Раскопки показали, что дикообразы (ежи) (hedgehogs) преодолевали Берингов пролив посредством мостика из суши дважды в истории и оказались вымершими в Сев. Америке во второй раз примерно 10 миллионов лет назад¹. Ген hedgehog (hh) был идентифицирован сравнительно недавно в Европе благодаря генетическому скринингу, который имел целью понять процесс сегментации тела у Drosophila melanogaster². Потеря секретируемого сигнального белка, который кодируется hh обусловливает у эмбрионов D. melanogaster формирование колючих небольших комочков (balls). ORTHOLOGUES гена hh у позвоночных вскоре были открыты ис Сев. Америке и Европе^3-7, т.е. — Hh белки в отличие от ежей присутствуют на всех континентах.

Путь передачи сигналов Hh влияет на транскрипцию многих генов мишеней, которые варьируют от ткани к ткани, от клетки к клетке и у разных phyla. Он участвует в развитии многочисленных тканей и органов⁸. Одним из драматических эффектов снижения передачи сигналов Hh у эмбрионов человека является cyclopia (образование только одного глаза),которая является одной из форм HOLOPROSENCEPHALY. У взрослых передача сигналов Hh управляет образованием или персистенцией определенных популяций стволовых и клеток предшественников^9-13. Повышенная передача сигналов Hh в некоторых органах может приводить к раку — кожи, мозжечка, мышц, ЖКТ, поджелудочной железы или простаты¹⁴. Аспекты Hh биологии, которые недавно были рассмотрены, включают: многочисленные роли в развитии, болезнях и раке⁸ (см. Box 1); его уникальный способ передачи сигналов¹⁵; и связи с эволюционно кажущимися старыми белками, которые сообщают о эволюционном происхождении Hh сигнального пути¹⁶. Hh сигналы воспринимаются, трансдуцируются и интерпретируются, используя клеточную кухню, которая в основном консервативна во время дивергентной эволюции насекомых и млекопитающих. Вновь идентифицированные компоненты сигнальной трансдукции Hh и взаимоотношения между этими компонентами являются предметом данного обзора.

Hh signalling in Drosophila melanogaster

Схема передачи сигналов Hh, как она описана у D. melanogaster, показана на Рис. 1 (Ref. 15). Основным результатом передачи сигналов Hh является модуляция транскрипционных реакций, которые обеспечиваются с помощью zinc-finger транскрипционного фактора Cubitus interruptus (Ci). Путь сигнальной трансдукции регулирует продукцию или транскрипционного репрессора (CiR) или транскрипционного регулятора (CiA). В отсутствие Hh лиганда, клетки имеют небольшие количества 12-transmembrane рецептора Patched (Ptc). Ptc ингибирует активность второго трансмембранного белка, известного как Smoothened (Smo). В покоящихся клетках цитоплазматический хвост Smo взаимодействует с дивергентным KINESIN Costal-2 (Cos2), и оба Cos2 и Smo ассоциируют с эндосомами¹⁷. Cos2 является поддержкой для Complex I, который включает также Ci и 4 киназы: protein kinase A (PKA), casein kinase I (CKI), glycogen synthase kinase-3&β (GSK3&β) and a serine/threonine kinase известную как Fused (Fu)^18-20. В отсутствие Hh, компоненты Complex I способствуют фосфорилированию Ci. Фосфорилированный Ci может соединяться с Supernumerary limbs (Slmb)^21,
22, F-BOX PROTEIN, который является компонентом SCF UBIQUITIN E3 LIGASE COMPLEX. Это облегчает процессинг Ci в N-терминальный фрагмент, CiR, который содержит свой zinc-finger ДНК-связывающий домен, но который лишен ко-активирующеего связывающего домена. Необходимо установить, генерируется ли CiR в результате частичного переваривания в PROTEASOME или с помощью не идентифицированной протеазы. CiR затем перемещается в ядро и репрессирует транскрипцию генов мишеней. В покоящихся клетках, большая пропорция Ci не ассоциирует с Cos2 в Complex I, а вместо этого ассоциирует с Suppressor of Fused (Sufu) в Complex II (Ref. 23). Sufu ингибирует активность Ci путём удерживания Ci в цитоплазме^24-26, но не участвует в процессинге Ci в CiR.

Along comes Hh. Hh индуцирует передачу сигналов путем связывания Ptc. Связывание Hh инактивирует Ptc и удерживает Ptc от ингибирования Smo. Smo затем фосфорилируется с помощью PKA, GSK3beta и CKIalpha (REFS 27-29). Он накапливается и перемещается из внутриклеточных пузырьков в плазматическую мембрану. Complex I реконфигурируется так, что PKA, GSK3beta и CKIalpha диссоциируют и Complex I затем преимущественно ассоциирует с Complex II скорее, чем с микротрубочками и пузырьками (Refs 17,20,23,30). Более того, фосфорилирование и расщепление Ci прекращается. Активность киназы Fu в Complex I аннулирует действие Sufu в Complex II, а полной длины Ci, который возможно модифицируется ещё дальше, движется в ядро в виде CiA. CiA взаимодействует с транскрипционным ко-активатором CBP (CREB-binding protein), который активирует транскрипцию Hh генов мишеней.

