Посещений:
Стереоцилии

Регуляция Длины

When size matters: the dynamic regulation of stereocilia lengths
Harrison W Lin, Mark E Schneider and Bechara Kachar
Current Opinion in Cell Biology Volume 17, Issue 1 , February 2005, Pages 55-61

Stereocilia, the mechanosensitive protrusions in hair cells, are organized into rows of graded heights forming precisely uniform staircase patterns. The actin turnover process in stereocilia follows a treadmill model in which the rate of treadmilling is scaled to the stereocilium's length. Myosin XVa, which is present at the site of actin polymerization at concentrations proportional to the length of the actin filament bundles, plays a combined role with the treadmill machinery in regulating the steady state length of these actin protrusions, together with other myosins localized alongside the actin bundles.

Enlarge Image
Рис.1.  |   Consensus model of proteins that specify the structure and dynamic regulation of actin protrusions. Long continuous actin filaments are uniformly oriented such that the ‘plus’ or ‘barbed’ ends are at the tips of the protrusions and the ‘minus’ or ‘pointed’ ends at the base with the barbed end of the filament directed towards the tip of the protrusion. Actin filaments are bundled and packed to varying degrees with several different actin cross-linkers. Capping proteins, ‘leaky’ caps, myosins, scaffolding proteins, integrins and signaling proteins form a tip-complex structure visualized by electron microscopy as a distinct dense matrix at the tips of actin protrusions.

Enlarge Image
Рис.2.  |   Actin incorporation and turnover in stereocilia. Diagram (a) and scanning electron microscopy micrographs showing the staircase order of the stereocilia in (b) auditory and (c) vestibular hair cells. Confocal microscopy images shows actin–GFP incorporation (green fluorescence) into stereocilia (counterstained with rhodamine phalloidin) is scaled to their respective length in auditory (b) and vestibular (c) stereocilia bundles. This actin incorporation is part of a continuous process of actin renewal that has been modeled as a molecular treadmill [8]. (d) In the treadmill model, actin polymerization and espin cross-linking into the actin bundle occur at the barbed end of actin filaments near the stereocilium tip complex. Paracrystal disassembly and actin filament depolymerization occurs at the pointed end of actin filaments at the base of the stereocilia. When the rate of assembly at the tips is equivalent to the rate of disassembly at the base the paracrystal undergoes a rearward flow or treadmilling and the paracrystal length is dynamically maintained constant. Scale bar represents 0.5 µm.

Enlarge Image
Рис.3.  |   Intrinsic and extrinsic mechanical factors influence actin treadmilling and help shape stereocilia functional architecture. Diagram of a longitudinal section view of two neighboring stereocilia linked by tip and lateral links illustrating the localization and possible relationship of myosins to the treadmilling actin core. The stereocilia membrane with a smooth profile wraps tightly around the actin filaments, which display a well ordered gradation in heights (see micrograph in the inset). In order for actin filaments to conform to such ordered gradation in lengths, the actin elongation machinery must directly or indirectly sense a compressive force normal to the membrane tension (black arrows) and regulate actin polymerization and the concomitant protrusive force that may be generated. In such a model, actin elongation would stall at a point of balance between the opposing forces produced by the membrane tension and the actin polymerization. Tip link tension may influence the stereocilia tip complex and rates of actin incorporation to produce actin filaments with graded lengths that meet the encapsulating membrane of the shorter stereocilia as observed by electron microscopy (insert). Localized to the stereocilia tip complex, myosin XVa could regulate or coordinate actin polymerization but could also directly influence polymerization by pushing on the cytoplasmic side of the membrane upwards (red arrows) and facilitating monomer incorporation [8]. Tension on the tip link (brown arrow) could also pull the membrane and bias the actin polymerization machinery towards elongation of the underlying filaments. Other myosins localized lateral to the paracrystal may have a role in retrograde flow or in the dynamic positioning of the stereocilia links along the actin bundle as it treadmills. Scale bar represents 0.1 µm.

