Посещений:
Молчание Генов

Механизмы
RNAi-MEDIATED PATHWAYS IN THE NUCLEUS
Marjori A. Matzke, James A. Birchler
Nature Rev. Genetics Vol.6, No 1, P. , 2005
RNA interference (RNAi) is an evolutionarily conserved mechanism that uses short antisense RNAs that are generated by 'dicing' dsRNA precursors to target corresponding mRNAs for cleavage. However, recent developments have revealed that there is also extensive involvement of RNAi-related processes in regulation at the genome level. dsRNA and proteins of the RNAi machinery can direct epigenetic alterations to homologous DNA sequences to induce transcriptional gene silencing or, in extreme cases, DNA elimination. Furthermore, in some organisms RNAi silences unpaired DNA regions during meiosis. These mechanisms facilitate the directed silencing of specific genomic regions.


Рис.1.
 | RNA-directed DNA methylation.


Рис.2.
 | RNA interference-mediated heterochromatin assembly.


Рис.3.
 | RNA interference (RNAi) and DNA elimination in Tetrahymena thermophila


Рис.4.
 | Silencing of unpaired DNA during meiosis.

Boxes



Box 1 | Multigene families that encode components of the RNAi machinery
Although the fission-yeast genome contains only one copy of each of the genes that encode the core proteins of the RNA interference (RNAi) machinery (Dicer, RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) and Argonaute), these proteins are often encoded by multigene families in other organisms.

Dicer

Proteins of the Dicer family are ribonuclease III enzymes that process dsRNA to produce small RNAs. There are four such proteins in Arabidopsis thaliana, two in Drosophila melanogaster, two in Neurospora crassa, one in mammals and one in Caenorhabditis elegans.

RNA-dependent RNA polymerases

These synthesize dsRNA from an ssRNA template to initate or amplify the RNAi process. There are four in C. elegans, six in A. thaliana (at least three of which are expressed) and three in N. crassa, but there are none in D. melanogaster or mammals.

Argonaute

Members of this family provide the small RNA-binding component of silencing-effector complexes. There are 27 in C. elegans, 10 in A. thaliana, 8 in humans, 5 in D. melanogaster and 2 in N. crassa106.

The proliferation of these gene families in multicellular eukaryotes indicates a subfunctionalization of the encoded proteins into diverse processes, and provides the possibility of separate nuclear or cytoplasmic distributions in the cell. Although much remains to be learned about the extent of functional diversification and/or redundancy of gene-family members, distinct roles in RNA-mediated gene-silencing pathways for some individual representatives of these families have been discovered. Some of these are mentioned in the text and more examples are provided below.

In A. thaliana, nuclear DICER-LIKE 1 (DCL1)107 is required for processing microRNA (miRNA) precursors19 and DCL2 is required for producing viral small interfering RNAs (siRNAs)15. In D. melanogaster, Dicer-1 (DCR1) produces miRNAs whereas DCR2 generates siRNAs108. The two Dicers in N. crassa are functionally redundant in RNAi109.

In N. crassa, meiotic silencing of unpaired DNA (in the nucleus) and RNAi (in the cytoplasm) require distinct RdRPs and Argonaute proteins93. In A. thaliana, RdRP6 is needed for RNAi that is triggered by sense transgenes110.

In D. melanogaster, Argonaute 1 (AGO1) and AGO2 are implicated in miRNA and siRNA-mediated silencing, respectively111. AGO2 in humans contains an RNaseH-like domain that catalyses mRNA cleavage in the RNAi process6,7.



Box 2 | Cytosine demethylation, imprinting and RNA
CG methylation is lost passively during successive rounds of DNA replication if it is not maintained by DNA methyltransferases112. However, there is growing evidence for active demethylation without DNA replication in animals and plants, possibly through the activity of DNA glycosylases; enzymes that normally function in BASE-EXCISION REPAIR113. Several 5-methylcytosine DNA glycosylases in vertebrates are thought to excise methylated cytosines, which are replaced with unmethylated cytosines114.

In Arabidopsis thaliana, DNA glycosylase domains are present in two large proteins — REPRESSOR OF SILENCING 1 (ROS1) and DEMETER (DME) — that have been implicated in the activation of transcriptionally silenced genes, presumably through the removal of methylated cytosines115-118 (Рис. 1). DME is specifically required for the demethylation and activation of the maternal alleles of the imprinted genes MEDEA (which encodes a polycomb-group protein that regulates endosperm development)117 and FWA (which encodes a homeodomain transcription factor that functions in the seed endosperm)54. Whether the demethylation of target genes by DME or ROS1 is guided by RNA is unknown, but RNA-directed DNA methylation (RdDM) has been implicated in establishing methylation of FWA (Ref. 46) and of a transgene promoter that is demethylated by ROS1 (Ref. 115). Intriguingly, in vertebrate cells, RNA that is complementary to the methylated DNA strand was reported to be required for active demethylation by DNA glycosylases119. In addition, the chicken DNA glycosylase associates tightly with an RNA helicase, p68 (Ref. 120). In Drosophila melanogaster, the p68 orthologue is required for efficient RNA interference (RNAi)121. If the p68 orthologue in chicken is also needed for RNAi, a connection would be established between demethylation by DNA glycosylases and the RNAi machinery in vertebrates.



Box 3 | Does RNA-directed DNA methylation operate in mammals?
Non-CG methylation, a hallmark of RNA-directed DNA methylation (RdDM) in plants, has been detected in DNA of mammalian embryonic stem cells122 and in human L1 retrotransposons123, but it is unknown whether this methylation is triggered by RNA.

