Посещений:
Эндосомы

Роль в Передаче Сигналов

Not just a sink: endosomes in control of signal transduction
Marta Miaczynska1, Lucas Pelkmans and Marino Zerial
Current Opinion in Cell Biology 2004, 16:400–406

Recent studies indicate that endocytic organelles can play a more active role in signal propagation and amplification than was recognised before. By deciphering the interplay between endocytosis and signalling, we will be able to gain a more sophisticated level of understanding of signal transduction mechanisms.
Клетки обладают разработанной и высоко структуированной кухней трансдукции сигналов, чтобы транслировать реакции на внешние стимулы в запрограммированные изменения экспрессии генов. Классическая модель передачи сигналов использует рецепторы, пронизывающие плазматичекую мембрану, которые после соединения с внеклеточными лигандами (напр., факторами роста или гормонами) на клеточной поверхности активируют вторичные мессенджеры в цитозоле, что позволяет распространять сигнал в ядро. Эндоцитоз известен давно как средство для прекращения передачи сигналов посредством деградации активированных рецепторных комплексов после их интернализации с клеточной поверхности. Поэтому эндоцитоз рассматривался как средство 'sink' сигнальных комплексов, внимание в основном было сконцентрировано на идентификации компонентов каскадов сигнальной трансдукции и их взаимодействий. Однако, стало ясным, что исход сигнальных процессов зависит не только от активации определенных наборов сигнальных молекул, нол и также от того, где и как долго сигнал испускается. Новые находки указывают на то, что сигнальная кухня м. достигать регуляции высокого порядка благодаря использованию компартментализации и функциональной специализации эндоцитотических путей, ведущих за пределы их стандартной роли по деградации груза. Эндосомы, по-видимому, идеально приспособлены для подобной регуляции, т.к. они организованы в сети физически и биохимически самостоятельных мембранных доменов, взаимосвязанных с помощью тонко контролируемой транспортной системой (Рис. 1) [1-4].



Signalling in endocytic compartments. Targeting of ligand–receptor complexes into different endocytic domains and compartments is proposed to directly regulate signal transduction through localized assembly of specific effector complexes. On the plasma membrane, receptors such as EGFR (magenta), TGF-β R (black) or GPCR (yellow) are present in non-raft, raft or caveolar domains. Upon ligand binding they undergo internalisation into various types of endocytic organelles, early endosomes, caveosomes or APPL-positive endosomes. Since the endocytic compartments are composed of distinct domains, including Rab-domains, rafts and caveolar domains (marked with different colours), the signalling output will depend on the local membrane environment. Sorting determinants on ligand–receptor complexes direct them to degradation (EGFR, TGF-β R) or along the recycling pathway (GPCRs). GPCR signalling continues post-internalisation through association with β-arrestins. EGFR signalling occurs throughout the endocytic journey, on early endosomes (via mSOS-Shc-Eps8), APPL endosomes (via APPL) and late endosomes (via p14-MP1). TGF-β R signals via SARA and Smad2 on early endosomes but remains inactive in caveolar domains or caveosomes. Importantly, TGF-β signalling through the interaction with SARA is restricted to a Rab5-domain on early endosomes enriched in PI(3)P. Other Rab-domains (Rab4 and Rab11 domains) in early and recycling endosomes may exclude SARA, and thus may not be signalling-competent because of the lack of PI(3)P. Magenta, black and yellow arrows represent the trafficking of EGFRs, TGF-β Rs or GPCRs, respectively.

Эндосомные белки не случайно распределены, а локализованы в специфических доменах, которые организованы мозаичным образом. Подтверждено предположение, что эндоцитотические органеллы м. играть непосредственную роль в распространении и амплификации сигналов (см. Dudu, Pantazis and Gonzalez-Gaitan в этом номере).