Базирующиеся на актине клеточные выпячивания выполняют широкий круг функций в клетках эукариот. Длина и продолжительность жизни этих клеточных выростов (protrusions) - соответствующие тому, насколько часто критически подогнаны они ко своим специфическим функциям - зависит от сложных механизмов, которые регулируют формирование и динамические свойства кабелей из актиновых филамент, которые составляют стержневую структуру выростов. Хотя уже много известно о сигнальных механизмах и процессах сборки, которые инициируют формирование этих структур1-4, значительно меньше известно о том, как эти структуры регулируют свою длину.
Стереоцилии или пучки волосков, механосенсорные органеллы на апикальной поверхности слуховых и вестибулярных волосковых клеток, составляют самостоятельный класс базирующихся на актине клеточных выростов, которые обладают не одинаковой способностью поддерживать свою длину во времени. Стереоцилии организованы в пучки из рядов градированной длины, так что каждый пучек имеет довольно точно специфицированную длину, форму и набор механических свойств, подогнанных под избирательную частоту стимулов и чувствительность волосковых клеток5,6. Каждый стереоцилий поддерживается ригидным паракристаллиновым набором из нескольких сотен параллельных, униформно поляризованных и регулярно связанных поперечно актиновых филамент, которые обладают многими общими конструкционными принципами с образованиями актина в микроворсинках и филоподиях, они м.б. более 120 µm в длину и сохраняться в течение всей жизни.
Недавние исследования включения и оборота актина в стереоцилиях7,8, а также идентификация новых белков, которые в мутантном состоянии вызывают глухоту из-за разрушения стереоцилий [9], проливают свет на механизмы и молекулы, участвующие в регуляции их устойчивого состояния длины.

Common underlying structure


Во время образования микроворсинок, флоподий и стереоцилий клеточные ансамбли актиновых филамент собираются в кабели различных измерений для создания необходимой механической поддержки и ригидности, необходимых для функционирования соотв. органелл. Хотя они отличаются по количеству филамент - микроворсинки и филоподии имеют пригоршню филамент, тогда как в стереоцилиях их сотни - все три типа клеточных выростов состоят из актиновых филамент идентичной полярности (Рис. 1). Актиновые филаменты ориентированы так, что 'плюс' или 'barbed' концы находятся на кончиках выростов, а 'минус' или заостренные 'pointed' концы в основании [10]. Более того, эти три системы используют белки поперечного связывания, чтобы стабилизировать соседние филаменты, тем самым создается дополнительная ригидность актиновых кабелей. В то время как филоподии используют fascin, а микроворсинки fimbrin, villin и espin, тобы создать относительно рыхлые актиновые кабели, стереоцилии являются плотными поперечно связанными с помощью fimbrin и espin формами уникальных жестких паракристаллиновых актиновых кабелей [11]. Итак, количество филамент, плотность их упаковки и природа и частота поперечных связей помогают предопределять структурные и динамические свойства этих актиновых выростов. При сравнении филоподий, микроворсинок и стереоцилий наиболее интригующее сходство наблюдается при электронной микроскопии (ЭM), это присутствие плотного матрикса, связывающего barbed конец актиновых филамент с лежащей поверх плазматической мембраной (Рис. 1). Этот плотный матрикс, называется также верхушечное уплотнение ('tip density') или верхушечный комплекс ('tip complex'), как полагают, содержит молекулярную оснастку, которая обеспечивает каолицию актиновой филаменты во время генеза филоподий [3]и стереоцилий [8].