One issue is whether mammals have the molecular machinery needed for RdDM. Two of the DNA methyltransferases required for RdDM in plants, DOMAINS REARRANGED METHYLTRANSFERASE 2 (DRM2) and DNA methyltransferase MET1, have mammalian counterparts (DNMT3A/B and DNMT1, respectively), although the catalytic domain of DRM2 is rearranged relative to DNMT3A/B and there are some differences in their amino termini104. The plant-specific DNA methyltransferase CHROMOMETHYLASE 3 (CMT3) is important for CNG methylation38, 39, but whether this enzyme is an absolute requirement for RdDM is not clear. Another plant-specific factor of the RdDM machinery is the SNF2-like protein DEFECTIVE IN RNA-DIRECTED DNA METHYLATION 1 (DRD1). The closest non-plant homologues of DRD1 are members of the conserved Rad54/ATRX subfamily of SNF2-like proteins48. ATRX (α-thalassaemia, mental retardation, X-linked) is needed for CG methylation of some repetitive sequences in mammals124. Whether this methylation is triggered by RNA is unknown, but ATRX could conceivably substitute for DRD1 in the RdDM pathway in mammalian cells.

RdDM clearly takes place in the nucleus, whereas the mRNA degradation step of RNAi occurs typically in the cytoplasm. Are small RNAs that trigger RdDM likely to be present in nuclei of mammalian cells? Plant cells have DICER-LIKE activities that are localized in the nucleus, such as Arabidopsis thaliana DCL3 (Ref. 15) and DCL1 (Ref. 107), which can produce small RNAs in the nucleus. Moreover, in plant cells, small RNAs that initiate RNAi in the cytoplasm can move to the nucleus to induce methylation of homologous DNA125. Although the single Dicer of mammals is present in the cytoplasm126, a mechanism for translocating small RNAs to the nucleus of mammalian cells is indicated by the presence of mature miRNAs in nuclear as well as cytoplasmic cellular fractions7. Small RNAs produced in the cytoplasm might also be able to interact with DNA when the nuclear envelope breaks down during cell divisions57. So, mammals seem to have much of the machinery for RdDM, but whether this process occurs regularly in mammals remains to be determined.


Box 4.
| RNA–RNA or RNA–DNA?

Links

DATABASES
Entrez Gene: FWA | piwi | aubergine | homeless | white
NCBI Taxonomy:
Neurospora crassa | Arabidopsis thaliana | Drosophila melanogaster | Tetrahymena thermophila | Paramecium tetraurelia | Ascobolus immersus | Caenorhabditis elegans

FURTHER INFORMATION
Arabidopsis small RNA Project | ChromDB: The Plant Chromatin Database | The miRNA registry
Двунитчатые РНК м. индуцировать рад феноменов сиквенс-специфического молчания. Молчание инициируется, когда dsRNA превращается в малые РНК в 21-26 nucleotides (nt) длиной с помощью энзима RNaseIII Dicer1. Эти малые РНК затем инкорпорируются в silencing-effector комплексы, которые их доставляют к комплементарным nucleic-acid мишеням. В зависимости от природы последовательностей мишени и белкового состава эффекторного комплекса м. возникать разные типы молчания2-4.
RNA interference (RNAi) инициируется с помощью Dicer-сгенерированных small interfering RNAs (siRNAs), которые находят комплементарные мРНК для деградации с помощью ribonuclease-containing RNA-induced silencing complex (RISC). Стержневым компонетом RISC и др. silencing-effector комплексов является Argonaute, белок, который м. связывать малые РНК5 и в некоторых случаях выполняет расщепление мРНК-мишени6,7. Др. общим, хотя и не универсальным, белком RNAi кухни (machinery) является RNA-dependent RNA polymerase (RdRP), которая синтезирует dsRNA на ssRNA матрице, чтобы инициировать или амплифицировать реакцию RNAi8,9. Естественно возникающие siRNAs возникают из транспозонов10-14 и вирусов, которые продуцируют dsRNA во время репликации15, а также из др. типов двунаправленно транскрибируемых повторяющихся последовательностей16,17 и генов15,18. Как показано в Box 1, Dicer, Argonaute и RdRP компоненты RNAi кухни - которые также участвуют и в др. РНК-обеспечиваемых механизмах молчания - кодируются с помощью мультигенных семейств у некоторых видов.
MicroRNAs (miRNAs) это второй класс малых РНК, которые м. индуцировать молчание с помощью таргетинга мРНК. miRNAs продуцируются благодаря процессингу с помощью Dicer несовершенных РНК шпилек, которые обычно соответствуют областям, не кодирующим белок. miRNAs инкорпорируются в RISC-подобные комплексы и в зависимости от степени их комплементарности мРНК-мишени вызывают или репрессию трансляции или расщепление мРНК. Молчание генов, которое обусловливается с помощью miRNAs существенно для развития растений и животных19,20, и м. также играть роль в патогенности ДНК вирусов с большими геномами, которые кодируют miRNAs21.
Пост-транскрипционное молчание генов, которое индуцируется с помощью siRNAs и miRNAs достигает специфичности благодаря распознаванию РНК-РНК последовательностей и спариванию оснований. Однако, РНК м. также формировать пары оснований с ДНК. В самом деле, растут доказательства того, что RNAi процесс затрагивает функции генов на уровне геномной ДНК.

