Посещений:
Развитие Лёгочной Энтодермы: Трансдетерминация

Роль Сигналов Wnt

Hyperactive Wnt signaling changes the developmental potential of embryonic lung endoderm
Tadashi Okubo , Brigid LM Hogan
Journal of Biology 2004, 3:11     doi:10.1186/jbiol3

The electronic version of this article is the complete one and can be found online at: http://jbiol.com/content/3/3/11

Studies in many model systems have shown that canonical signaling through the pathway downstream of ligands of the Wnt family can regulate multiple steps in organogenesis, including cell proliferation, differentiation, and lineage specification. In addition, misexpression of the Wnt-family member Wingless in Drosophila imaginal disc cells can lead to transdetermination of progenitors from one lineage to another. Conditional deletion of the β-catenin component of the Wnt signaling pathway has indicated a role for Wnt signaling in mouse lung endoderm development. The full range of effects of this pathway, which includes the transcription factor Lef1, has not been explored, however.

Results

To explore this issue, we expressed a constitutively active β-catenin-Lef1 fusion protein in transgenic embryos using a lung-endoderm-specific promoter from the surfactant protein C gene. Transgenic lungs appeared grossly normal, but internally they contained highly proliferative, cuboidal epithelium lacking fully differentiated lung cell types. Unexpectedly, microarray analysis and in situ hybridization revealed a mosaic of cells expressing marker genes characteristic of intestinal Paneth and goblet cells and other non-lung secretory cell types. In addition, there was strong ectopic expression of genes such as Cdx1 and Atoh1 that normally regulate gut development and early allocation of cells to intestinal secretory lineages.

Conclusions

Our results show that hyperactive Wnt signaling in lung progenitors expressing a lung-specific gene can induce a dramatic switch in lineage commitment and the generation of intestinal cell types. We discuss the relevance of our findings to the poorly understood pathological condition of intestinal metaplasia in humans.


(Рис.1.)  |  Expression of β-galactosidase in TOPGAL embryos shows dynamic changes in Wnt signaling during lung development


(Рис.2.)  |  Expression of TCF/LEF-family genes in E11.5 lung endoderm


(Рис.3.)  |  The morphology and phenotype of transgenic lungs


(Рис.4.)  |  Down-regulation of lung epithelial differentiation markers


(Рис.5.)  |  Comparative expression of selected genes in transgenic and wild-type lungs and different endodermal organs


(Рис.6.)  |  Localization by in situ hybridization of cells expressing non-lung-specific marker genes


(Рис.7.)  |  Co-localization of transcripts for Atoh1 and SftpC in epithelial cells of transgenic lungs


Табл.1 Selected genes up- or down-regulated in transgenic lungs

Additional data file 1
 Figures S1-S4. Figure S1, showing the early expression of the SftpC promoter in distal lung buds, using an SftpC-Cre transgenic line crossed with the Rosa26R reporter line; Figure S2, showing quantitation of BrdU incorporation in wild-type and transgenic lungs; Figure S3, showing in situ hybridization for SftpC, cryptdin6, and Dcpp in transgenic lungs; and Figure S4, showing in situ hybridization for SftpC and Atoh1.

