Tissue-specific spatial organization of genomes  Philip G McQueen and Tom MisteliGenome Biology 2004, 5:R44 doi:10.1186/gb-2004-5-7-r44 | |
  Рис.1. | Tissue-specific radial positioning of chromosomes  Рис.2. | Tissue-specific distances between chromosomes  Рис.3. | Tissue-specific relative positioning of chromosomes 12, 14 and 15  Рис.4. | Tissue-specific relative chromosome positioning correlates with tissue specific translocation frequency  Табл.1. | Relative interchromosome distances Additional data file 1 Contingency table for chromosomes 12, 14, and 15 triplet formation Additional data file 2 Contingency table for chromosomes 1, 12 and 14 triplet formation Additional data file 3 Contingency table for chromosomes 1, 12 and 15 triplet formation Additional data file 4 Contingency table for chromosomes 1, 14 and 15 triplet formation | Genomes are organized in vivo in the form of chromosomes. Each chromosome occupies a distinct nuclear subvolume in the form of a chromosome territory. The spatial positioning of chromosomes within the interphase nucleus is often nonrandom. It is unclear whether the nonrandom spatial arrangement of chromosomes is conserved among tissues or whether spatial genome organization is tissue-specific.
Using two-dimensional and three-dimensional fluorescence in situ hybridization we have carried out a systematic analysis of the spatial positioning of a subset of mouse chromosomes in several tissues. We show that chromosomes exhibit tissue-specific organization. Chromosomes are distributed tissue-specifically with respect to their position relative to the center of the nucleus and also relative to each other. Subsets of chromosomes form distinct types of spatial clusters in different tissues and the relative distance between chromosome pairs varies among tissues. Consistent with the notion that nonrandom spatial proximity is functionally relevant in determining the outcome of chromosome translocation events, we find a correlation between tissue-specific spatial proximity and tissue-specific translocation prevalence.
Our results demonstrate that the spatial organization of genomes is tissue-specific and point to a role for tissue-specific spatial genome organization in the formation of recurrent chromosome arrangements among tissues.
Хромосомы представляют наибольшие структурные единицы эукариотических геномов. Физически отличная природа каждой из хромосомы ясно выявляется в течение митозов, когда хромосомы конденсируются и появляются как отдельные объекты. Продемонстрировано, что хромосомы также физически отделены в течение интерфазы, когда каждая хромосома занимает хорошо определенный ядерный объем, обозначаемый как территория хромосомы[1,2]. Расположение хромосом в течение интерфазы вообще-то неслучайно [1,3,4]. В клетках растений с большими геномами и у Drosophila melanogaster , центромеры и теломеры помещены на противоположных сторонах ядра, приводя к расположению хромосом, известному как Rabl конфигурация [1,3,5]. В относящихся к млекопитающим клеткам этот паттерн организации генома редок; пространственная организация хромосом может быть описана их радиальным расположением относительно центра ядра [1,3,6]. В человеческих лимфоцитах, радиальное расположение хромосом коррелирует с плотностью генов в них, с плотным расположением генов хромосомы расположены ближе центру ядра, а бедные генами хромосомы, преимущественно расположены на периферии [7,8]. Замечательно, что предпочтительное радиальное расположение, по крайней мере, двух хромосом, 18 и 19, было эволюционно законсервировано в течение более чем 30 миллионов лет [9]. В дополнение к радиальному расположению, неслучайный характер организации генома отражен в расположении хромосом друг относительно друга [10]. Например, в клеточной линии из лимфомы от ATM-/- мышей, две транслоцированные хромосомы преимущественно располагаются в тесной близости др. к др., и к третьей хромосоме, из которой возникают транслокации из плотно упакованного кластера в нормальных лимфоцитах [10]. Этот тип неслучайного расположения родственных хромосом, как было предположено, возможно облегчает формирование транслокаций за счет увеличения вероятности незаконного соединения разорванных концов хромосом из размещенных рядом хромосом
В то время как это теперь хорошо известно, что хромосомы располагаются небеспорядочно [3,13,14], неясно, как подобная пространственная организация генома представлена в различных тканях. Анализ радиального положения хромосом 18 и 19 в различных типах клеток был не в состоянии найти существенные различия [15]. Кроме того, сравнение распределения нескольких хромосом в культуре ткани фибробластов и лимфобластов дало противоречивые результаты: положение некоторых хромосом, казалось, было в значительной степени законсервировано между двумя типами клеток, но с другой стороны, хромосомы 6, 8, и 21 были помещены по-разному [7]. И в обоих исследованиях использовалось только радиальное расположение в качестве единственного индикатора и распределения не сравнивали непосредственно друг с другом статистическими средствами [7,15]. В попытке исследовать пространственное расположение среди тканей более систематически, мы осуществили сравнительную картографию субнаборов хромосом в ядре клеток нескольких типов. С помощью статистического анализа нескольких критериев расположения, включая радиальное расположение, расположение родственных хромосом, измерения расстояний и кластерного анализа хромосом, мы получили свидетельства ткане-специфичности пространственной организации геномов. Results and discussion Мы стремились исследовать положение хромосом 1, 5, 6, 12, 14 и 15 в ядре в первичных клетках, недавно изолированных из тканей мыши. Мы визуализировали отдельные хромосомы с помощью флюоресцентной на месте гибридизации (FISH), используя хромосом-специфичные зонды, и анализировали их положение в нормальных интерфазных клетках, содержащих диплоидные наборы флуоресцентных сигналов (Рис. 1). Недавно изолированные и минимально культивированные первичные популяции клеток использовались, чтобы предотвратить потенциальную реорганизацию хромосом в течение длительного культивирования in vitro . Проверка распределения окрашенных хромосом выявила ткане-специфичность в расположении хромосом (Рис. 1a). Например, хромосома 5 преимущественно находилась в центре ядра в клетках печени, но была преимущественно на периферии в маленьких и больших клетках легкого, но располагалась в промежуточном положении в лимфоцитах (Рис. 1a).