Continuous actin turnover


Микроворсинки, филоподии и стереоцилии постоянно обновляют свой стержневой актин и динамически поддерживают свою структуру. Оборот актина в этих органеллах был смоделирован как актиновый конвейер, с помощью которого мономеры постоянно добавляются к колючему (barbed) концу филаменты, сдвигаются по направлению к тылу и удаляются с их pointed конца, в результате чего филамента сохраняет постоянную длину при динамическом устойчивом состоянии7, 12, 13. Кроме того, внутри стереоцилий, как было продемонстрировано с помощью нагруженных green fluorescent protein (GFP) белков, происходит синхронный оборот поперечно связывающих актин белка espin, подтверждая, что процесс полимеризации актина, поперечное связывание и конвейерная замена мономеров интегрированы [8]. Скорость конвейера (not, vert, similar0.004-0.04 subunits per actin filament per second) в зрелых стереоцилиях [8] медленнее, чем скорости, измеренные для актиновых филамент in vitro (0.415 s-1) [14]. Скорость оборота актина в параллельных филаментах микроворсинок и филоподий более чем в 100 раз быстрее, хотя конечно эти структуры динамически меняют свою длину12,13,15. Во время фазы роста stereocilium скорость оборота актина более чем в 50 раз быстрее, чем скорость в зрелых стереоцилиях [7]. Несмотря на эти количественные различия м. предположить, исходя из данных литературы, что все три системы в целом используют сходные принципы, чтобы управлять сборкой и динамической поддержкой актиновых филамент, так что весь стрежневой актин подвергается тотальной сборке на кончиках, конвейер сдигается назад и разбирается у основания.

Length and treadmill rates are matched in stereocilia


Как клетки регулируют конвейерный процесс актина неизвестно, но сдвиги есть. В подвижных клетках с многочисленными филоподиями независимая регуляция полимеризации актина на кончиках, ретроградный сдвиг и деполяризация у основания м. приводить к конкурентному удлинению, укорочению или поддержанию стабильного состояния филоподий в отношении размера [12]. В микроворсинках незначительные изменения в скоростях сборки актиновых кабелей м. приводить к прогрессивному удлинению [15]. В волосковых клетках, однако, скорость движения конвейера в стереоцилиях в точности соответствует тонкой регуляции длины актиновых выростов (Рис. 2), а, следовательно, время пребывания мономера внутри актиновой филаменты в самом коротком стереоцилии эквивалентно тому, которое требуется инкорпорированному мономеру в самом длинном стереоцилии пучка волосков [8]. Корреляция между скоростью полимеризации актина, конвейерным перемещением и физическими размерами соотв. структур открывает новые возможности для объяснения, как сборка актинового кабеля и кухни поддержания оказываются сопоставимыми с соотв. длиной выроста. Всё ещё не установлено, какой аспект динамики филамент - регуляция полимеризации актина на кончиках, сдвиг к тылу в направлении тела клетки или разборка на проксимальных концах филамент - играет наиболее важную роль в регуляции скорости перемещения конвейера и длины актиновых филамент. Согласно простейшей модели д. происходить накопление регуляторного компонента на кончике или вдоль всей длины каждого стереоцилия. Подобное градированное распределение обнаружено для myosin XVa, который присутствует на кончике стереоцилия вблизи сайта полимеризации актина [8].

Controlling actin polymerization at the tips


Одним из механизмов контроля элонгации актина с колючего конца является действие capping белков [5]. Capping protein (CP) и gelsolin связываются с колючим концом актиновых филамент с варьирующим сродством и связывание ингибирует рост колючего конца за счет предупреждения добавления мономера4,16. Недавно были охарактеризованы два семейства белков как 'leaky caps', которые делают возможным ослабленное, но постоянное удлинение актиновых филамент (Рис. 1). Первым из них является Ena/VASP (Drosophila enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein) семейство белков, которые посредством связывания с колючими концами актиновых филамент предупреждают полное capping и ведут к элонгации филоподий2,17,18 и микроворсинок [19]. Члены большого семейства актиновых nucleators, называемые formins, являются вторым потенциальным регулятором элонгации актиновых выростов16,20. Подобно Ena/VASP, formins временно защищают колючие концы актиновых филамент от скудных capping белков, таких как CP или gelsolin и делают возможной элонгацию филамент. хотя и с пониженной скоростью [20]. Когда leaky cap покидает колючий конец, то будет ли соединяться с ним или capping белок или др. leaky cap будет зависеть от их локальной концентрации [20]. Оба семейства Ena/VASP и formin белков, как было показано. являются нижестоящими эффекторами нескольких сигнальных каскадов16,18,20,21. Будущие исследования д. прояснить возможную роль этих или гомологичных белков в регуляции полимеризации актина на кончиках стереоцилий.