The concept of signalling from endosomes


Превалирует мнение, что передача сигналов происходит только на плазматической мембране. Bergeron, Posner и др., наблюдали, что вскоре после добавления лиганда большинство активированных epidermal growth factor receptors (EGFRs) и их нижестоящих сигнальных факторов, таких как Shc, Grb2 и mSOS, обнаруживаются не на плазматической мембране, а в ранних эндосомах [5], указывая н то, что передача сигналов EGFR продолжается с этого компартмента [6]. Далее было продемонстрировано, что nerve growth factor (NGF) соединяется со своим активированным рецептором TrkA и phospholipase C-γ1 (PLC-γ1) в эндоцитотических органеллах [7], то привело к выдвижению гипотезы 'signalling endosomes'. Однако, присутствие сигнальных комплексов в эндосомах спорно и м. отражать транспортные промежуточные образования на пути к лизосомной деградации. По этой причине и из-за того, что сигнальные события на плазматической мембране всегда предшествуют тем, что происходят в эндосомах, участием эндоцитоза в передаче сигналов в основном пренебрегли. Однако, Schmid и др. продемонстрировали, что продолжительное пребывание активированных EGFR на плазматической мембране ведет к снижению активности некоторых нижестоящих сигнальных компонентов, таких как mitogen-activated protein kinases (MAPKs) ERK1/2 или p85 субъединицы phosphatidylinositol 3-kinase (PI3-K) [8]. Сходное снижение активации MAPK

наблюдается после ингибирования эндоцитоза β2-adrenergic receptor (b2-AR), члена семейства G-protein-coupled receptor (GPCRs)[9]. Эти данные указывают на то, что некоторые нижестоящие каскады преимущественно активируются после интернализации комплексов лиганд-рецептор в эндосомные компартменты. Сходным образом, EGFR взаимодействует в эндосомах с Grb2, инициатором передачи сигналов Ras и MAPK, демонстрируя, что передача сигналов м. в принципе продолжаться и после эндоцитоза [10]. Компьютерное моделирование динамики передачи сигналов EGF посредством каскада MAPK предсказывает, что при низких (физиологических) концентрациях лиганда интернализованные EGFR продолжают передавать сигналы и вносят существенный вклад в общую клеточную реакцию [11].
Дополнительные биохимические доказательства роли эндосом в распространении сигналов EGF и platelet-derived growth factor (PDGF) получены при использовании специфических обратимых ингибиторов EGFR и PDGFR tyrosine kinases, чтобы вызывать интернализацию лигандов. связанных с неактивными не фосфорилированными рецепторами [12,13,14]. Эти комплексы были затем специфически активированы в эндосомах отмыванием ингибитора и они оказались способными рекрутировать сигнальные молекулы и вызывать биологические реакции. Интересно, что исследования, описывающие селективную изоляцию интернализованных EGFR с помощью обратимо biotinylated антител [15], показали, что хотя и plasma-membrane и эндосомные пулы EGFR остаются активными, но некоторые нижестоящие сигнальные молекулы преимущественно ассоциируют с одним из этих пулов, напр., Grb2 с поверхностным, а Eps8 с эндосомным пулом EGFR. Эти данные подчеркивают качественные отличия в передаче сигналов, испускаемых из этих двух мест. Но возникает вопрос, почему и с помощью каких механизмов д. эндосомы вовлекаться в распространение сигналов через цитоплазму в ядро.

Why signalling via endosomes?