Для количественного анализа расположения мы в первую очередь измеряли расстояния между центром ядра и центром массы каждого хромосомного сигнала как индикатора их радиального положения в двумерных (2D) проекциях из трехмерной (3D) картины, складывающейся как было описано ранее (Рис. 1b; см Materials and methods) [8,11]. Профили распределения хромосом показали значительные различия среди тканей (Рис. 1b). Статистический анализ попарных сравнений распределения отдельных хромосом, используя анализ таблицы непредвиденных обстоятельств во всех тканях, показал очень существенное отличие в радиальном расположении (Рис. 1c). Дифференциальное расположение, по крайней мере, в трёх типах клеток обнаружено вдля всех проанализированных хромосом (Рис. 1b, c). Из 71 попарного сравнения, 34 были статистически достоверны при p < 0.05 уровне (Рис. 1c). Большинство типов клеток обнаруживало общее расположение некоторых, но не др. хромосом. Например, маленькие клетки легкого и клетки печени имели общее положение хромосом 12 и 14 (все p - значения > 0.5), но не хромосом 5, 6 и 15 (Рис. 1b, c; все p - оценки < 3.1 х 10-4 ). наиболее сходное распределение хромосом было найдено в типах клеток, имеющих общие пути дифференцировки. Большие и маленькие клетки легкого имели общим распределение всех хромосом, а лимфобласты и миэлобласты отличался только по расположению хромосомы 5 (p = 0.02) (Рис. 1b,1c). Радиальное распределение в пределах типов клеток отличалось значительно по всем хромосомам, а наиболее отличны радиальные распределения были от униформного случайного распределения [7,8] (Рис. 1b ). Подобные результаты были получены в клетках, фиксированных или paraformaldehyde или с метанолом. Очевидно, что радиальное расположение хромосом в пределах интарфазного ядра является ткане-специфическим.
Чтобы исследовать относительные пространственные взаимоотношения между хромосомами в различных типах клеток, мы сначала измерили расстояния между самой близкой парой негомологичных хромосом в каждом ядре клетки (Таблица 1, Рис. 2). Абсолютные расстояния между хромосомами были измерены в двухмерных проекциях из 3-мерных стеков изображений и выражены как относительные расстояния, нормализованные к ядерному диаметру, чтобы учесть вариации в размере ядер между тканями. Мы находим существенные различия в физическом разделении шести из семи пар хромосом у разных типов клеток (Таблица 1, Рис. 2). Например, самые близкие гомологи хромосом 12 и 14 были отделены на 24.5 % ядерного диаметра в лимфоцитах, тогда как они были только отделены на 19.4 % в клетках печени. Это различие статистически высоко достоверно в тесте Холмогоров-Смирнова (p = 1.1 х 10-6). Сходным образом хромосомы 5 и 6 были разделены 25.0% ядерного диаметра в мелких клетках лёгких, но только 17.7% в клетках печени (p = 1.3 х 10-3) (Табл. 1, Рис. 2). В то время как большинство пар хромосомы имело статистически отличные разделяющие их расстояния, в некоторых тканях, хромосомы 1 и 12 оказалось более законсервированы в своих относительных позициях (Рис. 2). Различия в расстояниях между хромосомами не обусловлены различиями в размере или форме ядра клетки, на это указывают более короткие межхромосомные расстояния в почечных или больших клетках легкого по сравнению с лимфоцитами, ядра которых значительно меньше (Табл. 1) [15]. Кроме того, не выявляется никакой корреляции в расстояниях между хромосомами и размером ядра в больших и маленьких клетках легкого (Табл. 1).