Физические свойства CiA остаются дискуссионными. Полной длины Ci не полностью активен и избыточная экспрессия Ci не может индуцировать максимального ответа Hh. Накопление в ядре Ci недостаточно для его активации — leptomycin B, блокирующий ядерный экспорт, увеличивает количество ядерного Ci, но очень слобо активирует реакции Hh³¹. Простейшим механизмом активации Ci может быть его освобождение из Complexes I и II, хотя пост-трансляционные модификации также могут участвовать. Это согласуется с находками, что Ci постоянно активен в отсутствие Cos2 и Sufu. Это согласуется также с усовершенствованной кухней деградации, которая направлена против Ci, так что транскрипция гена репрессируется в отсутствие Hh^22,32-34.

4 важных пробелов в нашем понимании этого пути будут рассмотрены ниже детально. Во-первых, как количества Hh контролируются в тканях, так что этот мощный сигнал достигает соответствующих мишеней при соответствующих концентрациях? Во-вторых, как Ptc сообщается с Smo? В третьих, что такое активность Smo и как большинство изменений в Smo, которые запускаются с помощью Hh, приводит к активации передачи сигналов? В-четвертых, Cos2 является больше, чем только поддержкой для сигнального комплекса, но как он как он участвует в усилении активности Hh сигнального пути?

The Hh signalling pathway in vertebrates

Передача сигналов Hh у позвоночных имеет много общих свойств с теми, что имеются у D.melanogaster (rev. Ref. 8), хотя выявляются и четкие отличия (Table 1). Во-первых, семейства генов у млекопитающих представлены одиночными генами у D. melanogaster. Имеется три гена hh у млекопитающих, sonic, Indian и desert hedgehog (Shh, Ihh и Dhh); два ptc гена (Ptc1 и Ptc2); и три ci гомолога (Gli1, Gli2 и Gli3). Три hh гена экспрессируются в разных тканях и на разных стадиях развития и могут также обладать различными биологическими активностями. Экспрессия и функция Ptc1 сходна с таковой у D. melanogaster ptc — т.е., воспринимает Hh сигналы — тогда как экспрессия Ptc2 более ограничена и немногие фенотипы ассоциированы с его потерей³⁵. Пост-трансляционная регуляция Ci и GLI белков сходна. Каждый располагается в цитоплазматическом пуле. В отсутствие Hh, каждый удерживается в цитоплазме посредством Cos2 (KIF7 у позвоночных) и Sufu, чтобы ограничить транскрипционную активацию^24-26,36,37. Ci, GLI3, и возможно также GLI2, нуждаются в PKA и в SCF E3 ubiquitin ligase для процессинга до транскрипционного репрессора. Однако, каждый GLI белок выполняет и уникальную роль: GLI3 функционирует в основном как транскрипционный репрессор, GLI2 в основном как транскрипционный активатор, а GLI1 функционирует только как активатор транскрипции. Транскрипция Gli1 индуцируется с помощью Hh сигналов, которые создают позитивную регуляторную петлю, которая усиливает Hh ответы.

Наиболее важные отличия между D. melanogaster и позвоночными путями Hh затрагивают Smo, его регуляторы и его эффекторы. Последовтельность цитоплазматического хвоста Smo сильно отличается у позвоночных и D. melanogaster. Различия в его фосфорилировании и регуляции рассматриваются детальнее ниже. Весь KIF7 белок от рыбок данио имеет некоторые сходные последовательности с Cos2, и KIF7 м. связывать GLI1. Подобно Cos2, KIF7 необходим для репрессии реакции SHH³⁸, хотя он может отличаться от Cos2 в такой степени, в какой он необходим для полной активации реакции Hh. Другой kinesin и два ciliary белка (KIF3a и intraflagellar transport proteins IFT88 и IFT172) также обеспечивают Cos2-подобные функции у позвоночных, участвуя как в полной репрессии, так и в полной активации реакций Hh³⁹. Хотя вполне вероятно, что некоторые или все из них выполняют биохимическую роль(и) Cos2, но это необходимо подтвердить.

Некоторые гены пути Hh позвоночных не имеют известных ортологов у D.melanogaster; некоторые имеют ортологи, роль которых в передаче сигналов Hh не установлена; а некоторые имеют известные ортологи с др. функциями. Missing in metastasis (MIM), который известен также как BEG4, является актин-связывающим белком, который усиливает GLI-зависимую активацю транскрипции⁴⁰. Т.к. Mim транскрипционно индуцируется с помощью SHH, то он функционирует как позитивный регулятор, который подкрепляет активацию Hh генов мишеней подобно Gli1. Позитивные регуляторы сигнального пути Hh у позвоночных, которые, которые не имеют известных ортологов у мух, включают megalin, который принадлежит к low-density lipoprotein (LDL)-receptor-related семейству и связывает SHH⁴¹, и iguana, zinc-finger белок, который способствует ядерной локализации GLI1 (Refs 42,43). Негативные регуляторные факторы также отличают передачу сигналов Hh у позвоночных: FKBP8 является транскрипционным фактором, который противодействует действию SHH в нервной системе⁴⁴, тогда как SIL является цитозольным белком, который, по-видимому, функционирует ниже PTC45. Rab23 является регулятором везикулярных поставок (trafficking) и негативным регулятором реакции Hh⁴⁶. D. melanogaster Rab белки не участвуют в передаче сигналов Hh, но функция большинства из этих белков в пути Hh не тестировалась у D. melanogaster. Shifted (Shf) является секретируемым белком и является D. melanogaster ортологом человечьего Wnt inhibitory factor (WIF). Shf облегчает передачу сигналов Hh путём связывания Hh и HEPARAN-SULPHATE PROTEOGLYCANS , тогда как WIF связывает WNT PROTEINS и облегчает передачу сигналов Wnt^47-49.

