Характеристика Развития

Tetraploid Development in the Mouse G.S. Eakin, R.R.Behringer Dev.Dyn. V. 228, No 4, P. 751-766, 2003
Развитие тетраплоидных мышей обычно протекает только до середины беременности. Тетраплоид:диплоидные химеры широко используются для выявления внеэмбриональных дефектов. Толерантность тканей к полиплоидии, по-видимому, зависит от генетического фона. Недавно были найдены етественно возникшие тераплоиды у видов грызунов указываеющие на то, что на редких генетических фонах удвоения генеома млекопитающитх могут оказаться совместимы с развитием, жизнью и плодовитеостью. См. также PRODUCTION OF COMPLETELY ES CELL-DERIVED FETUSES BY AGGREGATION WITH TETRAPLOID EMBRYOS Generation of Mice by Cloning ES Cells:ES Cell-Tetraploid Embryo Aggregation Тетраплоидные лягушки Тетраплоидные лягушки	В результате слияний клеток или ошибок во время клеточного деления клетки, а иногда и целые организмы становятся полиплоидными. Некоторые ткани (напр., склетные мышцы, гепатоциты, мегакариоциты, эпителий мочевого пузыря, миокард, синцитиотрофобласт и corpora lutea) часто полиплоидны в результате эндодупликаций генома или слияния клеток во время нормального развития (Keighren ana West, 1993). Др. клетки, такие как трофобластные гигантские клетки, рассматриваются как политенные, имеющие значительные количества хроматид на хромосому скорее, чем полиплоидные, имеющие большие количества сегрегирующих хромосом. Имея множественные копии генома клетки получают определенные преимущества, такие как устойчивость к повреждениям генома. Кроме того увеличиваются размеры клеток в результате полиплоидии или политении, что предоставляет им большую гибкость и силу в ткани, подверженной механическим стрессам, напр., эпителий мочевого пузыря (Brodsky and Uryvaeva, 1985). Большие размеры клеток позволяют также развивать ткани с меньшим их содержанием. Молекулярные механизмы, управляющие специфической для типа клеток резистентностью к полиплоидии остаются неизвестными. Часто отклонение от плоидности в 2n приводит к болезненым состояниям. Хотя тетраплодность у людей редка, последствия аномального количества хромосом и баланса генов нередки (Hassold and Hunt, 2001). Х0 кариотип ведет к синдрому Тёрнера, тогда как большинство др. моносомий даёт нежизнеспособные эмбрионы. Трисомии половых хромосом, с XXY (синдром Клянфельтера), XYY и ХХХ появляются с частотой примерно 1 на 1000 родов. Трисомии актосом обычно дают нежизнеспособные эмбрионы. Трисомии по хромосоме 8 и 9 вызывают летальные онтогенетические дефекты; трисомии 13, 18 и 21 (синдром Дауна) рождаются, хотя большинство не живёт и несколько мес. Это умственно отсталые, имеющие от слабых до тяжелых уродств (Larsen, 1993). Присутствие врожденных пороков сердца у индивидов с синдромом Дауна коррелирует с тремя полиморфизмами рестрикционных длин фрагментов в области COL6A1 на хромосоме 21 (Davies et al., 1995). Это указывает на то. что тяжесть синдрома, вызываемая анеуплидией м. б. модифицирована частично генетическим фоном. Хотя млекопитающие, по-видимому, особенно чувствительны к повреждающим эффектам полиплоидии, эволюция создала некоторые организмы с варьирующими значениями n. Xenopus laevis и Danio rerio считаются производными аллотетрапоидных предшественников. Аллотетрапоидные организмы являются следствием комбинации двух геномов близко родственных видов, которые содержат генетически отличающиеся наборы хромосом (Reiger et al., 1991). Слияние геномов, как полагают, играет роль в недавней эволюции только у одного млекопитающего. Красные viscacha крысы Tympanictromys barrerae обладают 100 аутосомными хромосомами и двумя половыми хромосомами, тогда как ближайший родственник обладает только 55 аутосомами и одиночным нобором половых хромосом (Contreras et al., 1990; Gallardo et al., 1999). Очевидное удвоение генома затрагивает не только половые хромосомы, но и удвоение 43 хромосомных пар, это м. указывать на то. что эти хромосомы м. нести локусы, которые несовместимы в полиплоидией in vivo. Полная тетраплоидность, как правило, несовместима с нормальным развитием и жизнеспособностью. Редкие примеры спонтанной тетраплоидии обычно связаны с нарушениями цитокинеза в первом делении зиготических клеток, это происходит у мышей с частотой примерно в 0.1%. Показатели спонтанной тетраплоидии у крыс, кроликов и свиней подсчитаны равнми 0.4%, 0.3%, 0.1-3.4%, соотв.,(ЬсАууднб 1969ж Внифт and Baraniv, 1987) тогда как показатель у эмбрионов коров, продуцируемых in vitro состасляет 2.8% (Kawarsky et al., 1996). Кариотипы спонтанных абортусов у лбюдей выявляют частоты спонтанной тетраплоидии между 1.1 и 7.1% (Carr, 1972; Creasy et al., 1976; Hassold et al., 1980; Kajii et al., 1980), при этом большинство приходится на низший ранг. Они обычно характеризуются пустым хориональным мешком без каких-либо эмбриональных тканей (Warburton et al., 1991). Аборты обычно происходят на 11 неделе менструального цикла, то считается, что смерть эмбрионов наступает значительно раньше (Carr, 1972). Однако несмотря на это известно 9 полностью тетраплоидных живорожденных, описанных в последние 30 лет. Такие дети обладали мириадом дефектов, включая spina bifida, скелетные и хрящевые аномалии, а также гипоплазию органов. Большинство имело лицевые дисморфологии (Warburton et al., 1991). Experimental Production of Tetraploidy in Mammals Nuclear Transfer into Zygotes ... Inhibition of Cleavage ... Blastomere Fusion ... Development of the Teraploid Mouse Embryo Gene Expression in Tetraploid Embryos Существует ограниченное количество доказательств по измерению генных продуктов в тетраплодидных клетках мелкоптающих. немногие наблюдаения подчеркивают, что тетраплоидность не дает в результате простое удвоение белка или уровня экспрессии РНК, этот феномен согласуется с исследованиями растений и др. видов (Epstein, 1986; Osborn et a., 2003). Уровни общей РНК и malate dehydrogenase в тетраплоидной моруле выше в 1.5 раз по сравнению с диплоидным контролем (Eglitis and Wiley, 1981). Линия клеток фибробластов, произошедшая из человеческого тетраплоидного абортуса экспрессирует пониженную ферменттативную активность peptidase 5 по сравнению с диплоидной контрольной линией (Schmutz and Lin, 1983). Имеются также доказательства, подтвержающие, что два генома скомбинированные во время слияния бластомеров, м. не экспрессировать своих генов на одном и том же уровне. Когда два бластомера, каждый из которых нёс уникальнsq glucose phosphate isomerase (GPI)аллель на отличающихся генетических фонах (129/Sv и C57Bl/6-JHan), былиэлектрослиты, то соотношение экспрессии GPI было неэквивалентным, это указывает на то, что два слитых генома обнаруживают разные реакции на тетраплоидность (Petzoldt, 1991). На ст. морулы различия в уровнях двух изозимов GPI составляли 45:5. На ст. экспансии бластоциста соотношение оказывалось 41:58. Объединённые данные всё же выявляют четкую неодинаковость вклада. Исследования дозы гена у тетраплоидных эмбрионов млекопитающих редки, комбинировнные данные