Во-вторых, был использован более прямой критерий для тестирования относительного положения хромосом. Хромосомы 12, 14 и 15 имели, как уже сообщалось, неслучайное относительное положение в лимфоцитах, где они формировали плотно упакованный триплетный кластер [10]. Мы использовали пространственное кластрирование этих хромосом для дальнейшего тестирования расположения хромосом относительно др. др. в разных тканях. Для каждой ткани мы определили процент клеток, содержащих: 0 триплетов 12-14-15 (Рис. 3a); одиночный триплетный кластер, содержащий точно одну хромосому 12, 14 и 15 (Рис. 3b); одиночный кластер, состоящий из пары гомологов и дополнительной хромосомы (Рис. 3c); или кластер, состоящий из пары гомологов и более чем одной дополнительной хромосомы (Рис.3d). Как указывалось ранее кластер определялся как триплет, кагда все хромосомы были разделены не менее чем 30% ядерного диаметра [10]. Статистически достоверные количественные отличия в появлении четырех типов кластеров хромосом были выявлены в тканях с помощью contingency table анализа (Рис. 3a-d, , см. Additional data file 1).
Формирование самостоятельных типов кластеров было также доказано с помощью качественной проверки (Рис. 3e). Почти 50% крупных и мелких легочных клеток не содержали очевидных кластеров (Рис. 3a). Напротив, лишь 20% почечных и печеночных клеток не содержали кластеров (Рис. 3a). Около 30% лимфоцитов и миэлобластов не содержали кластеров (Рис. 3a). Как уже сообщалось кластеры, содержащие точно по одной копии хромосом 12, 14 и 15, превалируют в лимфоцитах с 35% клеток, содержащих такой кластер, но только 13% печеночных клеток и 17% мелких легочных клеток и 19% почечных клеток содержат такой кластер (Рис. 3b; 0.01<p < 0.05). Кластеры, содержащие одну гомологичную пару были более случайно распределены между тканями, но достоверные различия все ещё обнаруживаются. Почти 30% печеночных клеток, но только 12-15% мелких и крупных легочных клеток и лимфоцитов содержат этого типа аранжировку (Рис. 3c; p < 0.03 для всех сравнений). Сходным образом кластеры, одновременно содержащие негомологичную и гомологичную пару присутствовали с разными частотами в тканях. Они обнаружены примерно у 36% почечных и печеночных клеток, но только у 11% крупных легочных клеток (4.2 х 10-4 <p < 5.9 х 10-4) и 15% в лимфоцитах (Рис. 3d; 0.08 <p < 0.09). Статистическое тестирование образования триплетов с помощью contingency table анализа показало, что большинство триплетов обнаруживается с частотам, отличающимися от тех, что ожидались на базе случайного распределения хромосом (Рис. 3a-e, см. Additional data file 1).
Чтобы проверить, являются ли эти различия кластеров хромосом ограничены триплетом 12-14-15 или являются более общим свойством, анализировали кластеры, содержащие хромосомы 1-12-14, 1-14-15 и 1-12-15. Статистически достоверное дифференциальное появление относительного расположения хромосом в триплетах было обнаружено для всех этих хромосомных комбинаций (см. Additional data files 2-4). Сходные результаты получены, когда ближайшие хромосомные пары определялись как разделенные 20% ядерного диаметра (данные не показаны). Эти наблюдения строго указывают на то, что расположение хромосом относительно др. др. отличается в разных тканях.
Степень относительной пространственной близости хромосом, как известно, влияет на образования транслокаций при раке крови [3,10-12,16-18]. Т.к. транслокации из опухолей разных тканей, включая и опухоли крови и эпителия, часто характеризуются транслокациями между определенными наборами хромосом [19], мы предположили, что различия в пространственном расположении хромосом м. бы объяснить ткане-специфичность транслокаций. Чтобы проверить это предположение проверяли дифференциальное поведение транслокаций хромосомных пар 5, 6 и 12, 15 в лимфоцитах и печени мышей. Транслокации между хромосомами 5 и 6 часто возникали в мышиных гепатомах, но не обнаруживались в лимфомах; напротив, транслокации между 12 и 15 превалировали в лимфомах, но не в гепатомах [20,21]. Качественная проверка показала, что в гепатоцитах, склонные к транслокациям хромосомы 5 и 6 более часто находятся в тесной физической близости, чем не вовлекаемые в транслокации хромосомы 12 и 15 (Рис. 4a). Напротив, хромосомы 12 и 15 более часто оказывались в физической близости в лимфоцитах, но не в гепатоцитах (Рис. 4a). Для количественного анализа мы определяли количества гепатоцитов или лимфоцитов, содержащих, по крайней мере, близкими пары или 5-6 или 12-15 (Рис. 4a). Близость пар определялась, если две хромосомы оказывались разделенными менее чем 20% ядерного диаметра [10]. В гепатоцитах, тесные пары из хромосом склонных к транслокациям 5-6, обнаружены у 69% клеток, тогда кае только 55% клеток содержали пары из не вовлекаемых в транслокации хромосом12-15 (Рис. 4b). Эти различия были достоверными при p = 4.0 х 10-2 уровне в contingency table анализе. Напротив, 50% лимфоцитов содержали пары склонных к транслокациям хромосом 12-15, тогда как только 33% имели тесными пары из не участвующих в транслокациях хромосом 5-6 (Рис. 4b; p = 1.4 х 10-2). Кроме того, частоты 5-6 пар в гепатоцитах и пар 12-15 в лимфоцитах были выше ожидаемых для униформного случайного распределения хромосом, но ниже ожидаемых значений в тканях, где эти хромосомы не участвовали в транслокациях (Рис. 4b). Эти находки подтверждают более ранние наблюдения предпочтительного проксимального расположения склонных к транслокациям локусов в лимфоцитах [11], и расширяют их путем демонстрации корреляции между ткане-специфической пространственной близостью и ткане-специфичностью транслокаций.
