Посещений:
Экспорт мРНК

Связь с транскрипцией и сплайсингом

Coupling transcription, splicing and mRNA export
Robin Reed (rreed@hms.harvard.edu)
Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:326–331

Previous studies have led to the view that mRNAs are transported from the nucleus to the cytoplasm by machinery that is conserved from yeast to humans. Moreover, this machinery is coupled both physically and functionally to the pre-mRNA splicing machinery. During the past year, important new insights into the mechanisms behind this coupling have been made. In addition, recent advances have revealed mechanisms for the co-transcriptional loading of the export machinery on to mRNAs. Finally, a newly identified link between the nuclear exosome and the machineries required for transcription, 30-end formation and mRNA export suggests that proper mRNP formation is co-transcriptionally monitored.
Во время экспрессии белок-кодирующих генов пре-мРНК транскрибируется в ядре и подвергается нескольким ступеням процессинга, включая capping, сплайсинг, 3'-end процессинг и полиаденилирование. Зрелая мРНК затем экспортируется через nuclear pore complexes (NPCs) в цитоплазму для трансляции. Хотя отдельные и чрезвычайно сложные машины обеспечивают каждую из ступеней в процессе генной экспрессии, растут доказательства, указывающие на существование факторий генной экспрессии, в которых индивидуальные машины находятся в функциональной связи. Такое купирование обычно не является облигаторным, т.к. в действительности все взаимосвязанные ступени генной экспрессии м.б. несвязанными в разных испытаниях. Т.о., связзь, по-видимому, существует, чтобы сделать возможным корректирование и направление течения всего процесса генной экспрессии in vivo. Взаимосвязь между разными ступенями генной экспрессии уже рассматривалась в обзорах [1-7].

Coupling splicing to mRNA export


Мнение, что сплайсинг связан с экспортом мРНК, впервые возникло при изучении metazoans, показавшего, что сплайсированные мРНК собираются в отдельные 'spliced mRNP' комплексы, которые нацеливают мРНК на экспорт [3]. Подобная целенаправленная отправка использует сплайсинг-зависимое рекрутирование мРНК-экспорт фактора Aly путём его непосредственных взаимодействий с белком UAP56 сплайсесом. У Saccharomyces cerevisiae, аналоги Aly и UAP56 также взаимодействуют др. с др. непосредственно и необходимы для экспорта мРНК. И у S. cerevisiae и у metazoans, Aly взаимодействуют непосредственно также с Tap, который вместе со своим партнёром по связыванию p15, ассоциирует с NPC и является, как полагают, общим рецептором экспорта мРНК. Установлено, что имеется законсервированная кухня (machinery) для экспорта мРНК, как это показано на Рис. 1 [3,6,8,9]. У metazoans, у которых большинство генов содержат интроны, эта законсервированная machinery интимно связана с кухней (machinery) сплайсинга. Напротив, у S. cerevisiae, у которых мало генов, содержащих интроны, кажется, что экспорт мРНК купирован с др. ступенями генной экспрессии.
Работа, начатая группой Moore, показала, что у metazoans законсервированная machinery экспорта мРНК (UAP/Aly/Tap) и др. компоненты spliced mRNP специфически рекрутируются в положение на 20 нуклеотидов выше exon-exon соединений [10]. Помимо участвующих в экспорте белков этот exon-junction complex (EJC) содержит некоторые белки, участвующие в nonsense-обусловленном распаде (деградации РНК, содержащих преждевременный стоп-кодон) и в цитоплазматической локализации мРНК. Т.о., EJC , как полагают, играет множественные роли в метаболизме мРНК. Интригующим свойством EJC является то, что он располагается на мРНК в специфическом сайте, но сиквенс-зависимым способом. Moore и др. начали выяснять механизм позиционирования EJC [10]. Их анализ выявил. что многочисленные белки (было выявлено 9) взаимодействуют с 5' экзоном в каталитически активной spliceosome. Во время связывания (ligation) экзона осуществляется основная перестройка в этой области, помещая три др. белка (p170, p95 и p57) в место, где образуется EJC [10]. Aly и SRp20 (члены семейства


Conserved mRNA export machinery coupled to splicing. UAP56 (Sub2 in yeast), which is present in the spliceosome, recruits Aly (Yra1 in yeast) to the mRNA during splicing. UAP56 is replaced by the mRNA export receptor TAP/p15 (Mex67/MTR2 in yeast).