Additional data file 2
 All raw data from the Affymetrix array experiments

Additional data file 3
 A list of down-regulated genes

Additional data file 4
 A list of up-regulated genes

Развитие органов, таких, как лёгкие, поджелудочная железа и кишечник проходит несколько отдельных стадий, каждая из которых координируется с помощью набора законсервированных внутриклеточных сигнальных путей. Первоначально возникает зачаток органа внутри большого эмбрионального поля. Это сопровождается пролиферацией клеток предшественников, их подразделением на разные клоны, клеточной дифференцировкой и секвестрацией орган-специфических стволовых клеток в отдельных нишах. У взрослых эти стволовые клетки дают новых предшественников, которые дают новых предшественников, которые обычно дифференцируются с помощью того же самого пути ткане-специфического клонирования. Случайно, однако, м. происходить процесс, известный как метаплазия, обычно в ответ на локальное воспаление или повреждение. В этих условиях возникают типы клеток, специфичные для разных органов in situ. Хорошо известным примером у людей является Barrett's esophagus, в котором эпителиальные типы клеток, характерные для тонкого кишечника дифференцируются эктопически в нижних отделах пищевода [1,2]. Несмотря на медицинское значение этого и др. метапластических отклонений мало известно о лежащих в основе механизмах и о том, вовлекаются ли при этом изменения в спецификации клонов предшественников и/или стволовых клеток в результате трансдетерминации. Необходимо знание путей, регулирующих детерминацию нормальных клонов и дифференцировку эмбрионального эпителия, происходящего из энтодермы передней кишки [3,4].
Одним из внутриклеточных сигнальных путей, который вовлекается во многие стадии развития органов как у позвоночных, так и беспозвоночных является канонически путь передачи сигналов Wnt. Инициируемый в результате взаимодействия между внеклеточными Wnt лигандами и их рецепторами, этот путь достигает наивысшей точки в стабилизации β-catenin, который затем взаимодействует с ядерными T-cell factor/lymphoid enhancer factor (TCF/LEF) транскрипционными факторами, чтобы модулировать активность генов мишеней [5]. В развитии Drosophila development в зависимости от клеточного содержимого Wnt гомолог Wingless (Wg) м. регулировать клеточную пролиферацию, формирование эмбрионального паттерна и/или дифференцировку. Wg м. управлять трансдетерминацией клеток имагинальных дисков третьего личиночного возраста (см. [6]). Напр., эктопическая экспрессия Wg в ножных имагинальных дисках индуцирует в субнаборе пролиферирующих клеток, которые ко-экспрессируют компоненты и факторы компетентности др. сигнального пути, экспрессию генов-селекторов, специфичных для предшественников крылового имагинального диска.
Исследования эмбрионов позвоночных идентифицировали множественные роли у компонентов канонического Wnt пути в развитии органов. Напр., в тонком кишечнике Tcf4 необходим для быстрой пролиферации эмбрионального эпителия между ворсинками, который даёт крипты [7]. Они содержат стволовые клетки в кишечнике взрослых, которые генерируют предшественников основных типов эпителиальных клеток. Клональный выбор среди этих предшественников, как полагают, базируется на Notch/Delta пути и экспрессии т.наз. нейрогенных basic helix-loop-helix (bHLH) генов. Клетки, транскрибирующие высокие уровни Notch и Hes1 дают энтероциты, тогда как производные клеток, которые экспрессируют высокие уровни Delta и bHLH ген Atoh1 (Math1) , поддерживают свои опции (options) открытыми и подвергаются дальнейшим раундам клонального ограничения, чтобы дать клоны секреторных клеток (Paneth, goblet и нейроэндокринных клеток) [8]. Блокирование передачи сигналов Wnt в кишечнике ингибирует и клеточную пролиферацию и генерацию секреторных клеток [7,9]. Этот аномальный фенотип сопровождается подавлением активности Atoh1 (Math1), что согласуется с фенотипом Atoh1-нулевых мышей, которые также лишены всех секреторных клеточных клонов в кишечнике [8].
Значительно меньше известно о передаче сигналов Wnt или о подразделении клонов в эмбриональных лёгких. Этот орган возникает на вентральной стенке трубки передней кишки между тимусом и желудком. Трахеи и первичные бронхи развиваются путём отделения от будущего пищевода, тогда как остальная часть респираторного древа развивается из двух небольших вентролатеральных почек (см. [10,11]). Эти почки быстро пролиферируют и подвергаются повторяющимся ветвлениям, чтобы создать древо эпителиальных трубок всё уменьшающегося диаметра. Эпителий в крупных, более проксимальных трубках дифференцируется в несколько типов специализированных клеток (реснитчатые клетки, различные субнаборы секреторных Clara клеток и лёгочные нейроэндокринные клетки). Эпителий более мелких, периферических трубок, которые появляются к концу беременности даёт дистальные альвеолярные типы клеток - клетки типа I и типа II. Генетические исследования пролили некоторый свет на механизм, лежащий в основе клональной диверсификации (diversification). Напр., как и в кишечнике, bHLH ген Ascl1 (Mash1) необходим для развития лёгочных нейроэндокринных клеток, тогда как Hes1 , по-видимому, способствует формированию не-нейроэндокринных клонов [12,13]. Однако, Atoh1 (Math1) не экспрессируется во время развития лёгких ([8] и наши неопубликованные наблюдения) и неизвестно, что регулирует генерацию реснитчатых, Clara и mucus-продуцирующих клеток.
В отношении сигнальной системы Wnt ряд Wnt лигандов и рецепторов экспрессируется динамично во время развития лёгких [14]. Напр., Wnt7b транскрибируется в дистальной энтодерме во время морфогенеза ветвления, тогда как Wnt2 экспрессируется в соседней мезодерме ([15] и наши неопубликованные наблюдения). Транскрипционные факторы из семейства TCF/LEF также экспрессируются в развивающихся лёгких, и в энтодерме и мезодерме [14]. Хотя подслизистые железы, которые возникают из эпителиальных клеток в трахее и главных бронхах, отсутствуют у Lef1-/- мышей, респираторная часть лёгких развивается нормально, указывая тем самым, что др. факторы м. компенсировать отсутствие Lef1 [16]. Недавно была предпринята попытка удалять β-catenin из эпителия в разное время развития лёгких [17]. Хотя белок β-catenin персистирует некоторое время, его в конечном счёте деплеция вызывает драматическое подавление количества дифференцированных дистальных альвеолярных эпителиальных клеток в лёгких перед рождением и увеличивает пропорцию проксимальных ресничатых и Clara клеток.
Эксперименты, описанные здесь были первоначально предназначены для выяснения функции Wnt в развитии лёгких с использованием комплементарных подходов пути избыточной экспрессии. Мы использовали тот же самый специфический для эпителиальных лёгочных клеток промотор что и Mucenski et al. [17]; он активен с момента первого появления первичных зачатков. Мы использовали активированный β-catenin-Lef1 слитый белок, который ранее использовался для восстановления эмбриональной экспрессии Wnt3a-нулевых мутантных мышей [18]. Мы установили, что трансгенные лёгкие выглядят в основном нормальными, но содержат быстро пролиферирующий эпителий и относительную бедность полностью дифференцированных легочных типов клеток. Неожиданно использование Affymetrix array анализа для изучения экспрессии генов выявил очень высокие уровни экспрессии множественных генов, обычно характерных для кишечных эпителиальных секреторных типов клеток (тонкого кишечника, двенадцатиперстной кишки и желудка). Эта находка была подтверждена гибридизацией in situ . Кроме того, трансгенный эпителий эктопически экспрессировал гены, такие как Cdx1, которые регулируют развитие кишечника, и Atoh1, который необходим для детерминации секреторного клона кишечника. Эти результаты показывают, что онтогенетическая судьба клеток ранних лёгочных предшественников м.б. переключена in vivo на судьбу кишки/кишечника за счёт увеличенной и/или более продолжительной передачи сигналов Wnt.