Overview of nuclear pathways


Описаны 4 dsRNA-обеспечиваемых пути, которые оперируют на уровне ядерного генома. Два из них RNA-directed DNA methylation (RdDM) RNAi-обеспечиваемое образование гетерохроматина являются EPIGENETIC процессами, которые вызывают ковалентные модификации цитозинов в ДНК или гистонах (обычно метилируется lysine 9 гистона H3), соотв. RdDM описан наиболее тщательно у растений, а RNAi-обусловленная сборка гетерохроматина описана у делящихся дрожжей (Schizosaccharomyces pombe), животных и растений. Хотя RdDM и RNAi-обусловленное образование гетерохроматина инициируются с помощью dsRNA, пока неясно, представлены ли они продуктами двух разных путей или одного пути. У высших организмов метилирование ДНК и модификации гистонов взаимосвязаны в само-усиливающиеся петли обратной связи, детали которых всё ещё не выяснены22. Однако, не выявлено обнаружимого метилирования ДНК у делящихся дрожжей, у которых RNAi-обусловленный гетерохроматин был впервые обнаружен 16,23, указывает на то, что гистоновые модификации и метилирование ДНК не обязательно взаимосвязаны. Учитывая это, мы обсудим RdDM and RNAi-обусловленный гетерохроматин отдельно, опишем также их контрастирующие свойства, некоторые из которых м. отражать механистические отличия
В третьем механизме - элиминации ДНК - ресничатые протозоа проходят на одну ступеньку дальше по пути RNAi-обеспечения гетерохроматина: межгенные последовательности, которые упаковываются в молчащий хроматин с помощью RNAi machinery выбрасываются за борт во время развития транскрипционно активного макроядра. Этот первоначально эпигенетический процесс , следовательно, имеет генетический аспект, т.к. конечным результатом является деструкция генома.
Наконец, молчание неспаренной ДНК во время мейоза, которое происходит у некоторых организмов, базируется на белках RNAi кухни. Мейотическое молчание, по крайней мере, у Neurospora crassa - где оно было впервые открыто - происходит в ядре, но в отличие от др. трех механизмов, упомянутых выше, оно обязательно является пост-трансляционным процессом, который не вызывает обнаружимых альтераций хроматина в локусе-мишени. В самом деле, недавние данные показывают, что мейотическое молчание у N. crassa м.б. исключением, чтобы подчеркнуть 'правило', что RNAi machinery участвует в модификациях ДНК и гистонов24,25.

RNA-directed DNA methylation


RdDM был первой описанной РНК-управляемой эпигенетической модификацией генома. Первоначально выявленная у VIROID-инфицированного табака26, RdDM , как позднее было установлено, нуждается в dsRNA, которая подвергается процессингу в малые РНК в 21-24 nt, тем самым подкрепляется связь с RNAi27. У растений dsRNAs, которая содержит последовательности, которые гомологичны промоторным областям, м. запускать метилирование промоторов и транскрипционное молчание генов27-30. RdDM ведет к de novo метилированию цитозинов, которые появляются во всех контекстах последовательностей, но не просто в симметричных CG динуклеотидах, которые рассматриваются в качестве обычных мишеней для метилирования. Метилирование в основном ограничено областью гомологии РНК-ДНК последовательностей31,32. Итак, в отличие от RNAi-based гетерохроматина, который м. распространяться на несколько kilobases от сайта RNA-targeted nucleation23,33, RdDM обычно не распространяется (infiltrate) существенно на соседние последовательности. Минимальный размер мишени-ДНК для RdDM ~30 bp34, позволяет до некоторой степени усовершенствование, которое невозможно с гистоновыми модификациями, которые происходят в контексте NUCLEOSOMES, представленных 147 bp ДНК.
RdDM in plants. Как упоминалось выше, RdDM наиболее интенсивно изучался у растений особенно на Arabidopsis thaliana. Здесь мы суммируем находки, полученные на системе A. thaliana, которая использовала трансгеном кодируемые РНК шпильки, чтобы запустить метилирование гомологичных промоторов-мишеней, а также исследования некоторых эндогенных генов, для которых метилирование, как полагают, запускается с помощью малых РНК. Анализ показал, что RdDM нуждается в DNA-cytosine methyltransferases и энзимах, модифицирующих гистоны, в дополнение к новому хроматин-ремоделирующему белку и растущему списку белков, которые функционируют на пути RNAi.
RdDM является ступенчатым процессом, который инициируется с помощью РНК сигналов и сайт-специфичной DNA methyltransferases35,36 (Рис. 1). После de novo ступени метилирования, гистоновые модификации помогают поддерживать метилирование ДНК, которое м. в противном случае быть потеряно с помощью пассивных или активных процессов (Box 2). У A. thaliana, поддержание CG метилирования нуждается в комбинированной активности DNA methyltransferase MET1 (Refs 28,36) и histone deactetylase HDA6 (Ref. 37), тогда как метилирование CNG и метилирование гистона H3 lysine 9 (H3K9) нуждается в специфичной для растений DNA methyltransferase CHROMOMETHYLASE 3 (CMT3) и в H3 lysine 9 methyltransferase SUVH4 (известной также как KRYPTONITE), гомолог у A. thaliana Drosophila melanogaster SU(VAR)3-9 (Refs 38-41) (Рис. 1). Способность распределять SUVH4 для de novo метилирование была выявлена в экспериментах, в которых гены-мишени у suvh4 мутантов оказывались метилированными и молчали в результате РНК-управляемого процесса40.