The role of unconventional myosins at the tip complex of actin protrusions


Понимание молекулярных взаимодействий в верхушечном комплексе их взаимоотношений с регуляцией динамики актина начинается. Myosins X и XVa являются существенными для элонгации филоподий и стереоцилий. Myosin X формирует агрегаты на кончиках филоподий и когда он избыточно экспрессируется в культивируемых клетках, то увеличивается и количество и длина филоподий22,23. Myosin X, как полагают, играет роль в формировании и поддержании филоподий путем транспорта гомолога млекопитающих Ena (Mena)/VASP, медиатора удлинения актина, и integrins (внеклеточных компонентов присоединения) на кончики филоподий23,24. Myosin XVa [25], который содержит PSD-95/Dlg/ZO-1 (PDZ)-связывающий домен и несколько структурных и регуляторных мотивов, найденных в myosin X, локализуется на кончиках стереоцилий с ранних стадий их формирования [8] и м. участвовать в регуляции полимеризации актина8,26-28.. Наиболее поразительно, что уровни экспрессии myosin XVa пропорциональны длине стереоцилий внутри лесенкообразного пучка [8]. Если myosin XVa отсутствует, как это наблюдается у deaf shaker 2 мышей, то стереоцилии оказываются укороченными и имеют закругленные кончики, лишенные верхушечного комплекса [8], а если он избыточно экспрессируется, то стереоцилии удлиняются (Lin et al., unpublished). Возможность, что молекулярная кухня для элонгации актина содержит ассортимент взаимодействий, чтобы сформировать тщательно организованный верхушечный комплекс, подчеркивается предполагаемой поддерживающей ролью whirlin, новой PDZ-мотив-содержащей молекулы, которая в мутантном состоянии вызывает глухоту и укорочение стереоцилий у whirler мышей [29]. Т.к. мутации myosin XVa и whirlin продуцируют очень сходные фенотипы укороченных стереоцилий, то вполне возможно, что они м. участвовать в PDZ взаимодействиях или в др. типах взаимодействий, чтобы помочь организовать верхушечный комплекс на стереоцилиях [28]. Дальнейшие исследования этих миозинов и их молекулярных партнеров д. позволить выяснить, играют ли эти миозины поддерживающую роль транспортирования элементов к месту полимеризации актина или м. оказывать и непосредственное влияние на динамику колючих концов путём удаления стерических препятствий или capping элементов и облегчения добавления мономеров.

Mechanical influences on actin protrusions


В более ранних сообщениях постулировалось, что механические растяжения связей стереоцилий и активация передающей кухни может контролировать высоту стереоцилий [5]. Недавние исследования стереоцилий показали, как внутренние и внешние механические факторы могут помогать предопределять длину и форму пучков параллельных актиновых филамент. EM изображения (Рис. 3) показывают. что мембрана стереоцилия обладает гладким профилем с натянутым видом, так, как будто она обернута вокруг актиновых филамент градированной длины8,30. Более того, искажение мембраны, возникающее в результате того, что верхушечная связь (tip link), натянутая в направлении более высокого стереоцилия, продуцирует "заостренный" ('pointed') кончик с актиновыми филаментами, поддерживающими упорядоченную градацию длин, навстречу покрывающей их мембране [8]. Если верхушечная связь нарушена и эксцентрический пул уменьшен, то кончики стереоцилий быстро укорачиваются и ремоделируют округленную форму [8]. Касательно актиновых филамент, чтобы осуществить такую упорядоченную градацию длин, кухня удлинения актина д. непосредственно или опосредованно ощущать силы давления, обычные для натяжения мембраны, и регулировать полимеризацию актина и сопутствующие protrusive силы, которые могут быть созданы. Согласно такой модели элонгация актина д. останавливаться в точке баланса между противоположными силами, генерируемыми натяжением мембраны и полимеризации актина (Рис. 3). Недавние находки показали, что постоянная элонгация коротких параллельных областей пучков актиновых филамент м. генерировать protrusive механические силы, если движение вновь удлиняемых актиновых филамент быстро улучшается за счёт связывания филамент в пучки с помощью поперечно-связывающих белков [31]. Сходным образом, espin включается в актиновые кабели на кончиках микроворсинок и стереоцилий и соответ. осуществляет сдвиг актина в направлении тела клетки [8]. В самом деле, избыточная экспрессия espin вызывает удлинение микроворсинок в культивируемых эпителиальных клетках [15] и стереоцилиях (Rzadzinska et al., unpublished).

