Посещений:
Фокальные Адгезии

Talin

Talin: an emerging focal point of adhesion dynamics
Anjana Nayal , Donna J Webb and Alan F Horwitz (horwitz@virginia.edu)
Current Opinion in Cell Biology
Volume 16, Issue 1 , February 2004, Pages 94-98

The adhesion protein talin and the phosphoinositide PIP2 are emerging as key modulators of adhesion dynamics. Recent genetic studies on talin demonstrate its physiological role in organizing adhesions, stabilizing integrin–actin linkages and mediating integrin signaling in vivo. Biophysical force measurements provide further evidence that it is required for the reinforcement of the extracellular matrix–integrin–actin connection. Knockdown data along with structural analyses establish a major role for talin in ‘inside-out’ integrin activation through its direct interaction with integrin cytoplasmic domains. A recently uncovered role for talin is the recruitment of a PIPKIγ isoform to adhesions. This introduces a novel connection between talin and PIP2 generation. Finally, PIP2 also stimulates the transient, direct binding interaction of the Arp2/3 complex with vinculin and thus may couple adhesion to actin assembly.


Рис.1.  |  Talin forges the links between integrins and actin

См. также Opening-up of liposome membranes by talin
Talin является важным компонентом фокальных адгезий, который соединяется с многочисленными адгезивными молекулами, включая интегрины [1-3], vinculin [4-6], focal adhesion kinase (FAK) [7] и actin [3]. Он физически накладывает интегриновые рецепторы на внутриклеточный актиновый цитоскелет или непосредственно через одновременное связывание цитоплазматических доменов интегринов [2,8,9] и актина [3,10], или опосредованно через сцепление с актином. Помимо своей структурной роли талин, по-видимому, играет также ключевую функциональную роль в регуляции активации интегринов [8,9,11-17]. Соединение talin посредством его головного домена с цитоплазматическими хвостами интегринов продуцирует состояние высокого сродства - феномен, известный как 'inside-out' активация интегрина [9,12,14,17]. Talin, вместе с vinculin и α-actinin, также структурно и функционально регулируется с помощью взаимодействий с мембранным фосфолипидом PIP2, ключевым регуляторным липидом [6,18-23].
Будут проанализированы связи между talin, PIP2 и динамикой адгезии. В частности, измерения генетических [24-26] и непосредственных сил [27] показывают, что talin необходим для формирования сильных адгезий. Недавние генетические [24-26] и структурные данные [8,11,12] помогли начать выяснять механизм inside-out передачи сигналов интегринов и продемонстрировали центральную и критическую роль талина как конечной точки множественных сигнальных путей, ведущих к активации интегрина. Наконец, talin рекрутирует синтезирующий PIP2 энзим PIPKIγ661 в фокальные адгезии [28,29]. Вновь описанное PIP2-облегчаемое взаимодействие между actin-related protein 2/3 (Arp2/3) комплексом и vinculin [30] в адгезиях подчеркивает связь между адгезией и полимеризацией актина.