указывают на то, что тетраплоидность не вызвает простого удвоения клетки и всего её содержимого. Как уже отмечалось, полиплоидия существенна для нормальной функции многих клеток в теле, но она вредна для функционирования др. Мало данных о механизмах, с помощью которых доза гена регулируется в полиплидных клетках млекопитающих, очевидно, что эти клетки д. обладать генетическим механизмом для устранения негативных последствий полиплоидии. Наиболее приемлемым объяснением возникновения полиплоидных видов (напр.. T.barrerae) и редких наблюдений полиплоидных млекопитающих на поздней ст. беременности является то, что внутри генного пула у каждого из этих организмов, из которых возник тетраплоид существует комбинация аллелей, которая действует в пользу резистентности к полиплоидии. Cellular Effects of Tetraploidy Тетраплоидия вызывает несколько задокументированных эффектов на индивидуальные клетки плода, включая размер клеток, длину клеточного цикла и, наконец, общее количество клеток у тетраплоидного эмбриона. Тетраплоидные эмбрионы скорее всего имеют замедленный клеточный цикл и как следствие меньше клеток. Однако оазмер всего тетраплоидного эмбриона остаётся грубо эксивалентным диплоидному эмбрионоу той же ста. развития. Описывается обратная пропорциаональность между плоидностью и количеством клеток, начиная со стадии дробления и в течение всего органогенеза. Хотя ранее сообщалось. что клеточный цикл не затрагивается у у преимплентационных тетраплоибных зародышей, однако недавние подсчёты показали, что клеточный цикл примерно на 2 ч медленнее, чем в контроле (Beatty and Fischberg, 1951; Edwards, 1958). Различия обусловлены техническими трудностями выявления 2n и 4n эмбрионов и точного определения у них стадий развития (Henery et al., 1992). Общее количество клеток в тетраплоидном бластоцисте определено как 22 по сравнению с 69 клетками в диплоидном бластоцисте в том же исследовании (Koizumi and Fukata, 1995). Это не согласуется с данными др. исследований (Snow, 1976; Ефклщцылш уе al., 1977; Baraniv, 1983). Хотя количества клеток различны в одновозрастных тетраплоидных и диплоидных преимплантационных эмбрионах, они подвергаются компакции и бластуляции в одно и то же время (Koizumi and Fukuta, 1996). Различия в числе клеток, но не во времени клеточного цикла наблюдались у диплоидных и татраплоидных эмбрионов крыс (Krivokharchenko et al., 2002). Нет указаний, что общий преимплантационный размер тетраплоидов уменьшен. Очевидно, что тетраплоидные клетки в целом имеют больший объём (Snow, 1975, 1976; Ефклщцылш уе al., 1977; Niemierko and Opas, 1978). Ядерные клетки крови висцерального желточного мешка имеютв 4 раза большие объёмы по сравнению с их диплоидными аналогами и м.б. причиной гемморагий, наблюдаемых в тетраплоидных желточных мешках, т.к. крупные клетки д. проталкиваться через сосуды диплоидного диаметра (Snow,1975). Это увеличение клеточного объёма наблюдается также в тетрпалоидных фибробластах человека (Chang et al., 1983; Schmutz and Lin, 1983). Естественно возникающие полиплоидные или политенные клетки часто драматически увеличены в своём объме (напр.. трофобластный гигантские клетки или печеночные паренхимные клетки). Ядерные тетраплоидные клетки крови плода имеют объём ядра и клетки в среднем 1.7-2.3, т.е. почти теоретические 2 раза по сравнению с диплоидным контролем . Гистологические срезы тетраплоидных эмбрионов не выявляют существенного влияния размеров клеток на гистологию областей иных чем головной мозг и бранхиальные дуги за исключением размера очень крупных клеток (Kaufman, 1992). Нормальная гистология задокументирована у тетраплоидов в зародышевых клетках, гонадах (Kaufman, 1991a) и почках (Kaufman, 1992). Developmental Potential of Tetraploid Mouse Embryos Самое длительное выживание тетраплоидных эмбрионов мышей отмечено в аутбредной Q линии (Snow, 1973, 1975). 4 из 78 (5.1%) имплантантов доживали до конце беременности, 3 из них были рождены. Четвёртый был извлечен на Е17.5 и имел externalized органы. С использованием той же техники в др. работе (Tarkowski et al., 1977) не удалось получить эмбрионов более E10.0 . Большинство эмбрионов начинало обнаруживают дефекты уже на 8-й день, включая ограниченную нейральную пластинку и "scanty" мезодерму. Сходные дефекты наблюдались также у кроликов (Ozil and Modlinski, 1986). При использовании гибридов (СВА Х C57Bl/6) F1 примерно 4% CD-обработанных зигот "ревертировало" к диплоидному хромосомному набору (Tarkowski et al.,1977) . Это пропорционально тому количеству, которое наблдалось в первом эксперименте (Snow). Tarkowski фактически отмечает, что до 20% его эмбрионгов развивалось как мозаики, правда до 10-го дня. Тетраплоидные клетки, скорее всего элиминировались из таких эмбрионов. Тетраплоидные жмбрионы, доживающие, хотя и с низкой частотой (1.7-4.2%) до 14 и 15 дня эмбриогенеза описаны на фоне, который включал, по крайней мере один из родителей (С57Bl x CBA) (Kaufman and Webb, 1990; Kaufman, 1991a,b 1992, Henery and Kaufman, 1992). На этих поздних стадиях были выявлены гомогенные тетраплоиды (Kaufman and Webb, 1990; James et al., 1992) . В средине беременности тетраплоидные эмбрионы в целом составляли по размеру 85% от размеров диплоидных эмбрионов (Henery et al., 1992). Дефекты у таких эмбрионов имели характерную морфологию перднего мозга и аберрантные глаза или отсутствие глаз, напоминающее голопрозэнцефалию. Эти дефекты были результатом аномальной миграции прехордальной мезодермы или нейрального гребня. Эта гипотеза былa подтверждена случайным появлением расщепленной или отклонившейся нервной трубки (Kaufman and McLaren, 1992). Наблдались также нарушения оси позвоночника и сердца, также как и случайные situs inversus и отсутствие шишковидной железы (Kaufman and Webb, 1990; Kaufman, 1991b, 1992). Т.к. подобных характеристик не было обнаружено у тетраплоидных эмбрионов (Snow 1973, 1975), то скорее всего его дожившеи до рождения "тетраплоидные" эмбрионы были скорее всего мозаиками (Henery et al., 1992). Правда его анализ эмбриональных и внеэмбриональных тканей исключает 2n:4n химеризм (Snow, 1975). Возможно они не были полностью тетраплидными. Вопрос остаётся нерешенным. Не выявлено существенных дефектов в гонадах у тетраплоидных эмбриорнов обоих полов (Kaufman, 1991a). Примордиальные зародышевые клетки и у XXYY и у ХХХХ животных обнаруживались на 11 день, из-за некоторой здержки миграции этих клеток из алантоиса в заднюю кишку. На 13-14.5 день развития пол таких эмбрионов опредялся морфологически. В отношении распределения половых хромосом у тетраплоидных эмбрионов человека отмечалось примерно на 50% больше XXXX тетраплоидных эмбрионов, чем XXYY у спонтанных абортусов (Sheppard et al., 1982; Surti et al., 1986). Предполагается, что хотя различия между человеком и мышью м.б. обусловлены межвидовыми отличиями, они м.