Temporal regulation


Одной из очевидных ролей эндоцитоза в передаче сигналов является временная регуляция, т.к. продолжительность передачи сигналов является важным параметром, предопределяющим биологический исход. biological output. Продолжительность жизни сигнальных комплексов, собранных после активации рецепторов плазматической мембраны зависит от нескольких параметров, включая кинетику интернализации рецепторов и их последующего предназначения после попадания в эндосомы. Продолжительность сигнального процесса зависит от пропорции рецепторов, подвергающихся деградации по сравнению с теми, что подвергаются рециклингу в плазматическую мембрану [16,17]. Даже внутри одного семейства рецепторов эти параметры м. существенно различаться. Напр., после связывания EGF, EGFR (ErbB1) быстро интернализуются в эндосомы, где они остаются активными в течение нескольких мин. перед сортировкой в лизосомы для деградации, со значительной пропорцией (25-30%) подвергающихся рециклингу [17,18]. В противоположность ErbB1, которые, по-видимому передают сигналы из эндосом в течение большей части их жизни в активном состоянии, др. члены семейства (ErbB2, -3 и -4) подвергаются эндоцитозу очень неэффективно после воздействия EGF, оставаясь активными в течение длительного периода времени на плазматической мембране. Димеризация между разными молекулами ErbB модифицирует их trafficking свойства еще сильнее, затрагивая продолжительность передачи сигналов с плазматической мембраны по сравнению с эндосомами. Разные кинетики транспорта м. объяснить наблюдаемые различия в реакции на передачу сигналов [17,19-21]. Кроме того, разные лиганды для EGFR/ErbB рецепторов, такие как EGF или transforming growth factor-α (TGF-α), обнаруживают дифференциальную чувствительность к кислому эндосомному pH, который влияет на их диссоциацию от рецепторов и, как следствие, на их внутриклеточный перенос [22].
В др. примере кинетика агонистами-стимулируемой интернализации и транспорта вдоль эндоцитотических путей отличается у разных членов семейства GPCR. В целом воздействие агонистов вызывает фосфорилирование GPCR и соединение с β-arrestins, приводящими в результате к десенсибилизации и интернализации рецепторов [23,24]. β-arrestins действуют в качестве каркасов для внутриклеточной сборки сигнальных комплексов, включая компоненты путей MAPK и c-Jun amino-terminal kinase 3 (JNK3) [25]. Диссоциация β-arrestins делает возможным рециклинг GPCR посредством Rab4- и Rab11-зависимых механизмов (Рис. 1) или отправку в лизосомы [26]. Сродство β-arrestins с определенными GPCR регулирует, какой маршрут выберет рецептор и продолжительность их жизни в эндосомах [27,28], это дает возможное объяснение, почему разные GPCRs зависят в разной степени от эндоцитоза в осуществлении своих внутриклеточных реакций.

Targeting signalling complexes to their site of action


Общение между эндоцитотическими органеллами нуждается в actin- и microtubule-зависящей подвижности [1,29,30]. В ответ на факторы роста эндосомы м. модифицировать свои свойства подвижности за счет локальных изменений в цитоскелете, напр.. посредством эндосомных Rho белков, их эффекторов и Src-kinases [31]. Перемещение ранних эндосом по микротрубочкам имеет отношение к Rab5 и PI3-K [1]. Учитывая их способность стимулировать Rab5 и PI3-K, очевидно, что сигнальные молекулы м. модулировать рекрутирование или активность микротубулярных моторов эндосом, регулируя тем самым их подвижность и внутриклеточное распределение. Перемещение эндосом м. направлять активированные сигнальные молекулы к их сайтам-мишеням [32]. Напр., протеин киназы и фосфатазы оказывают противоположные эффекты на сигнальные каскады, а математическое моделирование предсказывает драматическое снижение активных фосфорилированных видов по мере удаления от плазматической мембраны к ядру [33,34]. Это свидетельствует о необходимости мембранных устройств, т.е. эндосом, чтобы транспортировать активные сигнальные комплексы к местам их действия прежде, чем они будут инактивированы. Особенно нагляден случай с нейронами, где сигналы от окончаний аксонов д. пройти длинную дистанцию , чтобы достичь тела клетки. Здесь простая диффузия через цитоплазму не достаточна для переноса сигналов. Передача сигналов облегчается с помощью базирующегося на микротрубочках ретроградного транспорта сигнальных комплексов в эндоцитотических пузырьках, с NGF, соединенными со своими рецепторами TrkA [35]. Эти пузырьки выделены из нейронов ганглиев дорсальных корешков [36], они соответствовали ранним эндосомам, т.к. содержали Rab5 и его эффектор EEA1 [1] и несли компетентные сигнальные комплексы (включая phospho-ERK1/2, phospho-MEK1, phospho-MAPK p38, B-Raf, Gab2 и Rap1). Более того, интернализация NGF-TrkA и их ретроградный транспорт, как было показано, необходимы для выживаемости нейронов, возможно благодаря тому, что активность TrkA kinase м. поддерживаться в эндосомах, когда они перемещаются вдоль аксона [37]. Интересно, что такой активный транспорт способен генерировать разные сигнальные исходы в зависимости от локализации; напр., локальные, вызываемые сигналами, продуцируемыми в месте стимуляции в нервных окончаниях, или генерализованные клеточные реакции, вызванные в теле клетки [38].
Несмотря на ретроградный везикулярный транспорт NGF-TrkA, существуют альтернативные модели для распространения сигнала NGF (reviewed in [35,39,40]). Модель 'domino' или 'wave propagation' предусматривает быстрое латеральное распространение фосфорилирования TrkA вдоль плазматической мембраны аксона, инициируемое связыванием NGF в окончаниях, но распространение происходит лиганд-независимым способом [41]. Сходная волна латерального фосфорилирвоания рецепторов становится видимой при флюоресценином imaging после фокальной стимуляции EGFR в не-нейрональных клетках [42]. Др. модель 'retrograde effector' предполагает, что сигнальные молекулы, активированные с помощью NGF-TrkA достигают тела клетки независимо от комплексов лиганд-рецептор. Подтверждение не-эндосомной передачи сигналов NGF получено в исследовании, где окончания аксонов стимулировали фокально с помощью кусочков, покрытых NGF, которые не м. интернализоваться, но были способны влиять на жизнеспособность нейронов [43]. Хотя NGF кусочки вызывают активацию TrkA и Akt, фосфорилирование MAPK было тем не менее нарушено в этих условиях, демонстрируя снова роль эндосомного таргетинга в избирательной активации сигнальных путей. В целом. данные по действию NGF строго подтверждают, что передача сигналов от эндосом имеет функциональное значение. хотя др. механизмы м. действовать параллельно. Эта парадигма, как ожидается, оперирует также в не-нейрональных клетках в ответ на факторы, иные чем NGF [34]. Примеры с нейронами указывают на то. что эндосомы, с их зависимой от цитоскелета подвижностью, идеально приспособлены для точного, направленного и контролируемого высвобождения сигнальных комплексов в специфических клеточных местах, функция, которая не м.б. воспроизведена и аккуратно достигнута с помощью механизмов распространения сигнальной волны или диффузии.