Необходимо отметить, что метилирование ДНК не всегда предшествует метилированию H3K9: эта последовательность событий обратная у N. crassa, у которой метилирование H3K9 является предварительным условием для метилирования цтозина42. Механистические взаимоотношения между метилированием ДНК и метилированием H3K9 , следовательно, отличается у растений и N. crassa40, и вообще отражает тот факт, что модификации ДНК и гистонов независимы по RNAi у N. crassa24,25 или отражают разные структуры N. crassa DNA methyltransferase по сравнению с растительными CMT3 и MET1 (Ref. 40).
У A. thaliana, путь метилирования CNG-H3K9 был в дальнейшем связан с RNAi благодаря идентификации ago4 мутантов14. AGO4 является ядерным белком15 который вместе с дополнительными компонентами RNAi кухни - DICER-LIKE 3 (DCL3), RNA-DEPENDENT RNA POLYMERASE 2 (RDR2) и SILENCING DEFECTIVE 4 (SDE4; белок с неизвестной функцией) (Рис. 1) - обеспечивает метилирование двух тандемных повторов в промоторе трансгена, который кодирует белок ENDOSPERM семян FWA, приводящее к его молчанию43. DCL3, который располагается в ядре и который является одним из 4-х Dicer белков у A. thaliana (Box 1), продуцирует 24-nt siRNAs, которые участвуют в индукции модификаций хроматина трансгенов и некоторых эндогенных последовательностей у растений10,14,15. AGO4 также играет роль в поддержании метилирования ДНК и метилировании H3K9 некоторых эндогенных и трансгенных повторов и в накоплении siRNAs, которые соответствуют этим последовательностям14,15,44. В то время как AGO4, как полагают, специализируется на модификациях хроматина14, второй A. thaliana белок Argonaute, AGO1, является более разносторонним, действуя как в siRNA, так и miRNA-обеспечиваемых путях пост-транскрипционного молчания генов45 и в поддержании модификаций хроматина некоторых локусов13,46,47.
Ясность того, как RNAi machinery запускает метилирование ДНК в контексте хроматина, пришла в результате скрининга мутантов, которые дефектны по RdDM промоторов, специфичных для семян, которые экспрессировались transgenically у A. thaliana. Этот скрининг идентифицировал DEFECTIVE IN RNA-DIRECTED DNA METHYLATION 1 (DRD1), специфичный для растений, предположительно SNF2-LIKE-CHROMATIN -REMODELLING PROTEIN48. Участие DRD1 в RdDM указывает на то, что реконфигурация хроматина необходима, чтобы обеспечить доступность ДНК-мишеней для РНК сигналов. Второй SNF2-подобный белок, DECREASE IN DNA METHYLATION 1 (DDM1) - который является гомологом lymphoid specific helicase (LsH) млекопитающих49 - вносит вклад в поддержание RdDM32,50,51. DDM1 был первоначально идентифицирован при скрининге мутантов, которые дефицитны по метилированию ДНК повторов из центромер и рДНК52 - повторяющиеся области, которые являются удобными индикаторами снижение метилирования в популяциях мутагенизированных растений - хотя пока всё ещё не известно, необходимы ли они с самого начала для достижения метилирования посредством RdDM. Связь между активностью DDM1 и РНК-обусловленным молчанием повторяющихся элементов была установлена после находки, что DDM1 кооперируется с MET1 и HDA6, чтобы поддерживать большой домен гетерохроматина, содержащего транспозон, (хромосомы 4 'knob'), области, которая является источником для большинства соответствующих транспозонов siRNAs46. Более того, DDM1 необходим для MET1-катализируемого метилирования ДНК и молчания тандемных повторов промотора в эндогенном гене FWA53,54. Запуск метилирования преимущественно обеспечивается с помощью siRNAs, которые гомологичны тандемным повторам, возникающим из транспозонов46. Последующая потеря метилирования с материнского аллеля является важной для импринтированной экспрессии FWA в эндосперме (Box 2).
FWA представляет первый пример эндогенного промотора, который обнаруживается для метилирования ДНК и транскрипционного молчания с помощью siRNAs, происходящих из транспозона. Регулируются ли др. эндогенные промоторы сходным образом, неясно. У A. thaliana, множество эндогенных малых РНК происходит из областей, не кодирующих белок15, в принципе они м. служить потенциальными мишенями для эпигенетических модификаций промоторов или энхансерных элементов.
RdDM in other organisms. Некоторые из известных компонентов RdDM кухни присутствуют и у млекопитающих (Box 3), указывая тем самым, что RdDM потенциально возможно и вне царства растений; однако, пока нет убедительных сообщений об обнаружении RdDM у млекопитающих. В одном из первых исследований RdDM в клетках млекопитающих, длинная dsRNA, которая knocked down экспрессию гена-мишени с помощью RNAi в ооцитах мыши, не индуцировала de novo метилирование соотв. области ДНК 55. В 2-х др. исследованиях56,57, однако, было показано, что siRNAs, которые находят промоторы эндогенных генов, м. индуцировать метилирование CG, транскрипционное молчание и метилирование H3K957 в клетках человека. Даже если dsRNA или синтетические siRNAs не м. нормально запускать RdDM у млекопитающих, др. не-кодирующие или антисмысловые РНК, способ действия которых всё ещё неизвестен, м. участвовать в chromatin-based регуляции у этих организмов58.