По крайней мере, некоторые из обнаруженных различий между phyla являются результатом функциональной конвергенции негомологичных генов и белков. Мембранный гликопротеин млекопитающих Hh-interacting protein (HIP) и D.melanogaster Pxb не обнаруживают сходства последовательностей, но они могут выполнять одну и ту же функцию. Каждый является транскрипционной мишенью Hh и каждый участвует в негативной петле обратной связи, которая ослабляет реакцию Hh (HIP благодаря непосредственному связыванию SHH)^50,51. Главный вопрос, может ли стержневой аппарат сигнальной трансдукции работать тем же самым способом в двух phyla остается не решенным.

Hh as a concentration-dependent signal

В некоторых тканях, включая крылья D. melanogaster, Hh функционирует как MORPHOGEN, с разными величинами сигнала, вызывающими в реципиентных клетках приобретение ими разных судеб (Рис. 2). У D. melanogaster, зачатки крыльев, которые находятся в центре крыловых имагинальных дисков, представлены эпителиальным слоем. Белок Hh, секретируется клетками задней части крылового имагинального диска, тогда как Ptc продуцируется только передними клетками. Передние клетки отвечают на сигналы Hh активацией транскрипции генов мишеней, которые контролируют рост и формирование паттерна крыла. Перекрывающийся (nested) паттерн экспрессии генов мишеней указывает на то, что реакции Hh являются зависимыми от концентрации, это предположение было подтверждено с помощью манипуляций с концентрациями Hh и сродством Ptc рецепторов^52,53. Индукция гена мишени ptc требует промежуточных или высоких концентраций Hh, тогда как ген мишень decapentaplegic (dpp) индуцируется низкими концентрациями Hh. Эта дифференциальная чувствительность не является результатом различий сродства или количества сайтов, связывающих Ci в соответствующих промоторах, а вместо этого отражает дифференциальную реакцию не CiR в сравнении с CiA⁵⁴.

Передача сигналов Hh стимулирует продукцию как антагонистов, так и активаторов, которые образуют петли обратной связи, которые контролируют силу и продолжительность реакции на сигнал. Ген ptc всегда активируется с помощью сигнала Hh, так что транскрипция ptc является прекрасным указателем на восприятие Hh сигнала клетками у D. melanogaster и позвоночных. Ptc противодействует действию Hh путём ингибирования Smo и путем соединения с Hh и транспортировки его в лизосомы для деградации, как только индукция продукции HIP может связывать и инактивировать Shh. Так, Hh запускает негативную петлю обратной связи, с помощью которой накапливается Ptc, а HIP ослабляет эффект продолжающегося сигнала Hh. Система обратной связи гарантирует, что передача сигналов Hh будет стабильной и воспроизводимой. Любое случайное снижение количества Hh будет компенсироваться за счёт понижения количества его белков антагонистов, тогда как любое увеличение будет сбалансировано более высокой индукцией антагонистов. Запаздывание между индукцией генов мишеней с помощью Hh и увеличением количеств белков антагонистов может быть важным временным механизмом для регуляции персистенции передачи сигналов Hh. Индуцибельные активаторы GLI1 и MIM/BEG4 могут противодействовать эффектам PTC и HIP, по крайней мере, в тканях, где индуцируются и активатор и ингибитор. Однако, у D. melanogaster, ортолог Gli1, ci, не индуцируется транскрипционно с помощью сигнала Hh и ничего неизвестно о функции D. melanogaster ортолога MIM/BEG4.

Имеются четкие параллели между формированием паттерна NEURAL TUBE у позвоночных (Box 2) и формированием паттерна крыльев у D. melanogaster. В каждом случае некоторые гены мишени активируются только наивысшими концентрациями Hh, некоторые активируются промежуточными и высокими концентрациями Hh, и некоторые репрессируются только в отсутствие Hh. В каждом случае элиминация транскрипционного эффектора (Ci или GLI2 и GLI3) генерирует ткани с типами клеток, которые не напоминают ни дорсальные, ни вентральные ткани в случае нервной трубки; и ни пограничные, ни наиболее передние клетки в случае крыльев^55-57. Более того, эти фенотипы воспроизводятся потерей ассоциированными с цитоскелетом белками (Cos2 или KIF3a/IFTs)^39,58. Эти наблюдения иллюстрируют, что имеется фундаментальное сходство между передачей сигналов Hh у позвоночных и беспозвоночных.