Spatial regulation


Учитывая, что некоторые цитоплазматические сигнальные молекулы являются общими для разных путей, то как предупреждается неспецифическое общение между этими путями? Нежелательные взаимодействия м.б. устранены с помощью ограничения сигнальных каскадов в пространстве. Помимо действия в качестве транспортных переносчиков на длинные расстояния эндосомы м. обеспечивать два дополнительных взаимосвязанных уровня контроля: избирательная доставка сигнальных молекул к специфическим органеллам и их сегрегацию в субдомены внутри данной органеллы. Хорошо известно, что мембранные субдомены, участвующие в передаче сигналов, являются иммунологическими синапсами в лимфоцитах [44] и сайтами фокальных адгезий в эпителиальных клетках [45]. Др., более общий тип, субдоменов, присутствующих в большинстве клеточных мембран, базируется на биофизических свойствах определенных вилдов липидов. Во внеклеточном листке мембранного бислоя насыщенные glycosphingolipids м. соединяться и формировать жидкие упорядоченные домены, в которые интеркалирован холестерол, называемые липидными плотиками (rafts) [46]. Сходные микродомены, по-видимому. существуют и в цитозольном листке и они, по-видимому, связаны с платформами в наружном листке [47]. Интересно, что некоторые сигнальные молекулы, включая рецепторные тирозин киназы, GPI-закрепленные сигнальные молекулы, определенные члены семейства Ras и lipid-модифицирующие молекулы, подобно большинству киназ семейства Src, обладают высоким сродством к липидным плотикам. С помощью регуляции разделения на части сигнальных компонент в липидные плотики, сигнальные каскады м.б. или инициированы или закончены [48]. Специализированная форма липидных плотиков присутствует в большинстве типов клеток, называемая кавеолоами, это маленькие фляжко-образные инвагинации, стабилизированные с помощью олигомеров caveolin-1, принципиальных структурных компонентов кавеол [49]. Помимо своей структурной роли, caveolin-1, как полагают, рекрутирует некоторые сигнальные белки посредством своего каркасного (scaffolding) домена [50]. Хотя точный механизм остаётся неясным, несмотря на это вполне возможно, что сигнальные каскады м. регулироваться посредством рекрутирования сигнальных молекул в кавеолы. Напр., кавеолы, по-видимому, негативно регулируют сигнальные функции EGFR, PDGFR, GPCRs и nitric oxide synthase путем предупреждения их взаимодействий с нижестоящими эффекторами [51]. Т.к. липидные платформы и caveolin-1-позитивные структуры перемещаются с помощью эндоцитотических и экзоцитотических компартментов, то разделение на части сигнальных молекул в этих микродоменах, м.б. общим механизмом, оперирующим в большинстве внутриклеточных органелл. Фактически, убедительный случай роли кавеол в передаче сигналов связан с их способностью интернализоваться [52]. Когда кавеолы интернализуются, то они м.б. доставлены к внутриклеточным органеллам, богатым caveolin-1, называемыми caveosomes. Caveosomes обладают и просветной средой и мембранными характеристиками, которые отличают их от ранних или поздних эндосом [53]. Интересно, что , по-видимому, избирательная доставка или в caveosomes или ранне эндосомы, специфически модулирует передачу сигналов с помощью TGF-β рецепторов [54]. В сигнальной сети TGF-β, SARA (Smad anchor for receptor activation) специфически рекрутируется в Rab5-домен ранних эндосом, обогащенный phosphatidylinositol 3-phosphate (PI(3)P) [55,56] (Рис. 1). Интересно, что SARA, по-видимому, играет двойную роль в эндосомах, регулируя и доставку грузов посредством Rab5 компартмента и рецепторную передачу сигналов из этого домена [57,58]. Вовлечение TGF-β рецепторов с помощью SARA необходимо, чтобы фосфорилировать