Telomerase: what are the Est proteins doing? Current Opinion in Cell Biology 2003, 15:275–280, 2003 | |
|
Saccharomyces cerevisiae has proven to be a useful model
organism for the study of telomerase, a specialized cellular
reverse transcriptase that helps maintain genomic stability by
adding telomeric DNA repeats to the ends of chromosomes.
Yeast telomerase is thought to be a holoenzyme containing
Est2p and TLC1 RNA, the catalytic subunit and its intrinsic
template, respectively, as well as the TLC1-RNA-associated
factors Est1p and Est3p. Cdc13p, a sequence-specific
telomere-DNA-binding protein, is also required for action in vivo.
A current model for telomerase regulation is that telomereassociated
Cdc13p binds Est1p, thereby recruiting telomerase.
However, recent chromatin immunoprecipitation experiments
suggest an alternate role for Est1p in activating Est2p–TLC1-
RNA that is already bound to the telomere. Three models for
Est1p activation are presented.
См. также: Теломераза The human CST complex is a terminator of telomerase activity
Длина теломер человека, которые защищают концы хромосом от деградации и слияния концов1, 2, является критическим детерминантом продожительности жизни клетки3. Во время эмбриогенеза и при раке энзим telomerase противодействует укорочению теломерной ДНК. Как показано на раковых клетках, telomerase человека связывает shelterin компонент TPP1 на теломерах4, 5 во время S фазы клеточного цикла и добавляет ~60 нуклеотидов за один раунд удлинения6, после чего telomerase выключается за счет неизвестного мехнизма. Здесь мы показали, что CST (CTC1, STN1 and TEN1) комплекс человека, который, как было установлено, ранее участвует в защите теломер и метаболизме ДНК7-11, ингибирует активность telomerase за счет секвестрации праймераи, физического взаимодействия с protection of telomeres 1 (POT1)–TPP1 telomerase processivity фактором12, 13. CST конкурирует с POT1–TPP1 за теломерную ДНК, а соединение CST–теломерная ДНК увеличивается в ходе поздней S/G2 фазы только в отношении действия telomerase, это совпадает с выключением telomerase. Истощение CST делает возможной избыточную активность telomerase, способствуя удлинению теломер. Мы предполагаем, что посредством связывания telomerase-extended telomere, CST ограничивает действие теломеразы приблизительно одним событием связываниея и удлинения на клеточный цикл. Наши находки определяют последовательность событий, которые происходят, чтобы сначала сделать возможной, а затем прекратить зависимое от теломеразы удлинение теломер.
Nature 488 (7412), 540–544 (23 August 2012) doi:10.1038/nature11269 |
Концы линейных молекул ДНК являются камнем преткновения для репликации ДНК. Традиционные ДНК полимеразы нуждаются в праймере для начала синтеза, обычно в участке РНК в 8-12 пар оснований и м. синтезировать ДНК толь ко в 5'→3' направлении. Следовательно, если репликация обеспечивается только традиционной ДНК полимеразой, то д. появляться пробел в 8-12-оснований на 5' концах вновь реплицировавшихся нитей. Теломеры являются белок-ДНК структурами на физических концах хромосом эукариот. Их специальная структура и способ репликации даёт решение проблемы концевой репликации.
Telomere replication У огромного большинства эукариот теломерная ДНК состоитиз простой повторяющейся ДНК. Напр., теломеры у реснитчатой Tetrahymena несут ~300 bp of C4A2/T2G4 ДНК, тогда как все позвоночные имеют повторы C3TA2/T2AG3 на своих хромосомных концах. Значительно реже последовательности теломерной ДНК оказываются гетерогенными. Напр., теломеры печных дрожжей состоят из ~300 bp C1-3A/TG1-3 ДНК. Обычно нить, идущая от 5' к 3' из внутренней части к концу хромосомы богата G-остатками и продолжается, чтобы сформировать короткий однонитчатый хвост. У дрожжей однонитчатые TG1-3 хвосты из ~50-100 оснований обнаруживаются временно в очень поздней S phase [1-3]. Более короткие G хвосты, по-видимому, присутствуют в др. время клеточного цикла, их появление вытекает логично из теломерной ассоциации с клеточным циклом однонитчатой TG1-3 ДНК-связывающей Cdc13p [4].