б. также связаны и с 4n:2n мозаичностью ряда спонтанных абортусов человека (Kaufman, 1991a). Описания внеэмбрионального фенотипа тетраплоидов отсутствуют в литературе. Известно, что вес плаценты 4n:2n химерных животных значительно выше, чем в диплоидном контроле (James et al., 1995). Показатели сосудистых аномалий у разных полов м.б. смещены. ; исслдованных XXYY эмбриона обнаруживали сосудистые аномалии, а 3 эмбрионо ХХХХ в том же исследовании не обнаруживали подобных дефектов (Kaufman, 1992). В др. исследовании Х инактивация происходила пропорционально в эмбриорнальных и и мезодермальной ткани с двумя Х хромосомами у ХХХХ мышей, инактивация не обнаруживала склонности в отношении родительского происходения на ст. Е10.5 Однако в энтодермальной ткани наблюдалась преимущественная инактивация отцовской Х хромосомы. У XXYY эмбрионов инактивация наблюдалась нечасто (Webb et al., 1992). Возможно однако, что некоторые классы инактивации м. не определяться, если прошло только 10 дней после индукции тетраплоидности. Максимальное развитие тетраплоидных эмбрионов скорее зависит от линии. Анализ линий, которые использовались для продукции тетраплоидов и химер приведен в Табл. 1. Наиболее продвинутое развитие тетраплоидных эмбрионов наблюдалось у (C57Bl x CBA)F1 гибридных самок, скрещенных с Rb(1.3)Bnr самцами или аутбредной Q линии (Snow, 1973, 1975, 1976). В каждом из этих случаев использованая гибридная линия давала очнь редко продвинутое развитие. Всё это указывает на полигенный механизм управления толерантностью плодов к тетраплоидности. Tissue-Specific Effects of Tetraploidy: 4n:2n Mouse Chimeras Хотя мозаицизм 4n:2n препятствует получению чистых тераплоидов, он используется как мощная техника в современной биологии развития. Комплементация тераплоидных эмбрионов позволяет восстанавливать внеэмбриорнальные фенотипы. Этот процесс происходит в результате преимущественно тенденции диплоидных, особенно ES, клеток преимуществнено колонизировать эмбриональные ткани, когда они ассоциированы с тетраплоидным эмбрионами (Beddington and Robertson, 1989). Хотя условный нокаут используется с тем же самым исходом, описаны лишь мыши, экспрессирующие Cre рекомбиназу только эпибласт-специфическим способом (Tallquist and Soriano, 2000). Нет сообщений об экспрессии Cre, саецифичной для трофобласта или висцеральной энтодермы мышей. Тенденция ES клеток вносить вклад в эмбриональный клон, скомбинированный с тетраплоидной комплементацией внеэмбриональных фенотипов такж м.б. использоваться для продукции эмбрионов почти на 100%, происходящих из ES клеток (Nagy et al., 1993). Эта техника адаптирована теперь и к крупному рогатому скоту (Iwasaki et al., 1999, 2000) и свиньям (Prather et al., 1996). Blastocyst Injection vs. Aggrergation for Making 4n:2n Chmeras Химеры м.б. получены агрегацией двух отдельных эмбрионов или инъекцией чущеродной клетки непосредственнов ранний эмбрион. Метод инъекуии m,kfcnjwbcnf наиблолее прямой по получению химер. Продукция химерных мышей из редко пересаживаемых ES клеток не позволяет выявить существенных различий между двумя техниками, когда химеры анализируются в средине беременности (Peli et al., 1996) или по их способности давать зародышевую линию (Wood et al., 1993). Инъекция в бластоцист однако м.б. более пригодной для продукции химер из ES клеток после высокого количества пассажей (Wang et al., 1997). Инъекции бластоцистов не нуждаются в (иногда трудоёмких) манипуляциях "sticky" и более гибких тетраплоидных бластоцитов. По этой причине различия в текстуре возможны в несколько раз. Во-первых, тераплоидный бластоцист имеет меньше клеток, с которыми устанавливается межклеточная адгезия. Во-вторых, удвоение объёма сферы не вызывает удвоения поверхностной области. Объём и поверхность связаны фактором r/3. Учитывая средний размер клеток (Henery and Kaufman, 1992) м. подсчитать увеличение площади поверхности. Так 100% увеличение объёма эритроцита ведет к увеличению на 51% поверхности. Поэтому меньшее количество клеток в тетраплоидном бластоцисте м. приводить к снижению способности слипаться др . с др. по сравнению с маленькими клетками, более многочисленными в диплоидном бластоцисте. В-третьих, тетраплоидные эмбрионы обычно культивируются до стадии бластоциста in vitro в течение 2-3 дней перед инъекцией. Эта стратегия м. также вызывать фундаментальные изменения в строении (texture) эмбриона по отношению к свеже выделенным диплоидным бластоцистам, обычно используемым для инъекций. Однако имеются доказательства, что 4n:2n химеры. продуцируемые инъекциями бластоцистов м.б. более жизнеспособными, чем те, чтополучаются в результате агрегации. Кроме того инъекции в бластоцисты позволяют градировать и индивидаульно отбирать ES клетки на базе их морфологии. Тогда как агрегация происзводится с группой ES клеток, где отбор невозможен. Использование агрегационных химер несколько более популярно для продукции 4n:2n химер. Причиной м.б. то, что агрегационные химеры м. создаваться по 100-150 штук в час по сравнению с синъекциями (20-30) (Wood et al., 1993). Агрегационые химеры не нуждаебютс в разработке инъекционных аппаратов и нуждаются в меньшей профессирональной практике... Development of 4n:2n Chimeras Гомогенные тетраплоидные мышиные эмбрионы способны развиваться до предгаструлы, а ингода до более поздних стадий. Химерные эмбрионы часто доживают до рождеия. У таких химер тераплоидные клетки недопредставленны в сосбственно эмбрионе из-за селективных несоответствий с 2n клетками. Первые 4n:2n мозаичные мыши были получены при обработке двух- и 4-клеточных эмбрионов с помошью CD (Tarkowski et al., 1977). У таких эмбрионов отмечалось очень низкая пропорция тетраплоидных клеток, присутствующих в собственно эмбрионе ( менее 4%) но до 50% во вреэмбриональных тканях. После улучшения техники др. авт. было получено 2 живорожденных из 59 4n:2n химер (Lu and Market, 1980). Выявленн примерно 3% вклад тетраплоидных клеток в костный мозг одной химеры. Эта находка указывает на то, что при определенных условиях тетраплоидные клетки м. сохраняться и постнатально. Механизм, с помощью которого тетраплоидные клетки преимущественно ограниченны внеэмбриональными тканями, неизвестен. Имеется, по-видимом, множество факторов, обусловливающих низкий вклад тетраплоидных клеток в эмбрион, включая приспособленность, сниженный онтогенетический потенциал или дифференциаьная скорость клеточных делений. Внеэмбриональные ткани обладают большим количеством естественных полиплоидных клеток, включая трофобластные гигантские и синцитиотрофобластные клетки. Так как функции этих клеток включают и резистентность к повреждающему эффекту полиплоидии, поэтому экспериментально индуцированные тетраплоидные клетки будут более жизнеспособными в этих тканях, толерантных к полиплоидии. Имеются данные, подтверждающие эту идею в др. областях тела, включая и те, что происходят из собственно эмбриона. Напр., тетраплоидные клетки персистируют в развивающейся печени в средине беременности у химерных мышей (Goto et al., 2002). Имеются доказательства, указывающие на то, что большие клетки м. обнаруживать тенденцию колонизировать трофэктодремльаный клон независимо от