SR белков сплайсинг-факторов) также контактируют с этой областью в EJC [10]. Эти пять контактирующих с РНК белков играют, следовательно, скорее всего ключевые роли в формировании EJC. Будучи сформированным EJC ассоциирует с мРНК, которые связаны в ядре с помощью cap-binding белка CBP80, но не с мРНК, связанными с помощью цитоплазматического eIF4E cap-binding белка [11]. EJC белки ассоциируют с CBP80-связанными мРНК как в ядре, так и цитоплазме, указывая тем самым, что весь EJC экспортируется и затем диссоциирует от мРНК в цитоплазме [11]. У дрожжей, Lei and Silver [12] использовали метод chromatin immunoprecipitation (ChIP), чтобы показать, что Yra1 (дрожжевой Aly) и Sub2 (дрожжевой UAP56) ассоциируют преимущественно с интронной областью сплайсинг-зависимым способом. Т.о., возможно, что оба сплайсинг-зависимых пополнения и мРНК-экспорт и образование EJC machinery также законсервированы.
Mattaj и др. [13] изучали роль сплайсинга в экспорте мРНК путём создания гибридной U1 snRNA, в которую были вставлены экзоны, интроны или случайные последовательности. Авт. пришли к выводу, что мРНК содержат 'identity element', который они обозначили как неструктуированные последовательности, по крайней мере, длиной примерно в 300 нуклеотидов. Этот идентификационный элемент достаточен для перенаправления гибридной РНК прочь от пути экспорта U1 snRNP на путь экспорта UAP/Aly/TapmRNA, даже в отсутствие сплайсинга. В согласии с ранними исследованиями [3], становится ясным, что сплайсинг несущественен для экспорта, но увеличивает эффективность рекрутирования экспорт-факторов.
В исследованиях на Drosophila с помощью RNA interference (RNAi) Gatfield and Izaurralde [14] пришли к выводу, что хотя и Tap и UAP56 необходимы для экспорта мРНК, однако и Aly и др. компоненты EJC необязательны. Авт. полагают, что д. существовать ещё не установленные адапторные белки, обеспечивающие взаимодействие между Tap и мРНК. Однако, существуют и альтернативные возможности; RNAi-обусловленный нокдаун Aly и др. белков EJC м. оказаться недостаточным, чтобы устранить его функции или м.б. перекрывание факторов. В самом деле новые заключения трудоно сопоставить с предыдущими работами. Напр., антитела к Aly блокируют экспорт мРНК, а рекомбинантные Aly стимулируют экспорт мРНК [3]. Более того, физическая и функциональная консервация UAP, Aly и Tap от дрожжей до человека указывает на то, что эти белки являются ключевыми в экспорте мРНК [3,8].