Ранний анализ структуры теломер показал, что механизм репликации теломер необычен. У большинства организмов количество теломерной ДНК на теломеры варьирует от теломеры к теломере. Эта гетерогенность длин объясняет, почему терминальные рестрикционные фрагменты с концов хромосом формируют скорее диффузные, чем дискретные диски при Southern гибридизации. Более того, теломеры у некотоых организмов, таких как Trypanosoma [5], постепенно увеличиваются в длину во время митотического роста. У реснитчатых после спаривания транскрипционно активное полиплоидное макроядро формируется из диплоидного микроядра. Этот процесс протекает с экстенсивной хромосомной фрагментацией и делециями in Tetrahymena, возникающая в результате макроядерная молекула ДНК несёт ~300 bp bp C4A2/T2G4 LYR на каждом конце. Однако микроядерные последовательности, которые предназначен, чтобы стать концами макроядерных хромосом несут в большинстве своём одну копию теломерного C4A2 повтора, указывая тем самым, что макроядерные теломеры не кодируются микроядерной ДНК [6]. Наконец, когда теломеры ресничатых привязаны к обоим концам плазмидной ДНК и внесены в печные дрожжи с помощью трансформации, то плазмиды поддерживаются в линейной форме, указывая тем самым, что функциональные теломеры присутствуют на каждом из концов. Однако теломерная ДНК ciliate всегда модифицируется с помощью добавления дрожжевых теломерных повторов C1-3A/TG1-3 [7,8]. Всё это указывает на то, что теломерная ДНК не является собственной матрицей (self-templating).
Идея, что теломерная ДНК не реплицируется отдельно с помощью стандартной полу-консервативной репликации ДНК выдвинута Greider and Blackburn в результате поиска активности, которая м.. добавлять теломерную ДНК к олигонуклеотидному праймеру в отсутствие матричной ДНК [9]. Они обрабатывали экстракты от Tetrahymena во время развития макроядра, т.к. в это время происходит образование массивных теломер. Используя удлинение праймера, они идентифицировали активность, которая добавляла до 30 T2G4 повторов к T2G4 олигонуклеотиду. Согласно этим данным при формировании теломер у дрожжей активность Tetrahymena м. использовать праймеры, содержащие последовательности иные, чем теломерная ДНК, но эти праймеры всегда удлиняются путём добавления T2G4 повторов. Позднее было установлено, что telomerase является рибонуклеопротеиновым комплексом, чьи белковый и РНК компоненты существенны для активности [10]. В 159-оснований теломеразная РНК Tetrahymena лишена открытой рамки считывания, но содержит последовательность CA2C4A2 [11]. Если последовательность этого сегмента изменена и мутантная теломеразная РНК вносится в клетки, что измененные последовательности включаются в теломерную ДНК, демонстрируя прямо, что теломеразная РНК служит матрицей для элонгации G-rich нити [12]. После того как G нить удлинена с помощью теломеразы, РНК-primed репликация с помощью традиционной ДНК полимеразы м. дополнить С нить. Genetic factors and telomerase activity Вскоре после этого открытия у Tetrahymena, теломеразная активность была выявлена и у др. ресничатых простейших [13,14], а также в клетках HeLa [15]. Однако, несмотря на усилия многих лаб. не удавалось выделить теломеразу из экстрактов целых клеток из Saccharomyces cerevisiae. Генетические подходы оказались более успешными, Были идентифицированы 5 генов у дрожжей, которые необходимы для поддержания теломерной ДНК, все они сегодня известны как критические для действия теломеразы in vivo [16-18]. Это гены EST1, EST2, EST3, CDC13 и TLC1.