плоидности. В этом случае предполагется, что большие клетки механически силой нгаправляются к наружным краям компактирующей морулы и впоследствии адоптируют судьбу внеэмбриональных клеток (Everett and West, 1996; Tang and West, 2000). Эти факторы, по-видимому, начинают действовать вскоре после формирования химеры, склоняя ткани к той или иной плоидности. Тенденция тетраплоидных клеток колонизировать трофэктодерму обнаруживается на ст. бластоциста. Эта колонизация м. сопровождаться отбором против тераплоидных клеток в ICM, хотя спустя 4.5 дней развития тетраплидные клетки все ещё присутствуют на уровне 13% (Everett and West, 1996, 1998; Everett et al., 2000). По мере развития тетраплоидные клетки всё меньше и меньше вкладывают в тканиЮ, производные ICM (Tarkowski et al., 1997; Nagy et al., 1990; James et al., 1995; Wang et al., 1997; Tang and West, 2000; Goto et al., 2002). На ст. 12.5 минорный влад тетраплоидных клеток в собственно эмбрион, наблюдаемый в малых частях сердца, печени и кожи (Goto et al., 2002). У 5 из 60 новорожеденных или старых мышей, вклаю тетраплоиных клеток определялся по кариотипу или с помошью GPI метода составлял 3-50% в сердце, крови, лёгких и печени; тетраплоидии не выявлено у остальных 55 оставшихся мышей (Lu and Markert, 1980; Nagy et al., 1993; Wamg et al., 1997). Снова онтогенетический потенциал тетраплоидных клеток, как полагают, обнаруживает линейную зависимость. Взрослые клетки, если это разрешено, спонтанно сливаются с ES клетками и продуцируют клетоыные линии с тетраплоидным или с почти тетраплоидным кариотипом (Matveeva et al., 1998; Terada et al., 2002; Yung et al., 2002). В двух работах по сличнию взрослых клеток выявлен высокий показатель потери хромосом после после слияния (Terada et al., 2002). Oдин набор продуктов слияния с ES клетками оказался неспособным давать химеры после инъекции в диплоидный бластоцист V. Др. почти тетраплоидная линия клеток обладала нестабильностью и потеряла почти половину хромосом после 5-7 пассажей (Matveeva et al., 1998). В одном случае однако Продукты слияния с ES клетками были способны давать кишечные, почечные, кардиальные и печеночные клетки после инъекции этих клеток в диплоидный блпстоцист. Кариотип клеточной линии был тетраплоидным или почти тетраплоидным (Ying et al., 2002), хотя осталось неясным, какая линия клеток продуцировала химеры. т.к.прошло много пассажей между кариотипированием и инъекцией в бластоцисты. Types of 4n:2n Chimeras 4n:2n химеры м.б. получены путём комбинировния 4n эмбрионов с (1) 2n эмбрионами, (2) с ES клетками или (3) с клетками внутренней клеточной массы (ICM). В каждом случае тетраплоидные клетки вносят вклад преимущественно во внеэмбриорнальные ткани. однако распределение клеток иногда модифицируется типом полученных химер. Агрегация тетраплоидной морулы с диплоидной морулой часто используется в экспреиментах по комплементации тетраплоидных эмбрионов, чтобы сегрегировать фенотипические эффекты данного генетического фона на эмбриональные скорее, чем внеэмбриональные ткани с помошью агрегации мутаных эмбрионов с тетраплоидными дикого типа эмбррионами. Эта техника успешно применяется для преодоления внеэмбриональной летальности и продукции взрослых мутантных гомозигот мышей и для изучения внеэмбриональных дефектов (Guillemot et al., 1994). В др. исследованиях эта техника использования для преодоления внеэмбриональных дефектов для изучения дополнительных эмбриональных дефектов (Luo et al., 1997; Rossant et al., 1998; Sibilia et al., 1998; Yamamoto et al., 1998; Li et al., 2000; Gallicano et al., 2001; Hobbs et al., 2002). Диплодные эмбрионы, агрегированные с тетраплоидными эмбрионами д. обладать более высокой степенью онтогенетического потенциала. В этом случае диплоидные клетки, как ожидается, будут вносить вклад и в эмриональные и внеэмбриональные ткани. Рис.2 \| Embryos derived from Hprt-deficient ES cells by tetraploid aggregation. Получены химерные эмбрионы из двухклеточных тетраплоидных эмбрионов и диплоидных ES клеток (Nagy et al., 1990, 1993). Ограниченная способность ES клеток колонизировать трофобласт, сегрегация диплоидных и тетраплоидных клеток в таких химерах более очевидна (Beddington and Robertson, 1989). Основным нерешенным вопросом остаётся, как клетки распределяются между имплантацией и 7.5 днём эмбриогенеза. Хотя недавние исследования сообщили о почти эквивалентном количестве и вкладе тетраплоидных и диплоидных клеток во время гаструляции химер, полученных с помошью агрегации эмбрионов (Goto et al., 2002). Эти результаты не достигнуты на химерах полученных из ES клеток. Агрегация или инъекция ES клеток в др. дикого типа тетраплидные эмбрионы используются многими в одном и том же типе экспериментов. Это используется и для продукции мутантных эмбрионов непосредственно из ES клеток для анализа их мутантного фенотипа без генерации животных с помощью скрещиваний химер по зародышевой линии. Эта стратегия особенно пригодна в случае гетерозиготных эмбриональных леталей Vegf аллеля. Продукция 4n:Es клеточных химер позволяыет анализировать эмбриональные дефекты как у гетерозиготных, так и гомозиготных мутантных эмбрионов без использования условных аллелей (Carmellet et al., 1996, 1997). Хотя большинство мутаций не отягощено гетерозиготной летальностью, др. преимущество этого подхода заключается в быстрой оценке эмбрионального фенотипа и в неограниченной продукции мутантов без разведения. Возможно также увкорение традиционного процесса разведения с тетраплоидными эмбрионами, путём создаения химер из прицельно изменённой ES линии, которая спонтанно потеряла Y хромосому. Т.к. Х0 самки жизнеспособны и фертильны, то получемые химеры с помощью этой техники м.б. скрещены с нормальными самцовыми химерами из той же самой targeted (XY) ES линии для более быстрой продукции гомозиготного мутантного потомства (Eggan et al., 2002). ICM агрегация сходна с агрегацией с ES клетками, В этом случае ICMs выращивают как и на первой ступени изоляции ES клеток. Затем они дизагрегируются с помощью протеаз и комбинируются непосредственно с тетраплоидными эмбрионами. Это создаёт популяцию клеток с гетерогенными эмбриональнымит онтогенетическими потенциалами, включая субнаборы плюритотентных ES-подобных клеток. Это первоначально использовали в качестве контроля для оригинальных исследовний, осуществляемых с помошью 4n:ES агрегационных химер. 4n:ICM клеточные агрегаты продуцируют больший процент здоровых новорожеденных, чем 4n:ES клеточные химеры (Nagy et al., 1990). Эти различия в жизнеспособности м.б. показателем того, что зддоровые химеры, продуцируемые с помошью агрегации скорее всего обуслвоены различиями в донорских клетках скоере, чем проблемами техники агрегации (Nagy and Rossant, 2001). Недавно этот тип химер был получен, чтобы показать. что низкая жизнеспособность эмбрионов, клонируемых с помощью трансплантаций ядер не только связана с неспособностью клонируемой трфэктодермы, но и с субоптимальным онтогенетическим потенциалом ICM (Amano et al., 2002).