Наши наблюдения предоставляют доказательства ткане-специфической пространственной организации геномов интерфазных ядер клеток. Мы показали. что субнабор мышиных хромосом обнаруживает дифференциальное ядерное распределение в разных тканях, мы полагаем, что дифференциальная пространственная организация является общим свойством большинства хромосом. Т.к. радиальное расположение некоторых хромосом эволюционно законсервировано, то ткане-специфиченость скорее всего д. обнаруживаться и у др. видов [9]. паттерны расположений хромосом были более сходны среди типов тканей, которые обладали общими путями дифференцировки, указывая тем самым, что расположение хромосом м. устанавливаться во время дифференцировки. Известно [15], что различия в позиционировании хромосом не связаны и изменчивостью размеров или формы клеток тканей, т.к., напр., морфологически экстремальные самостоятельные мелкие и крупные легочные клетки обнаруживают сходные паттерны распределения. Более того, т.к. изменения в расположении хромосом описаны для перехода G0/G1, то наблюдаемые нами различия вряд ли обусловлены эффектами клеточного цикла, т.к. расположение хромосом не существенно меняется во время интерфазы у делящихся клетках [22-25]. Мы полагаем, что наши подсчеты различий в расположении хромосом м.б. ниже действительных, т.к. вполне возможно, что наши изолированные популяции клеток содержат несколько типов клеток, которые м. характеризоваться разным расположением хромосом.
Функциональное значение ткане-специфической пространственной организации генома для генной экспрессия неясно. Возможно, что позиционирование хромосом в определенном ядерном соседстве м. экспозировать генные локусы к локальным концентрациям специфических регуляторных факторов или м. помещать локусы в транскрипционно молчащую гетерохроматиновую среду [3,26,27]. Эта модель согласуется с наблюдаемым периферическим расположением иммуноглобиновых локусов во время развития лимфоцитов и перераспределением некоторых специфичных для определенных стадий дифференцировки генных локусов прочь от центромер во время дифференцировки В клеток [28-30]. Хотя предыдущий анализ радиационно-индуцированных случайных транслокаций в лимфоцитах человека не дает положительных доказательств преимущественного относительного расположения хромосом [4], однако некоторые сообщения указывают на функциональную связь между неслучайным относительным расположением и образованием транслокаций. Ряд склонных к транслокациям хромосом и генных локусов выявлен в преимущественной пространственной близости к своим партнерам по транслокации и в нормальных клетках до возникновения транслокаций [10-12,14,16,17]. Наши наблюдения подтверждают это мнение, демонстрируя корреляцию между ткане-специфичной пространственной организацией и ткане-специфичностью частот транслокаций.
Неясно, как паттерны хромосомных распределений устанавливаются и поддерживаются. Возможно, что ядро содержит специфические структурные компонентs, которые предопределяют организацию генома. Ткане-специфичность геномной организации м. устанавливаться за счёт регулируемой экспрессии структурных белков, такиех как SATB1, специфичного для тимоцитов белка, который, как полагают, регулирует специфичные для тимоцитов гены путем соединения областей хроматина со структурным ядерным каркасом (scaffold) [31]. Интригующей альтернативной возможностью является то, что транскрипционный статус хромосомных областей влияет на их структурные свойства и что коллективная транскрипционная активность генома т.о. предопределяет его расположение само-организующим способом, базирующимся на физических свойствах хроматина и взаимодействующих полимеразах [32]. В нашем случае, хромосомы 12 и 15 содержат ядрышко-организующие центры, которые м. облегчать предпочтительную неслучайную ассоциацию этих хромосом. Наше наблюдение сходства в организации генома в типах клеток, которые обладают общими путями дифференцировки, согласуются с такой моделью само-организации.
|