CiR b CiA регулируются разными концентрациями Hh. CiR и CiA продуцируются с помощью отдельных механизмов, с разными порогами регуляции с помощью Hh (Рис. 3). Низкие концентрации Hh ослабляют продукцию CiR с помощью Complex I; Ci накапливается в виде неактивного пула, т.к. Complex I и/или Complex II удерживают Ci вне ядра. Понижение транскрипционной репрессии с помощью Ci делает возможной регуляцию Hh генов мишеней с помощью др. факторов⁵⁸. Это объясняет, почему некоторые гены мишени активируются в присутствии низких концентраций Hh, тогда как др. остаются молчащими. Более высокие концентрации Hh делают возможной продукцию CiA, который управляет транскрипцией Hh генов мишеней. Таким способом разные концентрации Hh генерируют три самостоятельных состояния Ci транскрипционной регуляции: репрессированное, нейтральное или активированное. Три состояния генерируют необычное разнообразие реакций среди генов мишеней, которые зависят от 'basal activities', которые определяются др. входящими сигналами. Этот путь двойного ответа — ингибирование CiR или активирование CiA — является уникальным и новым механизмом, который является фундаментальным для биологических эффектов Hh.

Hh biogenesis and cell-surface presentation

Hh белки функционируют в передаче сигналов на короткие расстояния; сигнал может покрывать расстояние около десятка клеточных диаметров, что эквивалентно нескольким десяткам микронов. Белки распространяются в тканях в виде ступенчатого градиента; высокие количества обнаруживаются вблизи секретирующих клеток и по мере удаления от источника всё более в низких количествах. Форма градиента является критической для биологических реакций. Его форма определяется балансом между продукцией белка Hh его перемещением по ткани и его устранению из ткани.

Hh лиганды являются белками в 19-kDa с двумя ковалентными липидными модификациями (rev. Refs 8,16,59). Palmitate и cholesterol добавляются к N и C концам Hh во время его созревания на секреторном пути. Хотя липиды и оказывают некоторый эффект на сродство Hh белков к своим рецепторам, их первичный эффект сказывается на перемещении Hh по ткани⁶⁰. Напр., SHH-N и Hh-N являются генетически сконструированными формами Hh, которые лишены холестерола, которые являются неэффективно palmitoylated и поэтому не могут мультимеризоваться. In vivo, они неспособны концентрироваться вблизи клеток, секретирующих Hh, перемещаются слишком далеко по ткани от источника секреции и формируют аберрантный паттерн ткани, который согласуется с аберрантным его распределением. Неизвестно, только ли разные активности SHH и SHH-N in vivo являются единственным результатом различий в распределении или имеются также различия и в клеточных реакциях.

Потребность в др. члене семейства Ptc, Dispatched (Disp), в передаче сигналов Hh указывает на то, что созревание Hh нуждается не только в липидных модификациях и секреции. DISP функционирует в SHH-секретирующих клетках, способствуя биопригодности липид-модифицированного Hh и SHH, но не затрагивает Hh, который лишен липидных модификаций^61-64. DISP не нужен ни для поставки в мембраны сигнала Hh у людей или мышей, ни для его секреции, но он необходим для перемещения Hh по ткани. Одна из возможностей заключается в том, что DISP способствует приобретению полезности Hh при сборке в мультимеры⁶⁴. В культивируемых клетках большинство Hh ассоциировано с клетками, но растворимый Hh также обнаруживается, как в виде мономеров, так и мультимеров^65-67. Такие мультимеры могут быть артефактами агрегации при избыточной экспрессии, так как их существование еще не доказано при физиологических уровнях экспрессии. С др. стороны, они могут быть критическими для in vivo. Мультимерная форма в 50-раз более мощная в вызывании биологических реакций. Является ли это результатом более высокой AVIDITY для мультимерных рецепторов, необходимо проверять. Обе липидные модификации вносят вклад в мультимеризацию Hh а также в ассоциацию с мембранами, в нормальное перемещение по ткани и в формирование нормального паттерна ткани. Это оставляет открытым фундаментальный вопрос: является ли биологически активная форма Hh ассоциированного с клетками, растворимой, мультимерной или некой комбинацией из этих возможностей?

Hh покинув секретирующую клетку обнаруживается прежде всего в пузырьковых структурах в клетках мишенях скорее, чем на клеточной поверхности или во внеклеточном пространстве^61,68-70. Хотя эта находка имеет провоцирующее значение, что Hh перемещается по ткани с помощью transcytosis, эндоцитотический моторный dynamin не нужен Hh для перемещени я по ткани^49,70,71.

Итак, наиболее вероятно, что Hh перемещается по внеклеточным пространствам и затем быстро интернализуется клетками мишенями. Внеклеточное распределение липид-модифицированного Hh зависит от heparan-sulphate боковых цепочек glypican Dally-like (Dlp) и Shf^47-49,72-74. Мутантные клетки, которые лишены Shf, Dlp или transferase, которая добавляет heparan-sulphate боковые цепочки к Dlp, могут отвечать на Hh только если они находтся в непосредственной близи к клеткам, продуцирующим Hh. Shf соединяется с Hh и с heparan-sulphate proteoglycans, и тем самым создает сайт-гавань с высоким сродством для липид-модифицированного Hh во EXTRACELLULAR MATRIX. Без этого события постановки в док Hh будет или диспергировать или деградировать и будет непригодным для передачи сигналов. Хотя heparan-sulphate proteoglycans являются важными также для распределения Hh белков позвоночных⁷⁵, специфические игроки на этом пути еще не идентифицированы.