В результате слияний клеток или ошибок во время клеточного деления клетки, а иногда и целые организмы становятся полиплоидными. Некоторые ткани (напр., склетные мышцы, гепатоциты, мегакариоциты, эпителий мочевого пузыря, миокард, синцитиотрофобласт и corpora lutea) часто полиплоидны в результате эндодупликаций генома или слияния клеток во время нормального развития (Keighren ana West, 1993). Др. клетки, такие как трофобластные гигантские клетки, рассматриваются как политенные, имеющие значительные количества хроматид на хромосому скорее, чем полиплоидные, имеющие большие количества сегрегирующих хромосом. Имея множественные копии генома клетки получают определенные преимущества, такие как устойчивость к повреждениям генома. Кроме того увеличиваются размеры клеток в результате полиплоидии или политении, что предоставляет им большую гибкость и силу в ткани, подверженной механическим стрессам, напр., эпителий мочевого пузыря (Brodsky and Uryvaeva, 1985). Большие размеры клеток позволяют также развивать ткани с меньшим их содержанием. Молекулярные механизмы, управляющие специфической для типа клеток резистентностью к полиплоидии остаются неизвестными. Часто отклонение от плоидности в 2n приводит к болезненым состояниям.

Хотя тетраплодность у людей редка, последствия аномального количества хромосом и баланса генов нередки (Hassold and Hunt, 2001). Х0 кариотип ведет к синдрому Тёрнера, тогда как большинство др. моносомий даёт нежизнеспособные эмбрионы. Трисомии половых хромосом, с XXY (синдром Клянфельтера), XYY и ХХХ появляются с частотой примерно 1 на 1000 родов. Трисомии актосом обычно дают нежизнеспособные эмбрионы. Трисомии по хромосоме 8 и 9 вызывают летальные онтогенетические дефекты; трисомии 13, 18 и 21 (синдром Дауна) рождаются, хотя большинство не живёт и несколько мес. Это умственно отсталые, имеющие от слабых до тяжелых уродств (Larsen, 1993). Присутствие врожденных пороков сердца у индивидов с синдромом Дауна коррелирует с тремя полиморфизмами рестрикционных длин фрагментов в области COL6A1 на хромосоме 21 (Davies et al., 1995). Это указывает на то. что тяжесть синдрома, вызываемая анеуплидией м. б. модифицирована частично генетическим фоном.

Хотя млекопитающие, по-видимому, особенно чувствительны к повреждающим эффектам полиплоидии, эволюция создала некоторые организмы с варьирующими значениями n. Xenopus laevis и Danio rerio считаются производными аллотетрапоидных предшественников. Аллотетрапоидные организмы являются следствием комбинации двух геномов близко родственных видов, которые содержат генетически отличающиеся наборы хромосом (Reiger et al., 1991). Слияние геномов, как полагают, играет роль в недавней эволюции только у одного млекопитающего. Красные viscacha крысы Tympanictromys barrerae обладают 100 аутосомными хромосомами и двумя половыми хромосомами, тогда как ближайший родственник обладает только 55 аутосомами и одиночным нобором половых хромосом (Contreras et al., 1990; Gallardo et al., 1999). Очевидное удвоение генома затрагивает не только половые хромосомы, но и удвоение 43 хромосомных пар, это м. указывать на то. что эти хромосомы м. нести локусы, которые несовместимы в полиплоидией in vivo.

Полная тетраплоидность, как правило, несовместима с нормальным развитием и жизнеспособностью. Редкие примеры спонтанной тетраплоидии обычно связаны с нарушениями цитокинеза в первом делении зиготических клеток, это происходит у мышей с частотой примерно в 0.1%. Показатели спонтанной тетраплоидии у крыс, кроликов и свиней подсчитаны равнми 0.4%, 0.3%, 0.1-3.4%, соотв.,(ЬсАууднб 1969ж Внифт and Baraniv, 1987) тогда как показатель у эмбрионов коров, продуцируемых in vitro состасляет 2.8% (Kawarsky et al., 1996). Кариотипы спонтанных абортусов у лбюдей выявляют частоты спонтанной тетраплоидии между 1.1 и 7.1% (Carr, 1972; Creasy et al., 1976; Hassold et al., 1980; Kajii et al., 1980), при этом большинство приходится на низший ранг. Они обычно характеризуются пустым хориональным мешком без каких-либо эмбриональных тканей (Warburton et al., 1991). Аборты обычно происходят на 11 неделе менструального цикла, то считается, что смерть эмбрионов наступает значительно раньше (Carr, 1972). Однако несмотря на это известно 9 полностью тетраплоидных живорожденных, описанных в последние 30 лет. Такие дети обладали мириадом дефектов, включая spina bifida, скелетные и хрящевые аномалии, а также гипоплазию органов. Большинство имело лицевые дисморфологии (Warburton et al., 1991).

Experimental Production of Tetraploidy in Mammals

Nuclear Transfer into Zygotes

...

Inhibition of Cleavage

...

Blastomere Fusion

...

Development of the Teraploid Mouse Embryo

Gene Expression in Tetraploid Embryos

Существует ограниченное количество доказательств по измерению генных продуктов в тетраплодидных клетках мелкоптающих. немногие наблюдаения подчеркивают, что тетраплоидность не дает в результате простое удвоение белка или уровня экспрессии РНК, этот феномен согласуется с исследованиями растений и др. видов (Epstein, 1986; Osborn et a., 2003). Уровни общей РНК и malate dehydrogenase в тетраплоидной моруле выше в 1.5 раз по сравнению с диплоидным контролем (Eglitis and Wiley, 1981). Линия клеток фибробластов, произошедшая из человеческого тетраплоидного абортуса экспрессирует пониженную ферменттативную активность peptidase 5 по сравнению с диплоидной контрольной линией (Schmutz and Lin, 1983).

Имеются также доказательства, подтвержающие, что два генома скомбинированные во время слияния бластомеров, м. не экспрессировать своих генов на одном и том же уровне. Когда два бластомера, каждый из которых нёс уникальнsq glucose phosphate isomerase (GPI)аллель на отличающихся генетических фонах (129/Sv и C57Bl/6-JHan), былиэлектрослиты, то соотношение экспрессии GPI было неэквивалентным, это указывает на то, что два слитых генома обнаруживают разные реакции на тетраплоидность (Petzoldt, 1991). На ст. морулы различия в уровнях двух изозимов GPI составляли 45:5. На ст. экспансии бластоциста соотношение оказывалось 41:58. Объединённые данные всё же выявляют четкую неодинаковость вклада.

Исследования дозы гена у тетраплоидных эмбрионов млекопитающих редки, комбинировнные данные указывают на то, что тетраплоидность не вызвает простого удвоения клетки и всего её содержимого. Как уже отмечалось, полиплоидия существенна для нормальной функции многих клеток в теле, но она вредна для функционирования др. Мало данных о механизмах, с помощью которых доза гена регулируется в полиплидных клетках млекопитающих, очевидно, что эти клетки д. обладать генетическим механизмом для устранения негативных последствий полиплоидии. Наиболее приемлемым объяснением возникновения полиплоидных видов (напр.. T.barrerae) и редких наблюдений полиплоидных млекопитающих на поздней ст. беременности является то, что внутри генного пула у каждого из этих организмов, из которых возник тетраплоид существует комбинация аллелей, которая действует в пользу резистентности к полиплоидии.