Talin is a critical adhesion component


Talin является крупным белком (~235 kDa), который существует как гомодимер [10] и физически накладывает (juxtaposes) интегриновые рецепторы на актиновый цитоскелет [31.]. Он м.б. расщеплён calpain II [13,32] на глобулярный головной (head) домен (~47 kDa) и удлинёный палочковидный домен (~190 kDa). Домен головки талина богат основными аминокислотами [33], которые м. взаимодействовать с негативно заряженными группами головок phosphoinositides, таких как PIP2. Этот домен соединяется также непосредственно с интегриновыми αIIb, β1 и β3 цитоплазматическими хвостами [2,9,14], PIP2 [23,34], FAK [7] и layilin [35], а палочковидный домен связывает vinculin [4,5,36] и actin [3], создавая тем самым связь между интегринами и актиновым цитоскелетом.
Генетические исследования с использованием стратегий knockdown и knockout у Drosophila [25], C. elegans [24] и мышей [26] указывают на талин как главного участника в развитии и формировании клеточных адгезий. У Drosophila [25], talin-нулевые клетки обнаруживают изменение функции мышц и ретракции зародышевого диска. Хотя интегрин обнаруживается в большинстве соединительных областей, он недостаточно хорошо организован в имагинальном эпителии и мышечно-сухожильных соединениях. Фенотип потери функции талина, генерируемы с помощью RNAi у C. elegans [24] обнаруживает изменённый морфогенез гонад. Это обусловлено частично неправильной миграцией клеток дистального кончика гонад, изменённой организацией актина в клетках оболочки гонад и нарушениями созревания ооцитов, а также ингибированием мышечной функции, вызываемой с помощью дизорганизованного контрактильного аппарата. И у Drosophila и у C. elegans, фенотипы потери талина сходны с таковыми у нокаутов по integrin [24,25]. У мышей [26], целенаправленное разрушение гена talin ведет к аресту эмбриогенеза в результате неправильной миграции клеток на стадии гаструляции. Всё это чётко указывает на то, что talin является существенным для стабильного сцепления организованных интегринов с актиновым цитоскелетом, для организации актина и контратильного аппарата и для передачи сигналов integrin во время созревания клеток.
Роль talin как критической связки с актином подтверждена недавними биофизическими исследованиями с использованием лазерной tweezer микроскопии [27]. В этом подходе, кусочки, покрытые клетки-связывающими фрагментами фибронектина, помещали на ламеллиподии подвижных клеток. Прикрепленные кусочки, которые, как полагают, представляют минимальные или становящиеся, интегрин-цитоплазматические комплексы, движутся в тыл по ламеллиподии. Сила, необходимая для отсоединения кусочка от подвижного аппарата, создаёт, как подсчитано, силу сцепления с цитоскелетом в 2 pN в нормальных фибробластах [27]. Сходные эксперименты, проведенные на talin-нулевых фибробластах, показали, что такие силы являются минимальными в таких клетках, но они восстанавливаются при повторной экспрессии talin. Более того, избыточная экспрессия талина мутантами, которые лишены актин-связывающих сайтов, воспроизводят talin-нулевые клетки [27]. Эти наблюдения непосредственно указывают на участие талина с формировании адгезий и их усиление.

Talin and integrin activation


Взаимодействия integrin-talin являются критическими не только для сильных цитоскелетных соединений; но также обеспечивают активацию интегрина. Ранее было показано, что N-терминальный head домен талина м. активировать интегрины путём связывания непосредственно цитоплазматических доменов интегрина β1 или β3 [9,13,14,16]. На RNAi-базирующийся нокдаун talin [17] показал, что talin является основным integrin-proximal эффектором inside-out активации интегрина. Снижение экспрессии талина в knockdown клетках, которые стабильно экспрессируют αIIbβ3, непосредственно коррелирует со снижением активации интегрина без нарушения уровня экспрессии интегрина [17] или образования кластеров интегрина [17,23]. Это подтверждает мнение, что талин влияет на активацию интегрина путём непосредственных эффектов на сродство интегрина, возможно индуцируя трансмембранные конформационные модификации, которые и приводят к активации интегрина [11,23].
У тромбоцитов и их предшественников мегакариоцитов несколько разных сигнальных путей конвергируют на активации интегрина [37,38]. Talin knockdown в таких клетках ведёт к снижению активации интегрина независимо от используемого пути. Однако, потеря талина не м.б. восстановлена с помощью др. интегриновых регуляторов, таких как R-Ras или CD98 тяжелая цепь, а только с помощью экспрессии активирующего интегрин фрагмента талина [17]. Это подчёркивает первичную роль талина в 'inside-out' активации интегринов.
Рентгеновский и NMR анализы [11,12,39] показали структурные основы для активации интегрина и его взаимодействия с талином. Принципиальные интегрин-связывающий домен талина напоминает phosphotyrosine binding (PTB) домен [14]. Мутации в этом домене устраняют активацию интегрина, а также связывание talin-integrin [9,14], тогда как избыточная экспрессия этого домена увеличивает активацию αIIbβ3 [14]. Недавние структурные исследования β хвостов интегрина показали, что талин активирует интегрины с помощью индукции конформационных изменений, которые распространяются через мембрану, делая возможной активацию 'inside out' рецепторов. NMR данные [11] показали, что цитоплазматические хвосты integrin α и β используются слабо в конформации низкого сродства интегрина. Соединение head домена талина ведет к активации интегрина за счёт конкуренции с αIIb хвостом за β3 цитоплазматический хвост, тем самым нарушается αβ взаимодействие. Это наблюдение подтверждено кристаллографическими исследованиями [12], показавшими, что талин первоначально соединяется с β хвостом в сайте связывания высокого сродства в области дистальнее мембраны покоящегося интегрина. Это сопровождается связыванием со вторым низкого сродства сайтом проксимальнее мембраны, участвующим в αβ ассоциации, которая запускает разделение интегриновых хвостов. Недавние NMR данные [8] также подтверждают, что талином обусловленная активация интегрина является прямым следствием структурных пертурбаций в области проксимальнее мембраны β3 хвоста. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) исследование [40], где интегриновые αL и β2 цитоплазматические хвосты были мечены cyan fluorescent protein (CFP) и yellow fluorescent protein (YFP), соотв., предоставило дальнейшее доказательство пространственной близости этих доменов в покоящемся состоянии. Однако, эффективность FRET между αL-CFP и β2-YFP снижалась существенно после активации одним из нескольких стимулов, включая экспрессию head домена талина [40]. Следовательно, связывание talin head домена ведет к пространственному разделению двух цитоплазматических доменов интегрина и тем самым к активации интегрина.
Мутации в субъединице integrin β3, которые нарушают связывание с талином, ведут к снижению активации интегрина [9,14,17].Напротив, мутации в домене PTB талина, которые снижают связывание с β3 integrin, супрессируют активацию интегрина, тогда как мутации, которые не влияют на связывание β3 интегринового хвоста, стимулируют активацию интегрина [17].Т.о., всё подчёркивает прямое связывание талина с β хвостом интегрина необходимо для активации. Интегрин-связывающая активность талина в свою очередь усиливается с помощью его взаимодействия с мембранным фосфолипидом PIP2 [23]. PIP2 соединение с head доменом талина индуцирует конформационные изменения талина, увеличивая его сродство в отношении цитоплазматического хвоста интегрина. Это взаимодействие в дополнение к др. взаимодействиям с адгезивным белком, испытывающим влияние со стороны PIP2, м. таким образом облегчить сборку адгезий путём регуляции инициального связывания интегрина.