The activity of Ptc

Hh соединяется со своим рецептором Ptc с наномолярным сродством. Hh–Ptc комплекс интернализуется и направляется в лизосомы, где Ptc и Hh деградируют^71,76. В то же самое время, связывание Hh с Ptc инициирует передачу сигналов за счет предупреждения ингибирования Smo с помощью Ptc (rev. Refs 8,15). Ни эндоцитоз, ни деградация Ptc не являются необходимыми для передачи сигналов⁷¹, так что Hh д. изменять некую активность Ptc, в дополнение к изменениям концентрации и локализации Ptc. Объяснение подобной активности получено в исследованиях консервативных мотивов в PTC. PTC является много раз пронизывающим мембрану белком со сходством с семейством прокариотических пермеаз resistance-nodulation division (RND)^77,78. Эти белки обладают резистентностью ко многим лекарствам благодаря откачиванию токсинов. PTC обладакт к тому же sterol-sensing domain (SSD), который может непосредственно связывать cholestero^l79,80 и который меняет поставку белков в ответ на связывание липидов (rev. Ref. 81). И RND-подобная структура и SSD ответственны за функцию PTC, т.к. мутации любых консервативных остатков делают PTC неспособным ингибировать SMO^78,82-84. Семейство белков, которые обладают RND и SSD мотивами, включают PTC, DISP и Niemann–Pick disease type C1 белок (NPC1). NPC1 способствует перемещению нагруженных холестеролом белков вдоль микротрубочек и при экспрессии у бактерий транспорту acriflavine и oleic кислоты через мембраны^85,86. Может ли PTC транспортировать гидрофобные небольшие молекулы поперек мембран или отвечать на гидрофобные сигналы (вообще-то Hh) путем изменения такого транспорта и/или его везикулярного трафика, пока не установлено. Количественные исследования активации Ptc указывают на то, что Ptc функционирует как тример — все три субъединицы нуждаются в связывании Hh прежде чем будеи инициирована передача сигналов⁸⁷. Эндогенный Ptc был замещен генетически преобразованной формой Ptc, которая была создана, чтобы воспроизвести не связывающий лиганд и конституитивно связанный с лигандом Ptc. Соотношение 3:1 liganded-to-unliganded Ptc оказалось достаточным, чтобы активировать все реакции Hh, тогда как соотношение 3:2 было неспособно активировать ни одной из реакций Hh. Авт. пришли к заключению, что реакция предопределяется соотношением Hh-связанного- Ptc с Hh-свободным-Ptc скорее, чем общим количеством связанного с лигандом Ptc. Др. исследование, которое базируется на избыточной продукции PTC в культивируемых клетках, приводит к выводу, что активность PTC пропорциональна количеству Hh-free PTC скорее, чем соотношению связанного с лигандом к несвязанному с лигандом PTC⁷⁸. При первом анализе предполагалось, что искусственно преобразованные формы Ptc ведут себя идентично любому связанному или не связанному с лигандом Ptc дикого типа; при последующем анализе было предположено, что избыточно экспрессируемый PTC ведет себя идентично с PTC при физиологических концентрациях. Разрешение спора между этими двумя мнениями необходимо для детального понимания точной биохимической активности Ptc и структурных переходов, которые сопровождают его инактивацию с помощью Hh.

Smo and its regulation

Ligands and regulators. Smo является членом сверхсемейства SEVEN TRANSMEMBRANE (7TM) RECEPTOR а указания на его регуляцию исходят из параллелей с этим семейством (см. Box 3). Сysteine-rich N-terminal extracellular domain (CRD) и трансмембранные домены Smo высоко консервативны в phyla и обнаруживают существенное сходство с семейством Frizzled (Fz) Wnt рецепторов. В Fz белках, CRD связывает Wnt белки, но CRD в Smo не связывает ни Wnt, ни Hh белков¹⁶. Эволюционная консервация CRD указывает на то, что он играет фундаментальную роль в регуляции Smo, хотя в точности какова его роль пока неясно. Замена CRD и трансмембранных спиралей Fz на таковые от Smo дает белок, который регулируется с помощью Wnt белка Wingless скорее, чем с помощью Ptc⁸⁸. PTC может взаимодействовать слабо с CRD из SMO, т.к. PTC и SMO могут быть ко-иммунопреципитированы, если заметно избыточно экспрессированы⁸⁹. Область взаимодействия картируется в CRD и в проксимальных трансмембранных сегментах, но это взаимодействие д.б. слабым или преходящим, т.к. оно не определяется при физиологических условиях^78,90. Более того, PTC может репрессировать SMO при стоихометрии выше 1:50 (Ref. 78) и большинство из Smo не ко-локализуются с Ptc в покоящихся клетках^71,91. Хотя Ptc д. регулировать Smo на расстоянии или посредством временных взаимодействий с далеко идущими последствиями, механизм регуляции ещё не определен. Фундаментальным свойством 7TM рецепторов является из способность реконструировать свои трансмембранные спирали в ответ на гидрофобные сигналы, которые презентируют или прячут интерфейсы, которые взаимодействуют с цитоплазматическими эффекторами. Smo, по-видимому, сохранил это свойство. Активирующие мутации SMO, включая некоторые, которые ассоциированы с раками у людей, картируются в областях трансмембранных спиралей, которые являются критическими для всех 7TM рецепторов⁹². TERATOGEN cyclopamine является небольшим гидрофобным растительным алкалоидом, который ингибирует передачу сигналов Hh у млекопитающих. Различные cyclopamine воспроизводят (и др. малые молекулы) связь с трансмембранными спиралями SMO и или активируют или ингибируют передачу сигналов^93-95. Это открывает возможность того, что активность SMO регулируется с помощью эндогенной малой гидрофобной молекулы, пригодность или презентация которой регулируется с помощью PTC⁷⁸. D. melanogaster Smo не затрагивается cyclopamine. Это может отражать дивергенцию низкомолекулярных регуляторов в этих двух системах, или более фундаментальное различие в том, как регулируется Smo. Идентификация эндогенных малых молекул регуляторов Smo и активности транспортеров для Ptc сможет прояснить этот вопрос.