RNAi-directed heterochromatin


Гетерохроматин уже давно распознавался как цитологически видимый, генетически неактивный компонент ядер. Однако, путь сборки гетерохроматина стал предметом пристального изучения лишь недавно, после обнаружения участия RNAi в его образовании.
Properties of heterochromatin. Общеизвестно, что гетерохроматин относительно беден генами по сравнению с эухроматином и окружает центромерную область у многих видов. Гетрохроматин обычно не обнаруживает высоких уровней генной экспрессии; у некоторых организмов, хромосомные перестройки, которые сводят вместе гетерохроматин и эухроматин приводят к мозаичному паттерну молчания, называемому position-effect variegation (PEV), обусловленному состоянием хроматина в соединении между двумя частями59. На уровне ДНК гетерохроматин состоит из последовательностей degenerate ретротранспозонов, тандемных массивов простых повторяющихся единиц или комбинации обоих16,60. В самом деле искусственные тандемные массивы трансгенов, как известно, воспроизводят молчание генов PEV-типа, которые находятся в повторах61.
Молекулярные признаки гетерохроматина изучены тщательно у D. melanogaster, млекопитающих и делящихся дрожжей. Определенные законсервированные белки высоко законсервированы в гетерохроматине многих организмов. Heterochromatin protein 1 (HP1) связан в их CHROMODOMAIN с гистоном H3, который метилирован по Lys9 (Refs 62-64). Это метилирование гистона H3, которое является типичным для гетерохроматиновых областей, обеспечивается прежде всего с помощью SU(VAR)3-9, мутантная форма которого функционирует как супрессор PEV (Ref. 65). У делящихся дрожжей гомологами HP1 и SU(VAR)3-9 являются Swi6 и Clr4, соотв.2. Третий белок, который выполняет ключевую функцию в гетерохроматине, это cohesin, который необходим для соединения сестринских хроматид до тех пор, пока они не разделятся в анафазе66-68.
RNAi targets centromeric heterochromatin. ДНК компоненты гетерохроматина делящихся дрожжей состоят из простых массивов тандемов, происходящих из транспозонов, которые окружают центральную стержневую центромерную область каждой хромосомы16. Эта центральная стержневая область закрепляет KINETOCHORE, тогда как домены, фланкирующие гетерохроматин, способствуют слипанию сестринских хроматид69. Дерепрессия центромерных outer-transposon повторов у мутантов, дефицитных по компонентам RNAi machinery, ведет к предположению, что малые РНК функционируют в качестве поводырей, чтобы находить модификации хроматина, которые типичны для гетерохроматина16. В частности, эти доказательства получены благодаря нокаутам генов, которые кодируют Argonaute, Dicer и RdRP, которые являются однокопийными генами у делящихся дрожжей (Box 1). Обычно транскрипты с forward-нити из повторов не обнаруживаются в транскрипционных assays и обнаруживаются низкие уровни с обратной нити. однако, у RNAi мутантов, накапливается РНК с обеих нитей, указывая тем самым на участие пути RNAi в транскрипционном молчании. Эпигенетические основы этого молчания установлены с помощью редуцированных количеств метилирования H3K9 и ассоциированной с повторами Swi6 у RNAi мутантов.
Дальнейшие доказательства вовлечения пути RNAi в образование гетерохроматина у делящихся дрожжей получены в исследованиях, в которых трансгены, локализованные в центромерных повторах и обычно молчащие, активируются у RNAi мутантов. Сходные наблюдения сделаны по SILENT MATING-TYPE локусу, который содержит одиночную копию центромерного повтора, которая предназначена для H3K9 метилирования с помощью siRNAs, с последующим Swi6-зависимым распространением гетерохроматина за пределы этой области23.
Эти результаты ведут к предположению, что транскрипция двух нитей из центромерных повторов генерирует молекулы dsRNA. Эти молекулы м.б. амплифицированы с помощью RdRP, который обнаруживается в тесной ассоциации с повторами16. Процессинг dsRNAs с помощью Dicer,как полагают, продуцирует малые РНК, которые наводят гистоновую methyltransferase на соотв. сайты на хромосоме, чтобы катализировать метилирование H3K9. Модифицированная форма H3 связывается Swi6 (у делящихся дрожжей гомолог HP1), это уменьшает транскрипционную способность. Cohesin затем оказывается ассоциированным с гетерохроматиновыми сайтами и помогает ассоциации сестринских хроматид. Последовательность событий, которые имеют место при РНК-обусловленном образовании гетерохроматина показаны на Рис. 2. У делящихся дрожжей ядерный эффекторный комплекс, известный как 'RITS' (RNA-induced initiation of transcriptional gene silencing) участвует в нахождении (targeting) хроматиновых модификаций. RITS содержит siRNAs, которая происходит из гетерохроматиновых районов, таких как центромеры, и три идентифицированных белка - Ago1, Chp1 (a centromere-associated chromodomain protein) и Tas3 (a serine-rich protein that is specific to fission yeast)70. RITS прикреплен к молчащим локусам с помощью H3K9 метилирования и это прикрепление существенно для молчания и продолжающейся продукции siRNAs71.
RNAi machinery также участвует в формировании гетерохроматина у D. melanogaster. Мутации двух генов. которые кодируют членов семейства Argonaute (piwi и aubergine), а также мутации homeless (известного также кааspindle E) гена (который кодирует RNA helicase, важную для RNAi72, мейоза73 и transposon молчания74), супрессируют PEV. Супрессия проявлялась в возникновении variegated молчания трансгенетически вставленных тандемных массивов white гена окраски глаз или или в виде отмены молчания трансгенов white, которые вставлялись в сильно гетерохроматизированные четвертые хромосомы75. Наиболее сильные эффекты выявлены с мутантами homeless, которые обнаруживали пониженные уровни метилирования H3K9 в гетерохроматиновых регионах и снижение количества HP1, который ассоциирует с этими сайтами.
Недавние исследования обнаружили сходное подтверждение для компонентов RNAi machinery для образования центромерного гетерохроматина в клетках позвоночных. Экспрессия Dicer была условно инактивирована в клетках цыплят, несущих копию хромосомы 21 человека (Ref. 76). Эта система позволяет анализировать отдельные хромосомы человека без того чтобы ставили в тупик фоновые сходные центромерные последовательности из др. хромосом человека. α-Satellite центромерные последовательности формируют повторяющиеся массивы во всех центромерных областях человека. Они окружают и включают активные кинетохоры на хромосоме человека 21. Показано, что транскрипты из этой области подвергаются процессингу с помощью Dicer76. Cohesin-GFP репортерные белки - которые обычно д. локализоваться в гетерохроматине - делокализуются в клетках, дефицитных по Dicer. Разные формы HP1, которые экспрессируются в клетках цыплят, также были частично делокализованы внутри ядра, указывая тем самым на разрушение таргетинга гетерохроматина с помощью RNAi machinery. Аномальные митозы таже обнаруживались у мутантов Dicer, возможно вследствие нарушения локализации cohesin.
Silencing at interstitial sites. В дополнение к центромерному гетерохроматину RNAi пути также участвуют в таргетинге нецентромерных, интерстициальных сайтов в эухроматине для обеспечения молчания. У D. melanogaster разбросанные трансгены, которые вставлены в разные месте эухроматина молчат на транскрипционном уровне благодаря ассоциации с POLYCOMB COMPLEX77,78. Этот тип молчания в интерстициальных сайтах также зависит от компонентов пути RNAi78. Polycomb-зависимое молчание использует модификации гистонов, которые отличаются от тех, что описаны выше для HP1-обусловленного молчания в центромерных областях (т.е., метилирование лизина 27 скорее, чем лизина 9 гистона H3), но сходны с теми, которые они вызывают в более рестриктивных хроматиновых условиях, которые в общем предупреждают высокие уровни транскрипции.
Роль RNAi в гетерохроматин-подобном диспергированном молчании среди эухроматиновых областей была также продемонстрирована в делящихся дрожжах. Транскрипция искусственных шпилек РНК , как было показано, запускает молчание гомологичных последовательностей по всему геному33, а молчащие гены обнаруживают повышенные уровни метилирования H3K9 с сопровождающим связыванием Swi6 и cohesin. В том же исследовании показано, что длинные терминальные повторы ретротранспозонов являются мишенями этого пути. Этот тип интерстициального RNAi-обусловленного гетерохроматина м. распространяться на 7-10 kb от места первоначального зарождения (nucleated) с помощью siRNAs, и м. также распространяться на эндогенные гены и регулировать их экспрессию. Напр., как было показано, для определенных генов, которые экспрессируются только в клетках, подвергающихся мейозу, демонстрируя роль для этого процесса клеточной дифференцировки33.
Малые РНК также участвуют в генерации интерстициального гетерохроматина у A. thaliana. Детальный анализ микромассивов богатого транспозонами гетерохроматинового knob на хромосоме 4 A. thaliana выявил высокие уровни метилирования H3K9 и метилирования ДНК, которые концентрировались в транспозоновых последовательностях и не распространялись на соседние гены46. Малые РНК, которые гомологичны транспозонам и повторяющимся последовательностям в этой области преимущественно управляют мишень-специфичностью этих хроматиновых модификаций, хотя это всё ещё не продемонстрировано непосредственно. Метилирование этих повторяющихся элементов зависит от SNF2-подобного ремоделирующего хроматин белка DDM1, т.к. уровни малых РНК, которые гомологичны повторяющимся транспозонам в knob были снижены у ddm1 мутантов, указывая на участие этого белка в механизме таргетинга46
В целом эти исследования показали, что повторяющиеся последовательности с потенциалом продуцировать dsRNAs целенаправленно обнаруживаются для вызывания молчания с помощью RNAi-обеспечиваемого пути. Малые РНК, которые генерируются с помощью Dicer расщепления dsRNAs, функционируют как помощники в наведении гистоновых methyltransferases на гомологичные сайты в хроматине, когда они или собраны в кластеры в гетерохроматине или локализованы интерстициально в хромосоме. Эта инициальная модификация предоставляет платформу, на которой репрессивные белки, такие как HP1 или polycomb комплекс соединяются, приводя к упаковке хроматина таким способом, что ограничивают количество транскрипции, которая м. появиться.