Coupling transcription to mRNA export


Хотя путь UAP/Aly/Tap законсервирован, экспортная machinery не единственная, которая рекрутируется с помощью зависящего от сплайсинга механизма. В самом деле, около 95% генов S. cerevisiae, а также некоторые гены metazoan, лишены интронов. Тем не менее, и у metazoans и у дрожжей законсервированный UAP/Aly/Tap путь, необходимый для экспорта мРНК, осуществляется генами, лишенными интронов [14]. Т.о., главное внимание последних работ сосредоточено на определении механизмов независимого от сплайсинга рекрутирования этой machinery. В группе Silver были получены доказательства того, что кухня экспорта мРНК рекрутируется ко-транскрипционно у S. cerevisiae [6].
Strasser et al. [15] показали, что Sub2 и Yra1 специфически ассоциируют с мультисубъединичным комплексом THO, который как полагают, участвует в трнскрипционной элонгации [16]. Нулевые мутантны в любой субъединице комплекса THO (Hpr1, Tho2, Mtf1 и Thp2) обнаруживают также необычно высокий уровень зависимой от транскрипции рекомбинации ([16,17]. Такой гипер-рекомбинационный фенотип м.б. вторичным следствием дефекта полимеразной элонгации, который и подставляет транскрипционные единицы под рекомбинацию [16]. В исследовании Strasser et al. [15], все 4 субъединицы THO комплекса взаимодействовали генетически и физически и с Yra1 и Sub2. Кроме того, мутанты с нулевым THO-комплексом были дефектны по экспорту мРНК. Наконец, с помощью метода ChIP установлено, что компоненты THO комплекса, а также Yra1 и Sub2, ассоциируют с транскрибируемыми генами [15,18]. Комплекс THO вместе с белками экспорта мРНК обозначен как transcription export complex (TREX) [15]. Это согласуется с данными, подтверждающими модель, согласно которой комплекс TREX играет роль в купировании транскрипции с экспортом мРНК. Stutz и др. [18] модернизировали эту модель, показав, что THO/TREX компонент Hpr1 взаимодействует непосредственно с Sub2 и играет роль в рекрутировании Sub2 и Yra1 на активно транскрибируемые гены.
В др. исследовании на S. cerevisiae, Hurt и др. [19] идентифицировали то, что скорее всего является новым компонентом законсервированной machinery экспорта мРНК, связанной с транскрипционной machinery. Осуществляя скрининг синтетических леталей по Yra1 (дрожжевой Aly), они идентифицировали ген Sac3. Белок Sac3 также был идентифицирован с помощью масс-спектрометрии в результате его ассоциации с Sub2 (дрожжевой UAP56) в дрожжевых лизатах [15]. Sac3, как было установлено, взаимодействует непосредственно с Mex67 (дрожжевой Tap). Т.о., Sac3 взаимодействует физически и функционально со всеми компонентами UAP/Aly/TAP пути. Но история на этом не закончилась; Sac3 формирует также комплекс с Thp1, белком, как полагают, участвующим в транскрипционной элонгации, а Hurt и др. [19] показали, что как Sac3, так и Thp1 необходимы для экспорта мРНК. Более того, Sac3 взаимодействует также с двумя нуклопоринами (Nup 60 and Nup 1), которые локализуются на нуклеоцитоплазматической стороне NPC и которые необходимы для экспорта мРНК. На основании этих наблюдений, Hurt и др. предложили модель, в которой Sac3 сначала ассоциирует с мРНП в самом начале его образования, а затем путём взаимодействия с Mex67 и двумя нуклеопоринами, облегчает присоединение мРНП к комплексу ядерной поры.
Группа Silver's [20] также идентифицировала Sac3 при скрининге синтетических леталей с использованием известного фактора экспорта мРНК MTR2 (малой субъединицы Mex67/MTR2 рецептора экспорта мРНК [Tap/p15 у metazoans]). Sac3 , как было установлено, участвует в экспорте мРНК, взаимодействуя генетически с некоторыми факторами экспорта мРНК и ассоциируя физически с Mex67, MTR2 и специфическими белками, ассоциированными комплексом ядерных пор, участвующими в экспорте мРНК. Иммунолокализация Sac3 показала, что он ассоциирует с цитоплазматическими фибриллами NPC. Когда Sac3 мутантен, то Mex67 накапливается на ядерном ободке [20]. Silver и др. [20 ] предположили, что Sac3 играет роль на терминальной ступени процесса, причём Mex67 транслоцируется через NPC. Рассматривая работы Hurt и Silver, становится очевидным, что Sac3 ассоциирует с мРНК во время транскрипции, играя роль в присоединении Mex67 к ядерной поре, а затем участвует в транслокации Mex67 через ядерную пору. Аналоги у метазоа Sac3 и Thp1 также идентифицированы.

Links between mRNA export and other steps in gene expression


Группе Jensen [21] и группе Stutz [18] удалось связать TREX комплекс с ядерными экзосомами, большими комплексами из 30 - 50 экзонуклеаз, участвующими в многочисленных путях процессинга и деградации мРНК. Были выявлены генетические взаимодействия между экзосомами и компонентами комплекса TREX. Более того, Yra1 взаимодействует физически с экзосомным белком Rrp45 [18]. Ранее было показано, что мутанты по комплексу TREX генерируют транскрипты, которые укорочены с их 3' конца [16]. Jensen и др. показали, что у таких мутантов, также как и у мутантов, затрагивающих собственно формирование 3' конца, мРНК быстро секвестрируются вблизи мест своей транскрипции [21]. Оба эти фенотипа м. нормализовать с помощью делеции экзосомного компонента Rrp6 [21]. Всё это приводит к мнению, что формирование мРНП отслеживается экзосомами и в результате осуществляется удерживание и деструкция аберрантных мРНП в месте их транскрипции [7,18,21].
Выявлена ещё одна связь между экзосомами и факторами транскрипционной элонгации (Spt5 и Spt6) [22]. В этом исследовании Lis и др. показали. что экзосомы физически ассоциируют с Spt5 и Spt6 и рекрутируются на активно транскрибируемые гены, возможно с помощью этих белков. Предлагается модель того, как экзосомы, комплекс TREX, Spt5 и Spt6 регулируют транскрипционную элонгацию, образование мРНП и экспорт. Согласно этой модели Spt5 и Spt6 рекрутируют экзосому на RNA polymerase II на ранней стадии транскрипции (Рис. 2). Комплекс TREX, который ассоциирует с геном на поздней стадии транскрипции, м. физически защищать мРНП от экзосом или м. даже функционировать как ингибитор экзосом (Рис. 2a). Если комплекс TREX отсутствует (как у TREX-нулевых мутантов), то активность 30 - 50 exonuclease экзосомы разрушает растущую мРНП и ведет к диссоциации РНК полимеразы от ДНК и т.о., блокирует транскрипционную элогнацию (Рис. 2b). Если и TREX