Smad2 и достичь последующего распространения сигнала, это объясняет, почему интернализация TGF-β рецепторов в ранние эндосомы необходима для собственно передачи сигналов. В caveosomes, однако, TGF-β рецепторы не встречаются с SARA и остаются неактивными. Интригующим наблюдением является то, что экспрессия постоянно неактивного Rab5 (Rab5S34N) стимулирует передачу сигналов TGF-β, тогда как экспрессия постоянно активного Rab5 (Rab5Q79L) не оказывает влияния [57]. Одна из возможностей заключается в том, что ингибирование Rab5 м. модифицировать транспорт TGF-β рецепторов между caveosomes и ранними эндосомами, тем самым подчеркивается влияние транспорта на передачу сигналов.
Scaffold факторы м. играть важную роль в передаче сигналов путем регуляции трафика сигнальных рецепторов и/или активности нижестоящих сигнальных компонентов, таких как MAPK [25,32]. Интересно, что эти молекулы м. также специфически локализовать сигнальные комплексы в эндоцитотических компартментах. Huber и др. идентифицировали белок поздних эндосом p14, который необходим для эффективной передачи сигналов EGF в каскаде ERK [59]. Локализация MP1-MAPK каркаса в поздних эндосомах с помощью p14 (Рис. 1) необходима для полной активации ERK1/2 в поздней фазе передачи сигналов после инициальной активации в плазматической мембране. Интересно, что неправильная доставка p14-MP1 в плазматическую мембрану не м. компенсировать отсутствие эндосомной передачи сигналов, это указывает на то, что поздние эндосомы обеспечивают уникальную платформу для распространения сигналов.
Во время своего эндоцитотического маршрута рецепторы. предназначенные для деградации. такие как EGFR, секвестрируются во внутренних пузырьках, которые образуются из ограничивающих мембран эндосомных вакуолей, процесс, который стартует в ранних эндосомах и ведет к формированию мультивезикулярных телец и поздних эндосом [60]. Т.к. рецепторы во внутриэндосомных пузырьках считаются неактивными, то передача сигналов д. происходить в течение временного промежутка транспорта иежду плазматической мембраной и включением во внутрипросветные домены. Важно учитывать, однако, что intra-lumenal сортировка белков прочь от цитоплазмы не всегда приводит к деградации, т.к. внутренние пузырьки, содержащие MHC class II молекулы, м.б. использованы в качестве контейнеров для хранения, которые сливаются обратно с ограничивающей мембраной [61]. Путем модулирования баланса между активными сигнальными комплексами на ограничивающей наружной мембране и секвестрированными неактивными молекулами во внутренних пузырьках, поздние эндосомы м. обеспечивать еще один механизм, чтобы регулировать качество и продолжительность сигнала.
Были ли первоначальные эндосомы первоначально лишены сигнальных функций? Эндоцитотическая структура заметно отличается от канонических ранних эндосом и содержит малую GTPase Rab5 вместе с её двумя эффекторами APPL1 и APPL2, недавно была идентифицирована как промежуточная в передаче сигналов между плазматической мембраной и ядром [62]. Белки APPL существенны для клеточной пролиферации, способны к снованию между ядром и цитоплазмой в ответ на EGF или оксидативные стрессы и ассоциируют непосредственно с ядерными белками (NuRD/MeCP1 комплекс). Др. эндоцитотические белки, такие как eps15, epsin1, CALM (clathrin assembly lymphoid myeloid leukemia) и α-adaptin, как было показно ранее, подвергаются транслокации из плазматической мембраны в ядро [63]. Напротив, локализация белков APPL в до сих пор не описанной популяции эндоцитотических мембран, вместе с их существенной ролью в митогенезе, указывает на то, что определенные реакции на пути передачи сигналов EGF м.б. запущены из субнабора специализированных эндосом.