Нехватки любого из этих 5 генов или всех пяти Saccharomyces EST
генов ведут к одному и тому же фенотипу. Линия дрожжей первоначально жизнеспособна, но её теломеры медленно и постоянно укорачиваются. После ~50-100 генераций теломеры становятся критически короткими, потери хромосом увеличиваются и большинство клеток погибает [17,19]. EST2 кодирует каталитическую субъединицу теломеразы [20], а TLC1 кодирует матричную РНК теломеразы [18]. CDC13, существенный ген, кодирует белок, который присоединяется к одиночной нити TG1-3 ДНК in vitro [21,22] и к теломерам in vivo [23,24]. In vivo ассоциация нуждается в Cdc13p ДНК-связывающем домене [4]. Cdc13p играет двойную роль в теломерах, как это установлено с помощью выделения аллелей с очень разными фенотипами. Клетки, несущие температуро-чувствительный cdc13-1 аллель, погибают при рестриктивных температурах в результате безудержной потери С-нити [25]. Т.о., Cdc13p является существенным для защиты хромосомных концов от деградации. Напротив, cdc13-2 жизнеспособны, но обладают классическим est фенотипом (т.е. прогрессивным укорочением теломер) [22], несмотря на тот факт, что Cdc13-2p всё ещё связывает теломеры in vivo [4].
Функции EST1 и EST3 изучены плохо. Est1p соединяется и с TLC1 РНК и с 3' концами однонитчатой TG1-3 ДНК, хотя последнее взаимодействие довольно слабое [26-29]. Est2p и Est1p соединяются независимо с отдельными областями TLC1 РНК, последняя соединяется с законсервированной stem-петлёй, локализованной примерно посредине РНК [27,30]. Мутации, которые дестабилизируют эту петлю, устраняют связывание Est1p и имеют est фенотип. Сходным образом telomerase-нулевые мутации в Est1p устраняют связывание TLC1, хотя эти данные оспариваются [28,31]. Est3p, подобно Est1p, является
TLC1-ассоциированной in vivo; однако, эта ассоциация Est2p-зависима и поэтому м. продолжаться косвенно посредством взаимодействия с РНК-связанной Est2p [32]. Активность теломеразы м. также ко-иммунопреципитироваться с Est1p и Est3p, указывая тем самым на существование голоэнзима telomerase, содержащего Est1p, Est2p, Est3p и TLC1 РНК [32]. Однако неизвестно, какова пропорция каждого из Est белков в holoenzyme и присутствует ли голоэнзим во всё время клеточного цикла.
Прямое соединение Cdc13p и Est1p, по-видимому, необходимо для действия теломеразы in vivo. Два белка взаимодействуют в two-hybrid и GST pull-down методических подходах [33]. Избыточная экспрессия Est1 частично нормализует чувствительность к температуре cdc13-1 аллеля и telomerase-нулевой фенотип аллеля cdc13-2 [22,33]. Генетический анализ идентифицировал ~15 kDa порцию Cdc13p, заканчивающуюся 'recruitment domain', который необходим и достаточен для обеспечения telomerase-promoting функции Cdc13p [34]. Точковая мутация cdc13-2, картированная в этом домене, и скорее всего нарушающая ионные связи между остатком glutamate на дикого типа Cdc13p и остатком lysine на Est1p. Хотя и ясно, что эти ионные связи необходимы для действия теломеразы, но неясно достаточны ли они для обеспечения связи между белками. В самом деле, Cdc13-2p взаимодействует нормально с Est1p в
two-hybrid и GST pull-down анализе [33].