In this model, coupling the transcription and export machineries to the exosome enables the monitoring of proper mRNP formation. The exosome is recruited during transcription, possibly by the elongation factors Spt5 and Spt6. When the TREX complex is present, a proper mRNP is made containing export proteins (Aly and UAP56) and the mRNA is exported (a). In the absence of the TREX complex, the exosome degrades the mRNA from the 30 to the 50 end and the transcription machinery dissociates (b). When both the TREX complex and the exosome are absent, transcription can occur but the mRNP lacks export proteins and is not exported (c).

комплекс и экзосома отсутствуют, то генерируются транскрипты полной длины, но они не экспортируются, т.к. не поставляется экспортная machinery (Рис. 2c). Т.о., причиной соединения экзосом с комплексом TREX является обеспечение того, чтобы любой транскрипт, который лишен комплекса TREX, несмотря на присутствие мРНК экспортной machinery, направлялся на деструкцию.
Хотя большое число доказательств указывает на то, что кухня экспорта мРНК ко-транскрипционно загружается на мРНК у дрожжей, однако, формирование 3' конца м. играть более критическую роль в этой загрузке. Напр., Lei and Silver [12] нашли, что Sub2 не нужна для рекрутирования Yra1 на гены, у которых отсутствуют интроны. Однако, собственно образование 3'-концов необходимо для рекрутирования этого фактора, независимо от того присутствует или нет интрон. Это подтверждает ранние работы, показавшие, что образование 3' конца важно для экспорта мРНК [6,7]. Группа Rosbash's недавно сообщила, что транскрипты, генерируемые с помощью T7 полимеразы (т.е. не с помощью RNA polymerase II) экспортируются только, если образование 3'-конца происходит нормально [23]. Это подтверждено и в работе Hammel et al. [24]. При скрининге генов, необходимых для экспорта мРНК, выявлено несколько факторов, участвующих в терминации и 3' процессинге. Это исследование показало также, что делеции последовательностей в мРНК, которые участвуют в купировании завершения и образования 3' конца, ведут к синтезу транскриптов, которые не м.б. экспортированы. Следовательно, терминация, 3' процессинг и экспорт мРНК взаимосвязаны.

Coupling transcription and splicing to mRNA export in metazoans


Исследования на metazoans подтвердили, что транскрипция м. влиять на сплайсинг и наоборот [25-28]. В частности, Strasser et al. [15] идентифицировали скорее всего аналог комплекса TREX у млекопитающих. Как и у дрожжей этот комплекс содержит белки экспорта мРНК (Aly и UAP56), а также компоненты комплекса THO (hTho2 и hHpr1). Пока неясно, может ли этот предполагаемый комплекс


In this model, coupling transcription, splicing and export via the TREX complex targets the export machinery to exons. Metazoan introns are typically very large whereas the exons are minute. The TREX complex may associate with the spliceosome to allow co-transcriptional loading of the export machinery (Aly and UAP56) onto exons, which are destined for export, and to exclude this machinery from the introns, which are retained in the nucleus.

TREX млекопитающих ассоциировать с синтезируемой пре-мРНК во время транскрипции. Однако, все компоненты комплекса TREX млекопитающих обнаружены в очищенных сплайсесомах [29-32]. Т.о., TREX комплекс м. функционировать, чтобы связать и транскрипцию и сплайсинг с экспортом мРНК у метазоа. У metazoans многочисленны интроны обычно в тысячи и десятки тысяч нуклеотидов, а могут быть и больше до нескольких сотен тысяч нуклеотидов. Экзоны в среднем длиной в 100 нуклеотидов. Как показано на Рис. 3, комплекс TREX м.б. ассоциирован с сплайсесомами в качестве механизма для ко-транскрипционного таргетинга факторов экспорта мРНК только в экзоны, которые предназначены для экспорта, а не в интроны, которые деградируют в ядре.

Conclusions


Recent studies strengthen the view that mRNA export is coupled to other steps in gene expression including splicing, transcription, and 30-end formation. In addition, new links between mRNA export, transcription and the nuclear exosome were revealed. Future directions will include a detailed characterization of the spliced mRNP and EJC that couples splicing to mRNA export. In addition, the role of the TREX complex in export and transcription, and the relationship between these processes and the nuclear exosome remain to be determined. Finally, the molecular basis for coupling 30-end formation to mRNA export must be identified.
Сайт создан в системе uCoz