Cellular Effects of Tetraploidy

Тетраплоидия вызывает несколько задокументированных эффектов на индивидуальные клетки плода, включая размер клеток, длину клеточного цикла и, наконец, общее количество клеток у тетраплоидного эмбриона. Тетраплоидные эмбрионы скорее всего имеют замедленный клеточный цикл и как следствие меньше клеток. Однако оазмер всего тетраплоидного эмбриона остаётся грубо эксивалентным диплоидному эмбрионоу той же ста. развития. Описывается обратная пропорциаональность между плоидностью и количеством клеток, начиная со стадии дробления и в течение всего органогенеза.

Хотя ранее сообщалось. что клеточный цикл не затрагивается у у преимплентационных тетраплоибных зародышей, однако недавние подсчёты показали, что клеточный цикл примерно на 2 ч медленнее, чем в контроле (Beatty and Fischberg, 1951; Edwards, 1958). Различия обусловлены техническими трудностями выявления 2n и 4n эмбрионов и точного определения у них стадий развития (Henery et al., 1992).

Общее количество клеток в тетраплоидном бластоцисте определено как 22 по сравнению с 69 клетками в диплоидном бластоцисте в том же исследовании (Koizumi and Fukata, 1995). Это не согласуется с данными др. исследований (Snow, 1976; Ефклщцылш уе al., 1977; Baraniv, 1983). Хотя количества клеток различны в одновозрастных тетраплоидных и диплоидных преимплантационных эмбрионах, они подвергаются компакции и бластуляции в одно и то же время (Koizumi and Fukuta, 1996). Различия в числе клеток, но не во времени клеточного цикла наблюдались у диплоидных и татраплоидных эмбрионов крыс (Krivokharchenko et al., 2002).

Нет указаний, что общий преимплантационный размер тетраплоидов уменьшен. Очевидно, что тетраплоидные клетки в целом имеют больший объём (Snow, 1975, 1976; Ефклщцылш уе al., 1977; Niemierko and Opas, 1978). Ядерные клетки крови висцерального желточного мешка имеютв 4 раза большие объёмы по сравнению с их диплоидными аналогами и м.б. причиной гемморагий, наблюдаемых в тетраплоидных желточных мешках, т.к. крупные клетки д. проталкиваться через сосуды диплоидного диаметра (Snow,1975). Это увеличение клеточного объёма наблюдается также в тетрпалоидных фибробластах человека (Chang et al., 1983; Schmutz and Lin, 1983). Естественно возникающие полиплоидные или политенные клетки часто драматически увеличены в своём объме (напр.. трофобластный гигантские клетки или печеночные паренхимные клетки). Ядерные тетраплоидные клетки крови плода имеют объём ядра и клетки в среднем 1.7-2.3, т.е. почти теоретические 2 раза по сравнению с диплоидным контролем . Гистологические срезы тетраплоидных эмбрионов не выявляют существенного влияния размеров клеток на гистологию областей иных чем головной мозг и бранхиальные дуги за исключением размера очень крупных клеток (Kaufman, 1992). Нормальная гистология задокументирована у тетраплоидов в зародышевых клетках, гонадах (Kaufman, 1991a) и почках (Kaufman, 1992).

Developmental Potential of Tetraploid Mouse Embryos

Самое длительное выживание тетраплоидных эмбрионов мышей отмечено в аутбредной Q линии (Snow, 1973, 1975). 4 из 78 (5.1%) имплантантов доживали до конце беременности, 3 из них были рождены. Четвёртый был извлечен на Е17.5 и имел externalized органы. С использованием той же техники в др. работе (Tarkowski et al., 1977) не удалось получить эмбрионов более E10.0 . Большинство эмбрионов начинало обнаруживают дефекты уже на 8-й день, включая ограниченную нейральную пластинку и "scanty" мезодерму. Сходные дефекты наблюдались также у кроликов (Ozil and Modlinski, 1986). При использовании гибридов (СВА Х C57Bl/6) F1 примерно 4% CD-обработанных зигот "ревертировало" к диплоидному хромосомному набору (Tarkowski et al.,1977) . Это пропорционально тому количеству, которое наблдалось в первом эксперименте (Snow). Tarkowski фактически отмечает, что до 20% его эмбрионгов развивалось как мозаики, правда до 10-го дня. Тетраплоидные клетки, скорее всего элиминировались из таких эмбрионов.

Тетраплоидные жмбрионы, доживающие, хотя и с низкой частотой (1.7-4.2%) до 14 и 15 дня эмбриогенеза описаны на фоне, который включал, по крайней мере один из родителей (С57Bl x CBA) (Kaufman and Webb, 1990; Kaufman, 1991a,b 1992, Henery and Kaufman, 1992). На этих поздних стадиях были выявлены гомогенные тетраплоиды (Kaufman and Webb, 1990; James et al., 1992) . В средине беременности тетраплоидные эмбрионы в целом составляли по размеру 85% от размеров диплоидных эмбрионов (Henery et al., 1992). Дефекты у таких эмбрионов имели характерную морфологию перднего мозга и аберрантные глаза или отсутствие глаз, напоминающее голопрозэнцефалию. Эти дефекты были результатом аномальной миграции прехордальной мезодермы или нейрального гребня. Эта гипотеза былa подтверждена случайным появлением расщепленной или отклонившейся нервной трубки (Kaufman and McLaren, 1992). Наблдались также нарушения оси позвоночника и сердца, также как и случайные situs inversus и отсутствие шишковидной железы (Kaufman and Webb, 1990; Kaufman, 1991b, 1992). Т.к. подобных характеристик не было обнаружено у тетраплоидных эмбрионов (Snow 1973, 1975), то скорее всего его дожившеи до рождения "тетраплоидные" эмбрионы были скорее всего мозаиками (Henery et al., 1992). Правда его анализ эмбриональных и внеэмбриональных тканей исключает 2n:4n химеризм (Snow, 1975). Возможно они не были полностью тетраплидными. Вопрос остаётся нерешенным.

Не выявлено существенных дефектов в гонадах у тетраплоидных эмбриорнов обоих полов (Kaufman, 1991a). Примордиальные зародышевые клетки и у XXYY и у ХХХХ животных обнаруживались на 11 день, из-за некоторой здержки миграции этих клеток из алантоиса в заднюю кишку. На 13-14.5 день развития пол таких эмбрионов опредялся морфологически. В отношении распределения половых хромосом у тетраплоидных эмбрионов человека отмечалось примерно на 50% больше XXXX тетраплоидных эмбрионов, чем XXYY у спонтанных абортусов (Sheppard et al., 1982; Surti et al., 1986). Предполагается, что хотя различия между человеком и мышью м.б. обусловлены межвидовыми отличиями, они м.б. также связаны и с 4n:2n мозаичностью ряда спонтанных абортусов человека (Kaufman, 1991a).

Описания внеэмбрионального фенотипа тетраплоидов отсутствуют в литературе. Известно, что вес плаценты 4n:2n химерных животных значительно выше, чем в диплоидном контроле (James et al., 1995).