Accumulation. После стимуляции с помощью Hh, Smo фосфорилируется и он перемещается из внутренних хранилищ на клеточную поверхность и становится более стабильным⁶⁸. Этот феномен также тонко связан с передачей сигналов, чью причину и эффект трудно разделить (rev. Ref. 15). Избыточно экспрессирующийся Smo может активировать передачу сигналов в отсутствие Hh, a Smo, который содержит активирующие мутации, накапливается сходным образом как и Smo дикого типа в присутствии Hh^29,68. Т.к. количество Smo–Cos2 комплексов пропорционально количеству Smo, то увеличение количества комплексов Smo–Cos2, которое сопровождает нормальную передачу сигналов мю достаточным для активации передачи сигналов²³. С др. стороны, Smo д.б. избыточно экспрессирован до не физиологических концентраций, чтобы активировать передачу сигналов в отсутствии Hh, в этом случае Smo избегает нормальной регуляции, локализуется на клеточной поверхности и фосфорилируется^29,88,91. Остается определить, может ли и как накопление Smo вносит вклад в нормальную передачу сигналов.

Trafficking. Осуществляется цикл Ptc и Smo между эндосомами и плазматической мембраной в клетках млекопитающих и D. melanogaster. В клетках D. melanogaster, которые не подвергаются воздействию Hh, Smo ко-локализуется с эндосомными маркерами, тогда как Ptc располагается на клеточной поверхности и в не идентифицированных внутренних хранилищах^69,91,96. Hh меняет кинетику циклов (cycling), отправляя Ptc в лизосомы и позволяя Smo накапливаться на клеточной поверхности^68,69,91. Имеется удивительная корреляция между локализацией Smo т последующей передачей сигналов. Удаление или инактивирование Ptc позволяет Smo перемещаться на поверхность даже в отсутствие Hh; Smo с активирующими мутациями постоянно присутствует на поверхности клеток; а модификации, которые отправляют Smo на поверхность, делают его постоянно активным^27,91,97. Smo оказывается неактивным на клеточной поверхности только, если и Ptc и Smo удерживаются на поверхности путем блокирования эндоцитоза⁹¹. Эти данные указывают на то, что первичная регуляция Smo осуществляется посредством его субклеточной локализации. Если это предположение правильно, тогда компонент эндосом, который не сопровождает Smo на поверхность, д. ограничивать активность Smo. Ptc имеет SSD, который д. регулировать поставку пузырьков, которые содержат Smo, и мотив RND, который д. транспортировать Smo антагонистов в пузырьки. Rab23 регулирует перенос между плазматической мембраной и ранними эндосомами^46,96,98 и может ограничивать передачу сигналов Smo путем транспортировки ингибитора пути (такого как Ptc) в ранне эндосомы. Имеются, однако, аргументы против этого мнения: большая часть Smo и Ptc не ко-локализуются даже в отдыхающих клетках^71,91, aDOMINANT-NEGATIVE Rab23 не меняют распределения ни Ptc, ни Smo⁹⁶. В клетках млекопитающих, β-arrestin-2 (β-Arr2), цитозольный белок, который взаимодействует с и интернализует различные 7TM рецепторы, способствует активации передачи сигналов Hh в то же самое время как он способствует интернализации Smo. Это находится в противоречии с ситуацией у D. melanogaster, при которой локализация Smo на поверхности происходит после передачи сигналов Hh. Несмотря на эти различия участие Hh-модулированного трафика у насекомых и позвоночных указывает на потенциальную фундаментальную связь между trafficking и signalling. Возможно ли, что связь затрагивает отделение Smo от его ингибиторов или лигандов, презентацию Smo активирующим киназам или доступ Smo к важным эффекторам, остаётся неизвестным.