Два независимых методических подхода, один, измеряющий теломераза-зависимое заживление двунитчатых разрывов, и др., теломеразой-обеспечиваемое удлинение сильно укороченных теломер, были использованы для измерения действия теломеразы in vivo. Хотя ни один метод не выявил действия теломеразы в клетках, арестованных в G1 фазе, её действие наблюдалось или поздней S фазе или G2/M арестованных клеток [35,36]. Однако такая же активность теломеразы наблюдалась и in vitro в экстрактах клеток, арестованных или G1 или в G2/M фазе, подтверждая, что доступ теломеразы к концам хромосом, а не активность самого энзима, регулируется в зависимости от клеточного цикла [35]. Transient recruitment model for telomerase
regulation Всё это подтверждает модель регуляции теломеразы с помощью клеточного цикла, которая названа 'Transient recruitment model'. В поздней S фазе относительно длинные G хвосты, которые образуются временно на теломерах, как полагают, соединяются с одной или несколькими молекулами Cdc13p [2,37]. Межбелковое взаимодействие Cdc13p
и Est1p субъединицы предполагаемого голоэнзима теломеразы, состоящего минимум из Est1, Est2, Est3 и TLC1 РНК, д. рекрутировать теломеразную активность на 3' конец теломеры [34]. Согласно этой модели telomerase-нулевой фенотип cdc13-2 аллеля м.б. интерпретирован как неспособность связывания Est1p, а значит и неспособность рекрутировать Est2p-TLC1 каталитический стержень на теломеру. Изучение слияний между полной длины Cdc13p его ДНК-связывающим доменом и EST белками строго подтверждает модель временного рекрутирования. Слияния между Cdc13p и Est1p, Est2p или Est3p обеспечивают фенотип гипер-удлинённой теломеры [32,38]. Слияние между Cdc13p и Est2p позволяет обойти потребность в свободных Cdc13p, Est2p и Est1p. А также слияние Cdc13-2p непосредственно с Est1p нормализует telomerase-нулевой фенотип [38]. Эти наблюдения согласуются с ролью Est1p как необходимой промежуточной структуры между Cdc13p и Est2p в рекрутировании теломеразы в клетках дикого типа. Во-вторых, несущественная роль Est1p в дополнение к её предполагаемой роли в рекрутировании, подтверждается тем фактом, что теломеры не гипер-удлиннены при Cdc13p-Est2p слиянии в отсутствие свободного Est1p [31,38].
Модел временного рекрутирования позволят сделать несколько предсказаний. Во-первых, ни Est1p, ни Est2p не д. соединяться с теломерой в G1 фазе, т.к. ни G хвостов, ни действия теломеразы не выявляется in vivo в это время. Во-вторых, Est1p и Est2p (а также Est3p), как члены предполагаемого holoenzyme, д. поставляться на теломеру вместе в поздней S фазе, т.е. во время действия теломеразы. В-третьих, ни Est1p, ни Est2p не д. соединяться с теломерами cdc13-2 клеток, т.к. у этих мутантов предположительно элиминировано Est1p-обеспечиваемое рекрутирование holoenzyme.
Разработка м-да sensitive chromatin иммунопреципитации для теломер дрожжей сделала возможным тест этих предсказаний [24].В соответствии с моделью transient recruitment, Cdc13p соединение с теломерами увеличивается более чем в 10 раз в поздней S фазе, a соединение Est1p ограничено поздней S фазой [4]. Однако паттерн
Est2p ассоциации сложен. Неожиданно оказалось, что Est2p соединяется с теломерами в mid-G1 фазе, в то время, когда теломераза не действует
in vivo. Связывание остаётся высоким в течение всей S фазы. Однако в средине S фазу Est2p сигнал временно снижается почти наполовину от своего уровня во время G1/early S фазы. Это временное снижение м. отражать диссоциацию от субнабора теломер или изменение в состоянии Est2p, которое уменьшает эффективность его поперечных связей. Это временное снижение сопровождается возвращением Est2p к его уровням во время G1/early S фазы. Этот второй пик приходится на позднюю S фазу, конкурентную с действием теломеразы [4]. В течение всего клеточного цикла, Est2p связывание является зависимым от TLC1-РНК. Неожиданно, ни степень, ни паттерн клеточного цикла Est1p связывания не уменьшены в клетках cdc13-2. Скорее всего связывание теломерами Est2p в основном нормально в cdc13-2 клетках, за исключением того, что второй пик Est2p ассоциации потерян [4].