Talin, PIP2 synthesis and adhesion dynamics


Некоторые недавние наблюдения подчёркивают новую роль PIP2 в формировании адгезий. Адгезия, обеспечиваемая внеклеточными лигандами, такими как фибронектин, стимулирует синтез PIP2 [41]. Этот мембранный phosphoinositide временно ассоциирует с талином [23], почти параллельно с адгезией стимулируемым накоплением PIP2 [41]. Присутствие PIP2 способствует ассоциации talin-integrin за счёт усиления сродства талина к субъединице β1 интегрина [23].
PLCδ Pleckstrin homology (PH) домен соединяется с PIP2 с высоким сродством [42] и был использован для секвестрации PIP2 и выявления его эффектов на адгезию. После временной избыточной экспрессии PLCδ PH-GFP в NIH3T3 клетках адгезивные структуры первоначально оставались интактными и содержали vinculin и actin, но не талин [23]. После длительного периода экспрессии эти клетки теряли соединение с субстратом [23], это указывало на то, что талин необходим для стабильности адгезивных структур.
Синтез PIP2 происходит благодаря последовательному фосфорилированию PtdIns by PtdIns-4-киназой и PtdIns-4-P5-киназой [43]. Два недавних рецептора [28,29] обнаруживают потребность в изоформе PIPKIγ661 для адгезий с помощью действительного взаимодействия между с областью в 26-аминокислот на С-конце изоформ с FERM доменом талина. Этот механизм таргетинга PIPKIγ661 не только служит для локализации PIPKIγ661 в соотв. субклеточной локализации, но и также необходим для мембранного таргетинга талина, а также его поставки в адгезивные структуры. Их активность является также предметом регуляции с помощью FAK, раннего компонента интегринового сигнального каскада. FAK фосфорилирует PIPKIγ661, стимулируя тем самым его активность. даже средней выраженности избыточная экспрессия PIPKIγ661 индуцирует образование крупных адгезий, тогда как высокая избыточная экспрессия ведет к разрушению адгезий [28,29], возможно за счёт разрушения локальной продукции PIP2.
Интересно, что PIPKIγ и субъединица β1 интегрина соединяются с той же самой областью FERM домена талина [44]. Субдомен F3 head домена талина активирует интегрины [14], a PIPKIγ соединяется с F2F3 субдоменом, частично перекрывая сайт связывания интегрина. Это соединение является конкурентным, на это указывает ингибирование связывания интегрина β1 с помощью PIPKIγ пептида. Благодаря этим результатам м. сделать предварительное заключение о возможности образования четвертичного комплекса с талином, PIPKIγ и β1 integrin, возможно, что интегрины и PIPKIγ соединяются с димером талина [34] одновременно, но анти-параллельны образом.