Phosphorylation. Цитоплазматический хвост у D. melanogaster Smo обладает PKA, CKI и GSK3 консенсусами сайтов фосфорилирования между S667 и S746. Фосфорилирование этих сайтов необходимо и достаточно для передачи сигналов ниже Smo^27-29, хотя описаны противоречивые результаты для эффектов этих сайтов на локализацию и накопление белка Smo. Фосфорилирование этой области важно для активации D. melanogaster Smo, но соответ. часть у SMO позвоночных имеет полностью др. аминокислотную последовательность. SMO человека фосфорилируется с помощью G-protein-coupled receptor kinase-2 (GRK2) скорее, чем с помощью PKA или CKI. Фосфорилирование с помощью GRK2 готовит SMO человека к взаимодействию с и интернализациии с помощью β-Arr2 (Ref. 99). β-Arr2 необходима для передачи сигналов Hh у рыбок данио¹⁰⁰, хотя ещё не установлено, способствует ли она интернализации Smo, поддержке сигнального комплекса¹⁰¹ или некоторым др. механизмам. Если поддерживающая функция является соответствующим механизмом, тогда фосфорилирование D. melanogaster Smo также должно подготавливать сборку нового сигнального комплекса.

Активация большинства 7TM рецепторов (Box 3) индуцирует конформационные изменения. Конформационные изменения активируют эффекторы (которые включают рецепторные киназы) и рецептор фосфорилируется. Фосфорилирование меняет субклеточную локализацию, количества и/или сигнальные свойства рецептора. Smo может быть 'true to its family history' (см. модель, представленную на Рис. 4). Передача сигналов д. осуществляться с помощью Ptc-индуцированных конформационных изменений в трансмембранных спиралях Smo, это приводит к изменениям в ассоциированном Cos2, так что PKA и CKI переносят свои активности с Ci на Smo. Концентрация Ci репрессорных белков падает и активируется 'low Hh'реакция. Тем временем фосфорилированный Smo меняет свой паттерн trafficking, накапливает и формирует ансамбли новых или модифицированных сигнальных комплексов. Это делает возможным фосфорилирование Sufu с помощью Fu, это высвобождает CiA, который активирует 'high Hh' реакцию.

Transduction by Cos2

Т.к. член сверхсемейства 7TM рецепторов, Smo, как и ожидалось, передает сигналы посредством HETEROTRIMERIC G PROTEINS ¹⁰². Когда Smo избыточно экспрессируется, то он управляет Shh- и Ptc-регулируемой активацией Galphai у лягушек MELANOPHORES¹⁰³, и модуляцией Galpha12/13 или G protein RhoA модифицирует реакции SHHв клетках млекопитающих и в нервной трубке¹⁰⁴. С др. стороны, систематическое истощение гетеротримерных G белков с помощью RNA INTERFERENCE в культивируемых клетках D. melanogaster не оказывает эффекта на каноническую передачу сигналов Hh¹⁰⁵. В общем выполняют ли гетеротримерные G белки разные роли у позвоночных и D. melanogaster? Альтернатива заключается в том, что гетеротримерные G белки могут модулировать реакции Hh, но не являются первичными эффекторами для пути.

Cos2 functions as more than a scaffold. Smo передает низкие концентрации Hh сигналов с помощью 'informing' Complex I, чтобы высвободить PKA, CKI и GSK3, в результате чего фосфорилирование Ci затухает²⁰. Чтобы передавать более высокие концентрации сигнала, Smo информирует Complexes I и II, чтобы облегчить продукцию CiA. Оба типа передачи сигналов используют связывание Cos2 с Smo цитоплазматическим хвостом (rev. Ref. 15). Это взаимодействие было предсказано с помощью генетического анализа⁸⁸ и подтверждено с помощью прямых подходов^23,106-108.

Какие изменения управляют Complex I, чтобы высвобождать PKA, CKI и GSK3? Эффективность взаимодействия Cos2–Smo, как было измерено с помощью ко-иммунопреципитации, постоянна независимо от Hh^23,106, так что усиление рекрутирования Complex I на Smo не может быть ключём к передаче сигналов Hh. Cos2 принадлежит к семейству kinesin моторных белков. Пока ещё не установлено, что Cos2 обладает ATPase или моторной активностью в биохимических экспериментах, но мутации в ATPase домене устраняют функцию Cos2 и дают доминантно-негативный белок¹⁰⁹. Эти данные указывают на то, что ATP-управлемое движение или изгибание белка Cos2, и вообще ассоциированных белков, является важным для передачи сигналов Hh.

Лишь небольшая фракция Complex I всегда ассоциирована с Smo^23,106, но весь пул Complex I останавливает продукцию CiR в ответ на Hh. Повторяющиеся циклы (cycling), временное взаимодействие между Smo и Complex I является простейшим механизмом, который д. информировать Complex I о данном состоянии активации Smo. Циклические взаимодействия с регуляторами и/или эффекторами являются характерными признаками моторных белков и G белков¹¹⁰. Эти циклы регулируются с помощью ATP или GTP — γ-phosphate нуклеотидов осуществляет конформационный переход, а его гидролиз управляет cycling. По этому сценарию, активированный Smo (по аналогии с др. heptahelical рецепторами) может способствовать ADP/ATP обмену для Cos2. Хотя это довольно спекулятивно, но Cos2 определенно является больше, чем просто пассивная поддержка — его ATPase необходима для репрессии транскрипции и представляет из себя привлекательную мишень для Hh регуляции.

