированной конструкция д. сохранять β-catenin-связывающий сайт. Т.к. клетки SW480 значительно избыточно экспрессировали β-catenin, а трансфицированный E-cadherin секвестрировал только небольшую пропорцию цитозольного β-catenin, то авт. пришли к выводу, что только фракция от общего β-catenin используется для передачи сигналов и что эта фракция специфически снижается при избыточной экспрессии E-cadherin. Это исследование предоставляет строгие доказательства того, что кадхерины м. модулировать Wnt путь в клетках карциномы колона. Как и при cadherin-опосредованной передаче сигналов Rho, эффект кадхеринов на передачу сигналов Wnt оказывается зависимым и cadherin и от клеточного контекста.

Signaling through receptor tyrosine kinases


В нескольких исследованиях было предположена ассоциация между кадхеринами и рецепторными тирозин киназами и и становится ясным, что эти молекулы реципрокно регулируют др. активности. Наиболее обширные исследования проведены группами Walsh и Doherty и было подтверждено, что N-cadherin облегчает димеризацию рецепторов fibroblast growth factor (FGF), чтобы инициировать независимую от ростового фактора передачу сигнала. growth-factor-independent signal. Подход, разработанный этой группой связан с выростами нейритов из культивируемых нейронов в ответ на передачу сигналов FGF. Сначала они установили, что засеивание нейронов на N-cadherin субстраты м. индуцировать вырост нейритов в отсутствие ростового фактора и что эти выросты зависят от передачи сигналов рецепторами FGF вниз [29,30]. Далее было показано, что растворимый N-cadherin м. стимулировать выросты нейритов, если добавляется в среду культивируемых нейронов [31]. Авт. использовали доминантно-негативную конструкцию FGF-рецепторов, чтобы показать, что N-cadherin-обусловленные выросты зависят от нижестоящей передачи сигналов от рецепторов. В лаб. Doherty эти исследования были расширены и показали, что пептиды, предназначенные для димеризации N-cadherin также индуцируют выросты нейритов [32]. Кроме того, антитела, которые предупреждают взаимодействия N-cadherin-FGF-рецепторы, ингибируют пептидами-стимулируемые выросты нейритов. Эти два исследования важны, т.к. они показывают, что cis димеризация N-cadherin активирует зависимую от FGF-рецепторов передачу сигналов и демонстрируют, что N-cadherin опосредованная передача сигналов является самостоятельной по сравнению с его адгезивной активностью. Ранние исследования в нашей лаб. и лаб. Hazan подтвердили, что N-cadherin влияет на поведение опухолевых клеток посредством взаимодействия с FGF рецепторами [33-35]. Некоторые эпителиальные опухолевые клетки экспрессируют N-cadherin и эти клетки обнаруживают тенденцию к большей агрессии, чем клетки, экспрессирующие E-cadherin [36]. В нашей лаб. показано, что нижестоящие ингибиторы передачи сигналов FGF-рецепторами редуцируют N-cadherin-обусловленную инвазию, подтверждая тем самым участие N-cadherin в активации передачи сигналов через FGF рецепторы, это согласуется с находками групп Walsh и Doherty. Далее мы установили. что внеклеточный домен 4 N-cadherin необходим и достаточен для этой активности и предположили, что он м. взаимодействовать непосредственно с FGF рецептором [33]. В соответствии с этим Doherty и др. показали, что внеклеточный домен 4 N-cadherin необходим для выроста нейритов [32]. Интересно, что в лаб. Hazan's недавно было показано, что N-cadherin участвует также в лиганд-зависимой передаче сигналов FGF-рецепторами [37]. Было показано, что взаимодействия N-cadherin с FGF рецепторами удлиняют передачу сигналов за счёт стабилизации рецепторов фактора роста на клеточной поверхности. Т.о., N-cadherin м. участвовать и в лиганд-зависимых и в лиганд-независимых взаимодействиях с FGF рецепторами.
Pece и Gutkind сообщили, что E-cadherin м. индуцировать лиганд-независимую активацию MAP kinase [14]. В данном номере в исследовании Braga обсуждается, как Rac1 активируется в течение минут после cadherin контакта в кератиноцитах [15]. Они показали, что ингибирование передачи сигналов EGF рецепторами предупреждает активацию Rac1. Одной из возможностей является то, что E-cadherin контакт стимулирует передачу сигналов EGF рецепторами, что является результатом активации Rac1. Интересно, что и N-cadherin-обусловленная передача сигналов FGF рецепторами и E-cadherin-обусловленная передача сигналов EGF рецепторами зависят от каталитической активности рецепторов факторов роста, но м.б. независимы от лиганда, подтверждая тем самым, что кадхерины м.б. способны к узурпации классических путей передачи сигналов рецепторными тирозин киназами, чтобы модулировать клеточное поведение. В ранних исследованиях Dejana и др. было показано, что нулевые по VE-cadherin мыши были дефицитны по передаче сигналов vascular endothelial growth factor (VEGF)38]. Эти авт. показали, что VEGF рецепторы обнаруживаются в комплексе с VE-cadherin, β-catenin и PI3 kinase и что формирование комплекса зависит от VEGF соединения со своим рецептором. Недавние исследования этой группы показали, что обработка эндотелиальных клеток VEGF стимулирует взаимодействия между VE-cadherin и VEGF рецепторами, это приводи в результате к фосфорилированию тирозина и в рецепторах и в VE-cadherin [39]. Фосфорилированный по тирозину VE-cadherin ко-иммунопреципитируется с адапторным белком Shc. Кроме того, фосфорилирование Shc с помощью VEGF рецепторов сохраняется дольше в нулевых по VE-cadherin клетках, подтверждая тем самым, что VE-cadherin негативно регулирует фосфорилирование Shc с помощью активированных VEGF рецепторов. Эти авт. предположили, что соединение VE-cadherin с Shc способствует их дефосфорилированию, вообще-то, посредством ассоциированных фосфатаз. Resnick и др. использовали VE-cadherin-нулевые эндотелиальные клетки, чтобы показать, что физиологическая роль взаимодействий между VEGF рецепторами и VE-cadherin м.б. трансдуцирована sheer стрессовые сигналы, получаемые этими клетками, когда кровоток проходит через эндотелиальную выстилку сосудов [40].

Conclusions


We have discussed three signaling pathways that are impacted by cadherins. In each case, the propagated signals are both cadherin-dependent и cell-contextdependent. Thus, it is becoming increasingly clear that although the molecular organization of the cadherin/catenin complexes appear to be similar in different cell contexts, cells receive different information from different cadherins и also process the information differently depending on cell type.
Сайт создан в системе uCoz