PIP2 and adhesion-protrusion coupling


Хотя образование адгезий и выпячиваний интимно связано во время миграции клеток, механистическая связь между этими двумя процессами неясна. Недавно выяснилась потенциальная роль PIP2 в непосредственной связи выпячиваний мембран с клеточной адгезией [30]. PIP2, как известно, конформационно активирует vinculin [45], который связывает др. компоненты FA, подобные VASP (vasodilator activator stimulated phosphoprotein), talin, α-actinin и F-actin [4,6,21]. Он также косвенно активирует Arp2/3 комплекс, который состоит из 7 белковых субъединиц [46,47]. Активация комплекса Arp2/3 в ламеллиподиях [48] ведет к ветвлению актиновых филамент и образованию выпячиваний [49,50].
PIP2 стимулирует временное, непосредственное связующее взаимодействие комплекса Arp2/3 с vinculin, которое в дальнейшем усиливается в присутствии GST-VCA домена - активатора Arp2/3 [30]. Комплекс Arp2/3 соединяется непосредственно с шарнирной областью vinculin, а мутация одиночной аминокислоты в этой области устраняет это связывание [30]. Это Arp2/3-vinculin взаимодействие зависит от активированных Rac1 и PI3K - экспрессия доминантно-негативного Rac или воздействие ингибиторов PI3K устраняют это связывание. Как прямое следствие этого рекрутирования, Arp2/3 и vinculin локализуются в ранних фокальных комплексах ведущего края [30], указывая, что их взаимодействие ограничено ранними сайтами слипания клеток с матриксом.
В экспериментах по восстановлению vinculin-нулевых mouse embryo fibroblasts (MEFs), которые трансфицированы мутантным винкулином, который не м. соединяться с Arp2/3, выпячивания ламеллиподий, также как и распространение фибронектина существенно редуцированы. В этих клетках рекрутирование Arp2/3 во вновь формируемые сайты агрегации интегрина снижено по сравнению с таковым в контроле vinculin-нулевых MEFs, возобновивших экспрессию винкулина дикого типа [30]. Это указывает на то, что винкулин м. примой комплекса Arp2/3 в формирующихся сайтах адгезии на ведущем крае клетки. Т.о., взаимодействие Arp2/3-vinculin предоставляет прямое доказательство для adhesion-actin связи в новых сайтах адгезии клеток с матриксом и находится под влиянием мембранного фосфолипида PIP2.

Conclusions


The adhesion protein talin and the membrane phosphoinositide PIP2 assume a significant role in the regulation of adhesion dynamics (см. Рис. 1). Talin knockouts and knockdowns in cells and organisms all demonstrate its indispensability for proper tissue development through its role in organizing and stabilizing adhesions, organizing the actin cytoskeleton and integrin signaling. Recent biophysical analysis shows that talin is required in the mechanical reinforcement of the extracellular-matrix–integrin–actin connection. Its role in recruiting a PIPKIγ isoform to adhesions reveals the possibility of spatio-temporal regulation of PIP2 levels at the leading edge and in adhesions. This regulation could play a key role in the assembly and maturation of adhesions. Finally, PIP2 not only regulates adhesion components by altering the conformation of molecules like talin, vinculin and α-actinin, but may also couple adhesion with actin polymerization in protrusions. When taken together, the talin-mediated regulation of integrin signaling, adhesion and cytoskeletal organization, as well as the important, emerging connections between PIP2, talin and actin assembly, present important, productive new avenues in adhesion research.



Figure 1. Role of talin and PIP2 in adhesion and actin dynamics. Talin recruits the PIP2-synthesizing enzyme PIPKIγ to adhesions. PIP2, in turn, conformationally modulates talin, vinculin and α-actinin, allowing them to interact with other adhesion components. FAK, an important component of the integrin signaling pathway, stimulates PIPKIγ activity. Talin also activates integrins and therefore directly regulates integrin signals. In addition to its effects on vinculin, PIP2 indirectly activates Arp2/3 by activating WASP in conjunction with Cdc42. It also stimulates a direct transient interaction between vinculin and the Arp2/3 complex, thus connecting adhesions and actin polymerization.

Сайт создан в системе uCoz