Показатели сосудистых аномалий у разных полов м.б. смещены. ; исслдованных XXYY эмбриона обнаруживали сосудистые аномалии, а 3 эмбрионо ХХХХ в том же исследовании не обнаруживали подобных дефектов (Kaufman, 1992). В др. исследовании Х инактивация происходила пропорционально в эмбриорнальных и и мезодермальной ткани с двумя Х хромосомами у ХХХХ мышей, инактивация не обнаруживала склонности в отношении родительского происходения на ст. Е10.5 Однако в энтодермальной ткани наблюдалась преимущественная инактивация отцовской Х хромосомы. У XXYY эмбрионов инактивация наблюдалась нечасто (Webb et al., 1992). Возможно однако, что некоторые классы инактивации м. не определяться, если прошло только 10 дней после индукции тетраплоидности.

Максимальное развитие тетраплоидных эмбрионов скорее зависит от линии. Анализ линий, которые использовались для продукции тетраплоидов и химер приведен в Табл. 1. Наиболее продвинутое развитие тетраплоидных эмбрионов наблюдалось у (C57Bl x CBA)F1 гибридных самок, скрещенных с Rb(1.3)Bnr самцами или аутбредной Q линии (Snow, 1973, 1975, 1976). В каждом из этих случаев использованая гибридная линия давала очнь редко продвинутое развитие. Всё это указывает на полигенный механизм управления толерантностью плодов к тетраплоидности.

Tissue-Specific Effects of Tetraploidy: 4n:2n Mouse Chimeras

Хотя мозаицизм 4n:2n препятствует получению чистых тераплоидов, он используется как мощная техника в современной биологии развития. Комплементация тераплоидных эмбрионов позволяет восстанавливать внеэмбриорнальные фенотипы. Этот процесс происходит в результате преимущественно тенденции диплоидных, особенно ES, клеток преимуществнено колонизировать эмбриональные ткани, когда они ассоциированы с тетраплоидным эмбрионами (Beddington and Robertson, 1989). Хотя условный нокаут используется с тем же самым исходом, описаны лишь мыши, экспрессирующие Cre рекомбиназу только эпибласт-специфическим способом (Tallquist and Soriano, 2000). Нет сообщений об экспрессии Cre, саецифичной для трофобласта или висцеральной энтодермы мышей. Тенденция ES клеток вносить вклад в эмбриональный клон, скомбинированный с тетраплоидной комплементацией внеэмбриональных фенотипов такж м.б. использоваться для продукции эмбрионов почти на 100%, происходящих из ES клеток (Nagy et al., 1993). Эта техника адаптирована теперь и к крупному рогатому скоту (Iwasaki et al., 1999, 2000) и свиньям (Prather et al., 1996).

Blastocyst Injection vs. Aggrergation for Making 4n:2n Chmeras

Химеры м.б. получены агрегацией двух отдельных эмбрионов или инъекцией чущеродной клетки непосредственнов ранний эмбрион. Метод инъекуии m,kfcnjwbcnf наиблолее прямой по получению химер. Продукция химерных мышей из редко пересаживаемых ES клеток не позволяет выявить существенных различий между двумя техниками, когда химеры анализируются в средине беременности (Peli et al., 1996) или по их способности давать зародышевую линию (Wood et al., 1993). Инъекция в бластоцист однако м.б. более пригодной для продукции химер из ES клеток после высокого количества пассажей (Wang et al., 1997).

Инъекции бластоцистов не нуждаются в (иногда трудоёмких) манипуляциях "sticky" и более гибких тетраплоидных бластоцитов. По этой причине различия в текстуре возможны в несколько раз. Во-первых, тераплоидный бластоцист имеет меньше клеток, с которыми устанавливается межклеточная адгезия. Во-вторых, удвоение объёма сферы не вызывает удвоения поверхностной области. Объём и поверхность связаны фактором r/3. Учитывая средний размер клеток (Henery and Kaufman, 1992) м. подсчитать увеличение площади поверхности. Так 100% увеличение объёма эритроцита ведет к увеличению на 51% поверхности. Поэтому меньшее количество клеток в тетраплоидном бластоцисте м. приводить к снижению способности слипаться др . с др. по сравнению с маленькими клетками, более многочисленными в диплоидном бластоцисте. В-третьих, тетраплоидные эмбрионы обычно культивируются до стадии бластоциста in vitro в течение 2-3 дней перед инъекцией. Эта стратегия м. также вызывать фундаментальные изменения в строении (texture) эмбриона по отношению к свеже выделенным диплоидным бластоцистам, обычно используемым для инъекций. Однако имеются доказательства, что 4n:2n химеры. продуцируемые инъекциями бластоцистов м.б. более жизнеспособными, чем те, чтополучаются в результате агрегации. Кроме того инъекции в бластоцисты позволяют градировать и индивидаульно отбирать ES клетки на базе их морфологии. Тогда как агрегация происзводится с группой ES клеток, где отбор невозможен.

Использование агрегационных химер несколько более популярно для продукции 4n:2n химер. Причиной м.б. то, что агрегационные химеры м. создаваться по 100-150 штук в час по сравнению с синъекциями (20-30) (Wood et al., 1993). Агрегационые химеры не нуждаебютс в разработке инъекционных аппаратов и нуждаются в меньшей профессирональной практике...

Development of 4n:2n Chimeras

Гомогенные тетраплоидные мышиные эмбрионы способны развиваться до предгаструлы, а ингода до более поздних стадий. Химерные эмбрионы часто доживают до рождеия. У таких химер тераплоидные клетки недопредставленны в сосбственно эмбрионе из-за селективных несоответствий с 2n клетками. Первые 4n:2n мозаичные мыши были получены при обработке двух- и 4-клеточных эмбрионов с помошью CD (Tarkowski et al., 1977). У таких эмбрионов отмечалось очень низкая пропорция тетраплоидных клеток, присутствующих в собственно эмбрионе ( менее 4%) но до 50% во вреэмбриональных тканях. После улучшения техники др. авт. было получено 2 живорожденных из 59 4n:2n химер (Lu and Market, 1980). Выявленн примерно 3% вклад тетраплоидных клеток в костный мозг одной химеры. Эта находка указывает на то, что при определенных условиях тетраплоидные клетки м. сохраняться и постнатально.

Механизм, с помощью которого тетраплоидные клетки преимущественно ограниченны внеэмбриональными тканями, неизвестен. Имеется, по-видимом, множество факторов, обусловливающих низкий вклад тетраплоидных клеток в эмбрион, включая приспособленность, сниженный онтогенетический потенциал или дифференциаьная скорость клеточных делений. Внеэмбриональные ткани обладают большим количеством естественных полиплоидных клеток, включая трофобластные гигантские и синцитиотрофобластные клетки. Так как функции этих клеток включают и резистентность к повреждающему эффекту полиплоидии, поэтому экспериментально индуцированные тетраплоидные клетки будут более жизнеспособными в этих тканях, толерантных к полиплоидии. Имеются данные, подтверждающие эту идею в др. областях тела, включая и те, что происходят из собственно эмбриона. Напр., тетраплоидные клетки персистируют в развивающейся печени в средине беременности у химерных мышей (Goto et al., 2002). Имеются доказательства, указывающие на то, что большие клетки м. обнаруживать тенденцию колонизировать трофэктодремльаный клон независимо от плоидности. В этом случае предполагется, что большие клетки механически силой нгаправляются к наружным краям компактирующей морулы и впоследствии адоптируют судьбу внеэмбриональных клеток (Everett and West, 1996; Tang and West, 2000). Эти факторы, по-видимому, начинают действовать вскоре после формирования химеры, склоняя ткани к той или иной плоидности. Тенденция тетраплоидных клеток колонизировать трофэктодерму обнаруживается на ст. бластоциста. Эта колонизация м. сопровождаться отбором против тераплоидных клеток в ICM, хотя спустя 4.5 дней развития тетраплидные клетки все ещё присутствуют на уровне 13% (Everett and West, 1996, 1998; Everett et al., 2000). По мере развития тетраплоидные клетки всё меньше и меньше вкладывают в тканиЮ, производные ICM (Tarkowski et al., 1997; Nagy et al., 1990; James et al., 1995; Wang et al., 1997; Tang and West, 2000; Goto et al., 2002). На ст. 12.5 минорный влад тетраплоидных клеток в собственно эмбрион, наблюдаемый в малых частях сердца, печени и кожи (Goto et al., 2002). У 5 из 60 новорожеденных или старых мышей, вклаю тетраплоиных клеток определялся по кариотипу или с помошью GPI метода составлял 3-50% в сердце, крови, лёгких и печени; тетраплоидии не выявлено у остальных 55 оставшихся мышей (Lu and Markert, 1980; Nagy et al., 1993; Wamg et al., 1997). Снова онтогенетический потенциал тетраплоидных клеток, как полагают, обнаруживает линейную зависимость.

