Tamada, M., Sheetz, M. & Sawada, Y. Activation of a signaling cascade by cytoskeleton stretch. Dev. Cell7, 709-718 (2004) | | |
FURTHER READING Lafuente, E. M. et al. RIAM, an Ena/VASP and profilin ligand, interacts with Rap1?GTP and mediates Rap1-induced adhesion. Dev. Cell7, 585?595 (2004) | | |
If you tread on someone's toe, the response is usually quite vocal. But, beyond the yelps, what might be happening when force is applied at the cellular level? Tamada, Sheetz and Sawada investigated how forces on the extracellular matrix (ECM) are transduced into intracellular biochemical signals, using cells that have been stripped of their cell membrane and soluble proteins. Stretching the resultant 'Triton cytoskeletons' initiated signalling to the small GTPase , as outlined in Developmental Cell.
Если клетки экстрагируются с помощью Triton X-100, то оставшийся комплекс содержит в основном цитоскелетные и адгезивные белки и только небольшие количества мембранных липидов или цитоплазматических белков. Несмотря на это авт. установили, что если этот Triton цитоскелет растянуть, то это м. активировать Rap1, который присутствует в добавляемых цитоплазматических экстрактах. Такая обусловленная натяжением активация Rap1 происходит и в интактных клетках.
Изучение потенциальных выше стоящих кандидатов показало, что два компонента в добавляемом растворимом цитоплазматическом экстракте, Rap1 guanine nucleotide-exchange фактор и адапторный белок - которые участвуют в активации Rap1 - соединяются с Triton цитоскелетом stretch-зависимым способом. Активации Rap1 не происходит, если C3G удален из экстрактов, итак, реакция Rap1 на натяжение Triton-цитоскелета зависит от C3G.
В ответ на разнообразные стимулы CrkII-C3G соединяется с фосфорилированными по тирозину белками посредством Src-homology-2 () домена в CrkII. И соотв. Tamada, Sheetz and Sawada отметили увеличение уровня фосфотирозина в некоторых белковых компонентах Triton цитоскелета в ответ на натяжение. Первым подозреваемым на это фосфорилирование была Src-family kinases (SFKs), a избирательный ингибитор SFK предупреждает это индуцируемое натяжением фосфорилирование и способность флюоресцентно меченного CrkII соединяться с растянутым Triton цитоскелетом. Кандидатом на роль субстрата для такого фосфорилирования явился (Crk-associated substrate), значительные количества которого сохраняются в Triton цитоскелете. Предположения авт. подтвердились - фосфорилирование тирозинов в Cas в Triton цитоскелете увеличивалось в ответ на натяжение. А CrkII не обнаруживал связи с Triton цитоскелетом Cas-/- клеток, это указывает на то, что CrkII соединяется непосредственно с фосфорилированным по тирозину Cas.
Самые значительные стрессы обнаруживаются, как и ожидалось, в областях контакта клеток с внеклеточным матриксом. В этих местах Tamada, Sheetz and Sawada наблюдали увеличение фосфорилирования тирозина в Triton цитосклете в ответ на прилагаемые извне силы - цитозольные молекулы для этого оказались не нужными. Сходное локальное увеличение фосфорилирования по тирозину наблюдалось в интактных клетках, если их растягивали. И было видно как флюоресцентно меченный CrkII перемещается в места адгезии и ко-локализуется с Cas в ответ на натяжение в интактных клетках.
Итак, натяжение Triton цитоскелета и интактных клеток индуцирует передачу сигналов CrkII-C3G-Rap1. Как начинается передача сигнала неясно, возможно, что белки расправляются или искажаются, когда прилагается сила, это должно создавать новые места для связывания др. белков. Т.к. Rap1, как известно, индуцирует интегрином-обеспечиваемые адгезии, то его активация в месте клетка-ВКM д. прекрасно стабилизировать такие контакты. Указание на активацию интегринов с помощью Rap1 получены Lafuente et al., которые клонировали и охарактеризовали , Rap1-GTP-взаимодействующую адапторную молекулу. Будучи избыточно экспрессированной RIAM индуцирует β1- и β2-integrin-обеспечиваемую адгезию и влияет на динамику актина.