Generation of CiA. Какие дальнейшие изменения лежат в основе продукции CiA? Smo, Fu, Sufu и Cos2 фосфорилируются в ответ на высокие концентрации Hh (rev. Ref. 15). Генетический анализ показал, что Smo димеры необходимы для формирования CiA⁸⁸, хотя биохимические подтверждения отсутствуют. Киназа(ы), которая фосфорилирует Fu и Cos2, еще не идентифицирована и значение их фосфорилирования остаётся неизвестным. Hh облегчает также ассоциацию небольшой популяции молекул Sufu с Cos2–Fu–Smo комплексом^23,30. Генетический анализ показывает, что Fu фосфорилирует Sufu,но биохимические доказательства этого отсутствуют. Одна из возможностей заключается в том, что высокие концентрации Hh способствуют фосфорилированию и димеризации Smo. Димеризация Smo активирует Fu киназу, которая ассоциирует с комплексом Complex I, который затем фосфорилирует Sufu, чтобы высвободить CiA. Курьёзно, но полный спектр реакций Hh, обнаруживается у D. melanogaster в отсутствие Sufu, если Cos2 регуляция в норме. Следовательно, д.б. альтернативные пути к CiA, которые используют Cos2 скорее, чем Sufu. Существуют ли эти пути и у позвоночных ещё предстоит выяснить.

Evolutionary origins of Hh signalling

Передача сигналов Hh стартует параллельно с передачей сигналов Wnt (см. Box 4), несмотря на различные структуры лигандов и в основном разные компоненты, которые принадлежат отдельным путям^16,111. Т.к. оба пути обнаруживаются повсеместно в царстве животных, то общий родоначальный путь — или, по крайней мере, компоненты, которые вносят вклад в оба пути — д. присутствовать у самых ранних METAZOANS .

Ptc и Hh have distinct evolutionary origins. Белок Hh представлен N-терминальным сигнальным доменом и C-терминальным каталитическим доменом. N-терминальный домен структурно родственен zinc hydrolases¹¹². C-терминальный каталитический домен Hh родственен inteins, семейству self-splicing белков^113,114. Hh белок, по-видимому, возник, когда intein был добавлен к сигнальному домену; высвобождение сигнального домена нуждается в отщеплении от intein и , следовательно, является предметом тонкого контроля.

Лрожжи и растения не имеют белка Ptc, но имеют версию родственного Ptc белка NPC1. Ptc, по-видимому, происходит от родоначального NPC1-подобного белка, который транспортирует малые молекулы или компоненты мембран в клетке. У животных ген для NPC1 насоса вероятно был удвоен и затем дивергировал, чтобы влиять на активность родоначального Smo. Приобретение петель, которые связывают Hh, превращает насос в сигнал-регулируемый насос. ВСе эти доводы, сведенные вместе указывают на то, что путь Hh появился в результате интеграции примордиальных путей, которые участвовали в сплайсинге белков, везикулярной доставке и в проникновении в ядро.

Summary and future directions

Hh signalling is essential for many developmental processes and for the maintenance of certain tissues in adults. Damage to the Hh signalling pathway can cause birth defects, cancer, sterility and baldness. Small molecule activators and inhibitors of Hh signalling are currently being developed for the treatment of Hh-related pathologies115, 116. In many contexts, responses to the Hh signal are dose-dependent, with different amounts of Hh generating distinct outcomes. This is mediated by dual responses to Hh, in which low doses of Hh alleviate transcriptional repression and higher doses activate transcription. The Hh signal is transduced when the receptor (Ptc) ceases to repress the divergent 7TM receptor Smo. Smo then instructs a cytoplasmic complex that includes a divergent kinesin (Cos2) and several protein kinases to stop production of the transcriptional repressor (CiR) and to begin production of the transcriptional activator (CiA). Vesicular trafficking, phosphorylation, dimerization and reassortment within the regulatory complex are all involved in translating Hh concentrations into transcriptional responses. The outstanding questions are how Ptc communicates with Smo, how Smo changes to transmit new instructions to the Cos2–Fu–Ci complex, and the role of membrane trafficking in the signalling pathway. For the increasing types of cancer that are associated with Hh signalling, understanding signal transduction will be crucial for identifying potential drug targets and devising new therapies.

COMMUNICATING WITH HEDGEHOGS
Joan E. Hooper & Matthew P. Scott
Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 306-317 (2005); doi:10.1038/nrm1612

Boxes

Links

COMMUNICATING WITH HEDGEHOGSJoan E. Hooper & Matthew P. Scott Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 306-317 (2005); doi:10.1038/nrm1612

Boxes

Links

COMMUNICATING WITH HEDGEHOGS
Joan E. Hooper & Matthew P. Scott
Nature Reviews Molecular Cell Biology 6, 306-317 (2005); doi:10.1038/nrm1612