Тот факт, что и Est1p и Est2p являются ассоциированными с теломерами в cdc13-2 клетках, трудно примирить с моделью transient recruitment. Скорее всего эти данные указывают на более активную роль Est1p в регуляции теломеразы. Слияние Cdc13p с Est3p не позволяет обходиться без рекрутирования свободного Est1p, это указывает на то, что Est1p м. играть роль иную, чем действие в качества простого моста между Cdc13p и telomerase holoenzyme [32]. Хотя относительные количества Cdc13p и Est2p не меняются во время клеточного цикла, количество Est1p регулируется в зависимости от клеточного цикла, с ~2-3-кратной индукцией на уровне транскрипции и белка в ранней S фазе [4]. Ассоциация с теломерами Est1p ограничена поздней S фазой, временем, когда действует теломераза. Est2p, по-видимому, загружается на теломеры в G1 фазе в неактивной форме и хотя субнабор м. диссоциировать в средине S фазы, возможно на длинных теломерах, которые не нуждаются в действии теломеразы, очевидно, что существенная пропорция теломераз остаётся. Мы полагаем, что в поздней S фазе Est1p соединяется с РНК субъединицей этой фракции теломер-связанного Est2p-TLC1 стержневого комплекса. Будучи связанным Est1p взаимодействует с одной или несколькими молекулами Cdc13p, расположенными на G хвосте, чтобы обеспечить активирующие изменения в состоянии связанного с теломерой Est2p-TLC1 стержневого комплекса, что проявляется в виде пика в поздней S фазе ассоциации с теломерами Est2p. В свете этой модели теломеразная недостаточность cdc13-2 аллеля объясняется неспособностью взаимодействия собственно с Est1p и обеспечения активации, в результате чего и персистирует неактивный стержень теломеразы на теломере и теряется пик в поздней S фазе. Models for Est1p activation Мы представляем себе три возможные модели природы активации Est1p. Первая модель базируется на наблюдении, что in vitro, теломераза дрожжей подвергается одному раунду синтеза и затем остаётся связанной со своим субстратом в задержанной, неактивной форме возможно за счёт спаривания оснований между TLC1 и G хвостом [39]. Эта инактивированная форма теломеразы м. присутствовать на теломерах в G1 фазе и м. играть защитную роль для теломер в это время. В поздней S фазе, Est1p соединяется с TLC1 РНК, а последующие взаимодействие с Cdc13p вызывает высвобождение из этого спаривания оснований и позволяет теломеразе 'reset' и обеспечивать синтез (Рис. 1a). Интригующая возможность, предполагаемая этой моделью, это то, что
Est1p действует как processivity фактор для теломеразы. Primer-extension анализ с использованием частично очищенных дрожжевых экстрактов или иммунопреципитатов Est1p, Est2p или Est3p выявляет слабую, non-processive активность теломеразы, которая продвигается по нуклеотидной матрице самое большое на 7 оснований [32,40,41]. однако неясно, присутствуют ли все Cdc13p, Est1p и Est3p В тестируемых фракциях. Напротив, когда клеточные экстракты тестировали без предварительного фракционирования, используя
 Models for Est1p-mediated telomerase activation. (a) Model 1: Est1p 'resets' telomerase. Both Cdc13p (blue circle) and Est2p-TLC1 RNA (green circle and red line, respectively) are bound to telomeric DNA (black lines) in G1 phase [4 ]. Cdc13p binds specifically to singlestranded G-rich repeats, so its presence at telomeres in G1 phase implies the existence of a short G tail at this time. Est2p is bound in an inactive form mediated by base-pairing between the TLC1 RNA template and the short G tail. In late S phase, long G tails form, Est1p (yellow circle) binds TLC1 RNA, and interacts with one or more Cdc13p molecules to disrupt base pairing and 'reset' telomerase for synthesis. (b) Model 2: Est1p promotes telomerase dimerization. In late S phase, Est1p