DNA elimination and RNAi


RNAi участвует и в том, что называется 'ultimate form of gene silencing'79: запрограммированная эксцизия избытка ДНК. Этот феномен м. наблюдаться у реснитчатых протозоа, которые экстенсивно реорганизуют свой геном во время полового процесса конъюгации. Одноклеточные реснитчатые содержат два функционально отличных типа ядер: диплоидное макроядро предоставляет собой резерв зародышевой линии и транскрипционно молчит во время вегетативного роста, тогда как полиплоидное макроядро служит в качестве транскрибируемого соматического ядра. Оба типа ядер развиваются из митотических делений зиготического ядра, которое образуется во время конъюгации с помощью слияния двух гаплоидных микроядер (Рис. 3A). Дифференцировка нового макроядра сопровождается массивной элиминацией последовательностей ДНК зародышевой линии - известных как internal eliminated segment (IES) последовательности. Хотя неизвестна общая функция, связанная с этим необычным процессом, он м. элиминировать 'эгоистические' элементы ДНК, такие как транспозоны, которые проникают в геном микроядра79. У Tetrahymena thermophila, примерно 15% генома, представляющие примерно 6,000 индивидуальных последовательностей, делетируются подобным образом79. У Paramecium tetraurelia, количество точно удаляемых последовательностей IES составляет около 60,000 (Ref. 80). До недавнего времени, механизм скоординированной элиминации IES последовательностей, которые не обладают общими последовательностями, был неизвестен. недавние находки показали, что RNAi machinery участвует в таргетинге модификаций, которые являются типичными гетрохроматиновыми в последовательностях IES, маркируя их тем самым для последующей эксцизии.
Инициальное указание, что РНК вовлекается в запрограммированную элиминацию ДНК, получено благодаря наблюдениям за двунаправленной транскрипция генома микроядра во время конъюгации, которая даёт гетерогенные и потенциально двунитчатые транскрипты, которые содержат IES последовательности81. Более того, необычные эпигенетические эффекты, при которых экспериментально вносимые последовательности в старое макроядро, м. влиять на эксцизию гомологичных последовательностей в новое макроядро, указывая тем самым на межядерный перенос сиквенс-специфичесского сигнала, который, как полагают, является диффузионной РНК82. В самом деле многие компоненты RNAi machinery активны во время, когда происходит элиминация ДНК. У T. thermophila, малые РНК длиной в 28 nt появляются перед элиминацией83. В клетках, дефицитных по Twi1 - Piwi-родственному белку, который экспрессируется только во время конъюгации - эти малые РНК неспособны накапливаться и эксцизии IES не происходит83. Twi1 необходим для метилирования H3K9 в IES последовательностях, которые в свою очередь необходимы для элиминации84. Два белка, Pdd1p и Pdd3p, которые также необходимы для делеции IES последовательностей, соединяются с помощью своих chromodomains с гистоном H3, которые метилируется по K9 (Ref. 85).
Предложена модель, согласно которой малые РНК, генерируемые с помощью Dicer, осуществляют процессинг микроядерной dsRNA, сканируя геном старого макроядра. Любая малая РНК, которая лишена геномного партнёра для спаривания основаниями (т.е., та, которая соостветствует областям, которые элиминируются перед конъюгацией) 'subtracted out'86 и диффундирует в развивающееся макроядро, чтобы навести H3K9 метилирование IES последовательностей, которые действительно элиминируются79, 83,87 (Рис. 3B). Экспериментальное высвобождение dsRNA с помощью инъекций88 или скармливания бактерий80 запускает делецию гомологичной геномной ДНК, даже если она обычно сохраняется, указывая тем самым, что механизм м. находить любые последовательности. Роль, если таковая имеется, метилирования ДНК в элиминации IES не известна; нет доказательств, что N6-methyladenine - основной модифицируемый нуклеотид в ядерной ДНК T. thermophila и Paramecium tetraurelia - вовлекается в этот процесс (E. Meyer, personal communication).
IES последовательности, по-видимому, происходят из транспозонов79, 88. Итак, один и тот же тип последовательностей, которые запускают nucleation RNAi-based гетерохроматина у др. организмов, запускают также RNAi-родственный механизм у реснитчатых. Однако, вместо поддержания в молчании хроматин, ресничатые отторгают ДНК. Необходимо выяснить природу кухни ДНК-эксцизии и того, как её активность индуцируется с помощью герохроматин-подобных областей, которые образуются с помощью RNAi-обусловленных механизмов.