Взрослые клетки, если это разрешено, спонтанно сливаются с ES клетками и продуцируют клетоыные линии с тетраплоидным или с почти тетраплоидным кариотипом (Matveeva et al., 1998; Terada et al., 2002; Yung et al., 2002). В двух работах по сличнию взрослых клеток выявлен высокий показатель потери хромосом после после слияния (Terada et al., 2002). Oдин набор продуктов слияния с ES клетками оказался неспособным давать химеры после инъекции в диплоидный бластоцист V. Др. почти тетраплоидная линия клеток обладала нестабильностью и потеряла почти половину хромосом после 5-7 пассажей (Matveeva et al., 1998). В одном случае однако Продукты слияния с ES клетками были способны давать кишечные, почечные, кардиальные и печеночные клетки после инъекции этих клеток в диплоидный блпстоцист. Кариотип клеточной линии был тетраплоидным или почти тетраплоидным (Ying et al., 2002), хотя осталось неясным, какая линия клеток продуцировала химеры. т.к.прошло много пассажей между кариотипированием и инъекцией в бластоцисты.

Types of 4n:2n Chimeras

4n:2n химеры м.б. получены путём комбинировния 4n эмбрионов с (1) 2n эмбрионами, (2) с ES клетками или (3) с клетками внутренней клеточной массы (ICM). В каждом случае тетраплоидные клетки вносят вклад преимущественно во внеэмбриорнальные ткани. однако распределение клеток иногда модифицируется типом полученных химер.

Агрегация тетраплоидной морулы с диплоидной морулой часто используется в экспреиментах по комплементации тетраплоидных эмбрионов, чтобы сегрегировать фенотипические эффекты данного генетического фона на эмбриональные скорее, чем внеэмбриональные ткани с помошью агрегации мутаных эмбрионов с тетраплоидными дикого типа эмбррионами. Эта техника успешно применяется для преодоления внеэмбриональной летальности и продукции взрослых мутантных гомозигот мышей и для изучения внеэмбриональных дефектов (Guillemot et al., 1994). В др. исследованиях эта техника использования для преодоления внеэмбриональных дефектов для изучения дополнительных эмбриональных дефектов (Luo et al., 1997; Rossant et al., 1998; Sibilia et al., 1998; Yamamoto et al., 1998; Li et al., 2000; Gallicano et al., 2001; Hobbs et al., 2002). Диплодные эмбрионы, агрегированные с тетраплоидными эмбрионами д. обладать более высокой степенью онтогенетического потенциала. В этом случае диплоидные клетки, как ожидается, будут вносить вклад и в эмриональные и внеэмбриональные ткани.

Рис.2 | Embryos derived from Hprt-deficient ES cells by tetraploid aggregation.

Получены химерные эмбрионы из двухклеточных тетраплоидных эмбрионов и диплоидных ES клеток (Nagy et al., 1990, 1993). Ограниченная способность ES клеток колонизировать трофобласт, сегрегация диплоидных и тетраплоидных клеток в таких химерах более очевидна (Beddington and Robertson, 1989). Основным нерешенным вопросом остаётся, как клетки распределяются между имплантацией и 7.5 днём эмбриогенеза. Хотя недавние исследования сообщили о почти эквивалентном количестве и вкладе тетраплоидных и диплоидных клеток во время гаструляции химер, полученных с помошью агрегации эмбрионов (Goto et al., 2002). Эти результаты не достигнуты на химерах полученных из ES клеток. Агрегация или инъекция ES клеток в др. дикого типа тетраплидные эмбрионы используются многими в одном и том же типе экспериментов. Это используется и для продукции мутантных эмбрионов непосредственно из ES клеток для анализа их мутантного фенотипа без генерации животных с помощью скрещиваний химер по зародышевой линии. Эта стратегия особенно пригодна в случае гетерозиготных эмбриональных леталей Vegf аллеля. Продукция 4n:Es клеточных химер позволяыет анализировать эмбриональные дефекты как у гетерозиготных, так и гомозиготных мутантных эмбрионов без использования условных аллелей (Carmellet et al., 1996, 1997). Хотя большинство мутаций не отягощено гетерозиготной летальностью, др. преимущество этого подхода заключается в быстрой оценке эмбрионального фенотипа и в неограниченной продукции мутантов без разведения. Возможно также увкорение традиционного процесса разведения с тетраплоидными эмбрионами, путём создаения химер из прицельно изменённой ES линии, которая спонтанно потеряла Y хромосому. Т.к. Х0 самки жизнеспособны и фертильны, то получемые химеры с помощью этой техники м.б. скрещены с нормальными самцовыми химерами из той же самой targeted (XY) ES линии для более быстрой продукции гомозиготного мутантного потомства (Eggan et al., 2002).

ICM агрегация сходна с агрегацией с ES клетками, В этом случае ICMs выращивают как и на первой ступени изоляции ES клеток. Затем они дизагрегируются с помощью протеаз и комбинируются непосредственно с тетраплоидными эмбрионами. Это создаёт популяцию клеток с гетерогенными эмбриональнымит онтогенетическими потенциалами, включая субнаборы плюритотентных ES-подобных клеток. Это первоначально использовали в качестве контроля для оригинальных исследовний, осуществляемых с помошью 4n:ES агрегационных химер. 4n:ICM клеточные агрегаты продуцируют больший процент здоровых новорожеденных, чем 4n:ES клеточные химеры (Nagy et al., 1990). Эти различия в жизнеспособности м.б. показателем того, что зддоровые химеры, продуцируемые с помошью агрегации скорее всего обуслвоены различиями в донорских клетках скоере, чем проблемами техники агрегации (Nagy and Rossant, 2001). Недавно этот тип химер был получен, чтобы показать. что низкая жизнеспособность эмбрионов, клонируемых с помощью трансплантаций ядер не только связана с неспособностью клонируемой трфэктодермы, но и с субоптимальным онтогенетическим потенциалом ICM (Amano et al., 2002).

Tetraploid Development in the MouseG.S. Eakin, R.R.BehringerDev.Dyn. V. 228, No 4, P. 751-766, 2003

Tetraploid Development in the Mouse
G.S. Eakin, R.R.Behringer
Dev.Dyn. V. 228, No 4, P. 751-766, 2003