escorts an Est2p-TLC1-RNA complex, or alternatively a second free TLC1 RNA (not shown) to telomeres. Subsequent interaction with Cdc13p mediates functional integration of the incoming complex with the resident Est2p-TLC1 RNA complex, allowing telomerase action. (c) Model 3: Est1p frees sequestered telomerase. In G1 phase, the Ku heterodimer (pale blue and purple circles) sequesters telomerase from the 30 end of the telomere via interaction with a stem-loop in TLC1 RNA. In late S phase, Est1p binds TLC1 RNA and cooperates with Cdc13p to release TLC1 from Ku, thereby allowing translocation of Est2p to the chromosome end. sensitive PCR-based подход, то выявлялась processive, Est1p-зависимая активность теломеразы, которая добавляла до ~145 оснований к теломерной ДНК к олигонуклеотидным праймерам [26]. Наблюдения in vivo предоставили дальнейшие доказательства того, что дрожжевая теломераза м.б. более processive, чем предполагалось, исходя из её поведения in vitro primer-extension assays. В экспериментах по изучению in vivo действия теломеразы сильно укороченные теломеры удлинялись ~20 bp в одной S фазе, это существенно большее удлинение. чем максимум 7 оснований in vitro [36]. Поразительно, что теломераза добавляет значительно более, чем 20 bp (возможно более 100 и более) в одиночной S фазе в cdc13-5 линии [42]. Вторая модель активации Est1p базируется на наблюдении, что теломераза дрожжей или, по крайней мере, теломеразная РНК действует как гомодимер [39]. Если гомодимеризация необходима для активности, то возможно, что неактивный мономерный стержневой комплекс Est2p-TLC1 м.б. соединен с теломерами в G1 фазе. По этому сценарию Est1p экскортирует второй комплекс Est2p-TLC1 или просто свободную TLC1,
на теломеры в поздней S фазе. Последующее взаимодействие с
Cdc13p д. позволять функциональную интеграцию и димеризацию приходящей теломеразы с резидентной копией (Рис. 1b).
Согласно третьей модели в G1 фазе Est2p ассоциирует не с very концом хромосомы, а с дуплексной теломерной ДНК таким образом, что он секвестрируется от 3' конца теломеры. Напр., telomere-ассоциированный Ku гетеродимер [43,44], как полагают, связывает 48-nt структуру stem-петли в TLC1 [45]. Интригующей возможностью является то, что связывание Est1p с TLC1 РНК и Cdc13p в поздней S фазе высвобождает TLC1 РНК от Ku, устраняя секвестрацию и позволяя транслоцироваться теломеразе на хромосомные концы (Рис. 1c). Эти модели не являются взаимоисключающими (напр., Est1p и Cdc13p м. также действовать как факторы processivity, возможно способствуя димеризации или высвобождению Est2p-TLC1 от Ku).
Как эти модели объясняют способность Cdc13p-Est2p слияния, чтобы обходить потребности в свободном Est1p? Слияние с Cdc13p м. создавать активированный аллель Est2p, который способен 'reset' на себе самом, обходя тем самым потребность в рекрутировании Est1p (model 1). Или слияние с Cdc13p м. увеличивать локальную теломерную концентрацию Est2p-TLC1 РНК в точках, в которых происходит димеризация в отсутствие Est1p (model 2). Наконец, слияние с Cdc13p м. предупреждать полностью секвестрирование с помощью Ku (model 3), обеспечивая тем самым постоянное присутствие Est2p-TLC1 РНК на 3' конце теломеры, и избегая рекрутирования Est1p.
Conclusions In summary, we have discussed recent findings that Est1p
acts as a cell-cycle-regulated telomerase activator, and
provided three models for activation. Many aspects of
these models can be tested using the chromatin immunoprecipitation
approach. A critical role for Est1p in
telomerase regulation is particularly intriguing given
recent evidence for Est1-like proteins that affect telomerase
in Schizosaccharomyces pombe (J Cooper, personal communication),
Candida albicans [46] and humans [47]. |