Retrograde flow of the actin cables


Силы, влияющие на сдвиг в направлении тыла актинового кабеля, д. также влиять на регуляцию длин актиновых выростов. Ингибирование полимеризации актина, напр., при использовании cytochalasin D в волосковых клетках, укорачивает стереоцилии со скоростями, соответствующими их скоростям конвейерного движения [8]. Это укорочение выявляет направленное тыл управляемое движение актинового кабеля по мере того, как они деполимеризуются у основания. Это направленное в тыл движение аналогично centripetal движению актиновых филамент внутри филоподий12,32. Было предположено, что моторами управляемый механизм, процесс, описанный как 'retrograde flow', облегчает или усиливает движение в тыл актина в филоподиях, хотя роль предполагаемых участвующих семейств миозинов - myosins I и II - остается противоречивой33,34. Myosin VIIa, др. неконвенционный миозин, который в мутантном состоянии вызывает нарушения стереоцилий [35], локализуется в стереоцилиях вдоль актиновых пучков8,36. Показано также, что myosin VIIa35-38 взаимодействует с др. белками, ассоциированными с мембранами и связками стереоцилий. Каким образом myosins м. усиливать ретроградное смещение, неясно. Безопорная природа стереоцилий, подобно микроворсинкам, представляет собой уникальное расположение клеточных выростов, радикально отличающихся от таковых у филоподий, чьи миозины м. ангажировать соединенные с субстратом молекулярные муфты (clutch), которые делают возможным силой их управлять конвейерным движением актинового пучка [39]. Несмотря на это, из-за того, что соседние стереоцилии соединены при помощи многочисленных поперечных связей между стереоцилиями [40], всё ещё возможно, что myosin VIIa и Ic м. облегчать обратный сдвиг благодаря продукции shear силы между паракристаллом и энкапсулирующей мембраной (Рис. 3).

Conclusions


Stereocilia offer an excellent model system to resolve the mechanisms involved in actin filament dynamics and length control. Using GFP-tagged proteins it has been shown that the turnover of actin in stereocilia follows a treadmill model where monomers are continuously added to the filament's barbed end, driven rearwards and removed from its pointed end while the filament maintains constant length in a dynamic steady state. Intriguingly, the turnover rates for both actin and the actin cross-linking protein espin are scaled to the length of the stereocilia, suggesting precise regulation of the actin treadmill. Several new proteins essential for stereocilia function and elongation have been recently identified. One of these proteins, myosin XVa, is present at the tips of stereocilia near the site of actin filament elongation at concentrations also proportional to stereocilium length, suggesting a simple model of accumulation of a regulatory component at the tip or along the length of each stereocilium. The analysis of the structure and function of the polymerization locus of stereocilia, microvilli and filopodia points to the formation of a tip-complex structure as a critical regulatory step where the different components of the molecular hardware involved in regulation of actin polymerization interact. Future studies should aim to clarify how specific elements are sorted into actin protrusions of different lengths, how these components interact to form the tip complex at the barbed ends of actin filaments, and how the cell regulates the tip complex or other components of the actin treadmill in neighboring actin protrusions to precisely specify lengths of the hair bundle
Сайт создан в системе uCoz