Meiotic silencing, pairing and RNAi


В течение всей истории исследований генного молчания гомологичное спаривание ДНК-ДНК рассматривалось как возможный триггер молчания. Подкрепляли эту идею исследования на filamentous грибке Ascobolus immersus89. Во время мейоза у этого организма метилирование ДНК м. передаваться с одного аллеля на др. в виде паттерна, характерного для GENE CONVERSION, указывая тем самым, что спаривание ДНК-ДНК обеспечивает этот процесс89. Однако, идея, что ДНК спаривание участвует в такого типа зависимом от гомологии молчании генов стала менее привлекательной с открытием siRNAs, которые д. функционировать как диффузионные trans-действующие сигналы гомологии для молчания. Тем не менее, спаривание гомологичных генов, по-видимому, участвует в молчании в некоторых случаях, хотя имеющиеся доказательства всё ещё указывают на взаимоотношение с RNA-обусловленными механизмами молчания. Прекрасным примером взаимоотношений между гомологичным спариванием и RNAi является феномен мейотического молчания не спаренных ДНК.
Meiotic silencing in Neurospora crassa. Молчание не спаренной ДНК во время мейоза выявлено благодаря исследованиям Ascospore maturation-1 (Asm1) гена у N. crassa90, 91. N. crassa является гаплоидом в своём вегетативном состоянии, но зиготическая форма диплоидна. Эти одиночные диплоидные клетки подвергаются мейозу, который использует спаривание гомологичных хромосом. Эндогенный ген Asm1 или трансген Asm1, помещённый в какую-либо часть генома, целиком активен, если он имеет партнёра по спариванию во время мейоза. Однако, одиночная не спаренная копия Asm1 молчит, так действует любая комбинация из трёх копий или даже двух копий, которые расположены в геноме таким образом, что они не м. ассоциировать. Итак, неспаренные копии гена у диплоидной мейотической клетки д. запускать молчание всех гомологичных копий , независимо от того, спариваются ли др. (Рис. 4).
Мутация гена suppressor of ascus dominance-1 (Sad1), который супрессирует этот механизм мейотического молчания, была изолирована 91. Эта мутация ревертирует молчание не спаренной ДНК, а также супрессирует фенотип доминантной стерильности некоторых др. мутаций, которые м. вызвать неспособность к мейотическому спариванию, а также доминантную стерильность, которая характерна для хромосомных дупликаций, которые также дают не спаренные области во время мейоза. Более того, скрещивания родственных видов - которые м. ожидать обладают хромосомной изменчивостью и, следовательно, д. давать не спаренные области у гибридов - являются стерильными, но эта стерильность частично преодолевается с помощью мутаций Sad1. Клонирование и секвенирование Sad1 показало, что он кодирует RdRP91,92, что обнаруживается в результате неожиданного соединения между спариванием ДНК и RNAi. Argonaute-подобный белок, Sms2 (suppressor of meiotic silencing 2), также необходим для мейотического молчания93, это ещё больше указывает на то, что RNAi machinery участвует в этом процессе. Мутации в генах DNA methyltransferase у N. crassa не затрагивают мейотическое молчание92. Однако, метилирование ДНК осуществляет - с помощью неизвестного механизма - влияние на предварительную ступень trans-sensing (объяснение на Рис. 4), это, как недавно было показано, генетически независимо от молчания94.
Характеристики не спаренных регионов, которые замалчиваются с помощью этого механизма, были проанализированы с использованием мутаций Asm1 гена95. Ряд делеций, которые хотя и перекрываеют ген целиком, были получены в гаплоидной линии, которые скрещивали с клетками противоположного типа спаривания, который несёт нормальную копию гена. Это давало диплоидные зиготические клетки, которые подвергались гомологичному спариванию во время мейоза. Для одиночной не спаренной копии, чтобы замалчивать саму себя (cis silencing), транскрибируемая область д.б. включена в петлеобразную область, которая образуется не спаренной последовательностью (Рис. 4). Согласуется с этим необходимость в продукции РНК в этом механизме, не спаренные промоторные последовательности гена не м. запускать молчание, хотя структурная часть гена спарена. Более того, молчание не спаренных генов не распространяется на спаренные соседние гены96. Хотя молчание м.б. достигнуто с помощью небольшой в 700 п.н. не спаренной ДНК, более длинные не спаренные области индуцируют более эффективное молчание. Напротив, когда гомологичные ДНК помещаются в какую-либо часть генома в не спариваемую конфигурацию, то фрагменты более чем 2 т.п.н. необходимы, чтобы вызвать молчание in trans95. Следовательно, trans молчание не является столь же эффективным, как cis молчание, хотя оба нуждаются в не спариваемых транскрипционных единицах.
Этот высоко специфичный тип молчания , следовательно, позволяет диплоидным клеткам определять и замалчивать вновь транспозированные мобильные элементы. Механизм м., таким образом, оперировать, чтобы защитить геном от необузданной транспозиции и соответственно высокой скорости мутаций. Процесс д. также функционировать как мощный механизм видоборазования, при котором хромосомные изменения среди отдельных эволюционных ветвей будут вызывать стерильность, если представители этих ветвей будут повторно объединяться и скрещиваться.
Related mechanisms in other organisms. Феномен, сходный с мейотическим молчанием не спаренных ДНК, но который использует модификации хроматина, описан у Caenorhabditis elegans. У этих видов неспаренная Х хромосома присуствует у самцов (которые имеют XO генотип), но не у HERMAPHRODITES (XX генотип). Во время мейоза не спаренные Х хромосомы становяттся мишенями для H3K9 метилирования независимо от полового фенотипа клеток, будь они нормальными самцами или XO особями, которые трансформированы с помощью пол-детерминирующих мутаций и фенотипически напоминают гермафродитов97. Изменения в др. гистоновых модификациях не обнаруживаются. В скрещиваниях с использованием самцов Х-хромосомные модификации персистируют в течение нескольких клеточных делений, вплоть до 20-клеточной стадии. Всё ещё неясно, почему это молчание необходимо, но оно м. отражать механизм геномного надзора, который выявляет новые инсерции мобильных элементов. Учитывая, что РНК участвует в мейотическом молчании у N. crassa и в таргетинге H3K9 метилирования у делящихся дрожжей, растений и животных, м. предполагать, что она участвует и в этой эпигенетической модификации также. Однако, подтверждения этой гипотезе пока нет.
Процесс, который оказывает противоположный эффект происходит в соматических клетках D. melanogaster, где гомозиготное спаривание определенных трансгенов приводит к снижению уровня экспрессии по сравнению с тем. когда две копии присутствуют в дисперсных, неаллельных позициях в геноме. Этот феномен обозначается как чувствительное к спариванию молчание98,99. У D. melanogaster гомологичные хромосомы являются спаренными в течение большей части жизненного цикла. Это делает возможным pairing взаимодействия, которые м. влиять на экспрессию генов в соматических тканях. Интересно, что чувствительное к спариванию молчание затрагивается мутациями генов, которые кодируют компоненты RNAi machinery, хотя и не тем способом, который м. было бы ожидать, исходя из приведенных выше данных. Для трансгенов engrailed-white, которые несут engrailed регуляторную область рядом с копией whiteгена пигментации глаз, гомозиготные piwi и homeless мутации увеличивают уровень молчания спаренных копий100. Не спаренные копии трансгена в той же самой геномной локализации оказываются незатронутыми, указывая тем самым, что это специфическое индуцируемое спариванием молчание, которое интенсифицируется у мутантов RNAi. Курьёзно, но этот эффект является противоположным к тому, что ожидается, исходя из потребности в siRNAs в качестве медиаторов молчания, т.к. такие РНК, как ожидалось, д. присутствовать в уменьшенных количествах или отсутствовать у этих мутантов, но степень молчания увеличивается. Тем не менее этот пример демонстрирует случай, при котором соматическое спаривание влияет на экспрессию гена, а путь RNAi, по-видимому, участвует в этом процессе.