Conclusions and future prospects


The data available so far demonstrate that signal transduction occurring from endosomes has functional importance, although different modes of signal propagation may co-exist for a given stimulus in the same cell and different signalling systems may depend on endosomes to various degrees [23,34]. By sorting and trafficking ligand–receptor complexes within defined timeframes, endosomes provide temporal control of signal transduction. Activated plasma membrane receptors can be internalised via several routes (e.g. clathrin-mediated, caveolin-dependent, clathrin- and caveolin-independent, macropinocytosis) into different types of endosomes (e.g. EEA1- or APPL-positive ones). By providing a platform for compartment-specific molecular interactions leading to the assembly of unique signalling complexes, endosomes also add a level of spatial control to signal propagation events. Targeting to different endosomes or even distinct membrane subdomains within the same endosome can determine specific cellular responses. From this point of view, metabolic networks provide a good example of how compartmentalisation is essential for the correct flow of enzymatic reactions [64]. Moreover, the same membrane–cytoskeleton interactions that regulate the position of endosomes within the cell can be exploited for the generation of localized signal transduction responses, thus providing an advantage over diffusion- or lateral-wave-propagation-based mechanisms. Although in the past few years the interface between endocytosis and signalling has been actively explored, we still do not know how preferential activation of particular signalling cascades on endosomes translates into specific biological responses. Determining the subcellular localisation of signalling components and their interactions with respect to the subdomain organisation of endosomes is bound to reveal new insights into how signalling networks operate. It remains to be clarified whether and how sorting of receptor complexes into intra-endosomal vesicles during the formation of multivesicular bodies correlates with the termination of endosomal signalling. Furthermore, it is clear that responses generated shortly after growth factor exposure are not limited only to the plasma membrane and endosomes. Intriguingly, upon receptor tyrosine kinase endocytosis, phosphatidylinositol- 3,4,5-triphosphate is produced on endoplasmic reticulum (ER) and Golgi membranes [65]. Similarly, the ER appears to be a site of EGFR and PDGFR dephosphorylation following their internalisation [66]. In addition to its established role on the plasma membrane and more recently recognised function in endosomes ([67,68]; reviewed in [69]), Ras is localized to the ER and Golgi complex where it can be activated by specific exchange factors [70]. Dynamic interactions between the ER, the plasma membrane and the endosomal system contribute to phagosome formation and antigen cross-presentation in macrophages and dendritic cells [71–73], thus underscoring the plasticity of these compartments under different physiological conditions. These observations raise the intriguing question of how the extensive communication between endosomes and the organelles of the biosynthetic pathway contributes to the repertoire of regulatory mechanisms of the cellular signalling machinery.
Сайт создан в системе uCoz