Summary, conclusions and outlook


Findings from diverse organisms have revealed a prominent role for small RNAs and the RNAi machinery in eliciting sequence-specific silencing at the genome level. An impressive variety of effects have been reported: RNA-directed DNA methylation and histone methylation, DNA elimination and pairing-associated silencing. Despite the seeming ubiquity of small RNA-guided mechanisms, however, it is important to keep in mind that there are RNAi-independent pathways for heterochromatin formation24,25,101 and DNA methylation24,102-104 in organisms in which RNAi takes place.
Consistent with the role of RNAi in defence against invasive sequences11, 105, transposons and related repeats are preferred natural targets of the RNAi-mediated silencing pathways in the nucleus. Although often considered solely as molecular parasites, transposon sequences that function as foci for RNAi-based chromatin modifications benefit the host through these mechanisms by contributing to gene regulation and to chromosome structure and function.
Although a general picture of RNAi-mediated pathways in the nucleus has emerged, many questions remain. Foremost among these is the manner in which small RNAs interact with a target locus. Do small RNAs base pair with target DNA sequences or with nascent transcripts (Box 4)? Conceivably, both types of interaction have been exploited in nature, but conclusive experiments are still required. A related issue is the molecular composition of nuclear silencing-effector complexes, which have still not been characterized in most organisms. Defining these will require biochemical approaches similar to those that are used to identify proteins and siRNAs of the aforementioned RITS complex in fission yeast70,71. In A. thaliana, the reduced accumulation of repeat-associated siRNAs in several chromatin mutants is consistent with recruitment of these factors to the target locus by siRNAs13,44,46. However, biochemical analyses that show enrichment of siRNAs in association with chromatin proteins are required to confirm this proposal.
Another question concerns the extent to which gene-family members that encode RNAi proteins are dedicated to nuclear pathways. A subcellular division of activity has been noted for plants and N. crassa (Box 1), but information from other organisms is inadequate. Furthermore, the phylogenetic distribution of the four known RNAi-mediated nuclear pathways is not yet known. Does RdDM occur regularly in mammals? Are there examples of programmed DNA elimination mediated by RNAi in organisms other than ciliates? Meiotic silencing is probably not a universal mechanism, as indicated by the fact that heterozygous deficiencies have no affect on meiosis in plants, D. melanogaster or mammals, but does it occur in organisms other than N. crassa and C. elegans? Are there pairing-sensitive epigenetic phenomena in somatic cells that are dependent on RNAi components, as has been observed in D. melanogaster? Are there novel nuclear RNAi pathways that await discovery?
The pervasive involvement of small RNAs in defining chromosome domains and in chromatin-based gene regulation was unknown until only a few years ago. RNAi-mediated chromatin modifications not only determine patterns of gene expression, but also affect chromosome behaviour. Future research developments are likely to reveal further participation of the RNAi pathway in governing chromosome structure and function.
Сайт создан в системе uCoz