Evidence for active Wnt signaling in the epithelium of the developing lung and gut


Т.к. нет доступной информации о локализации передачи сигналов Wnt в развивающихся лёгких, то мы сначала анализировали эмбрионов TOPGAL reporter линии мышей, у которых активность LacZ регулируется с помощью множественных сайтов связывания TCF/LEF, сцепленных с минимальным c-fos промотором (TCF/LEF оптимальный промотор) [19] (Рис. 1). На эмбриональный день 9.5 (E9.5), позитивные клетки обнаруживались в вентральной энтодерме передней кишки, в области будущей трахеи и в зарождающихся зачатках лёгких. На E11.5-E12.5 наивысшая экспрессия в лёгких наблюдалась в дистальной энтодерме с наиболее сильными LacZ окрашиванием в некоторых клетках по сравнению с др. (Рис. 1). Этот паттерн активности ассоциирует с локализацией ядерного β-catenin (Рис. 1f). LacZ окрашивание обнаруживается также в это время в дорсальном эпителии трахеи и в пищеводе и желудке (Рис. 1 and data not shown). На E15.5, TOPGAL активность снижается в периферических лёгочных трубках, но сохраняется повышенной в более проксимальной энтодерме. Экспрессия продолжается в этой популяции и на E18.5, но на постнатальный день 15 она ограничивается небольшим кластером эпителиальных клеток в бронхах и бронхиолах.
Ранее было показано, что некоторые TCF/LEF белки экспрессируются в легочной энтодерме в раннем развитии [14]. Чтобы подтвердить эти находки, мы предприняли reverse-transcription-coupled (RT)-PCR, используя РНК, экстрагированную из E11.5 дистальной и проксимальной энтодермы и освобожденную от мезодермы. Как показано на Рис. 2a, β-catenin экспрессируется в обеих популяциях клеток, тогда как Tcf1, Tcf4, и Lef1 транскрипты обнаруживаются на высоких уровнях в дистальных скорее, чем в проксимальных отделах, хотя их точные уровни экспрессии невозможно определить количественно данной техникой. Иммуногистохимия с антителами к Lef1 подтвердила локализацию белка в дистальном эпителии лёгких на ст. E14.5 (Рис. 2b-d).

Hyperactive Wnt signaling in the distal endoderm of transgenic lungs leads to a severely abnormal phenotype


Чтобы выяснить роль передачи сигналов Wnt в лёгочной энтодерме, мы экспрессировали конституитивно активный amino-terminal-deleted-β-catenin-Lef1 слитый белок (CatCLef1) [20] в эпителии, используя в 3.7 kilobase человеческий промотор гена surfactant protein C (SftpC) [21]. Слитый белок CatCLef1 функционирует in vitro как активатор транскрипции и чётко нормализует аномальный фенотип хвоста у Wnt3a-нулевых эмбрионов мышей [18]. Промотор SftpC управляет экспрессией трансгена специфически в легочной энтодерме, сначала в клетках предшественников первичных зачатков лёгких, но не трахей, а позднее высокие уровни обнаруживаются в альвеолярных клетках type II и в их предшественниках. Ранняя экспрессия промотора в дистальной части лёгочных почек подтверждает наши данные, полученные на SftpC-Cre трансгенной линии, скрещенной с Rosa26R reporter линией (см. Additional data file 1, Figure S1).
Все 7 SftpC-CatCLef1 трансгенных E18.5 лёгких обнаруживали и аномальный фенотип и экспрессию трансгена (Рис. 3). Внешне трансгенные лёгкие выглядят нормально, правда несколько меньше с хорошо сформированными трахеями, с двумя основными системами бронхов и обычным количеством долей. Внутренне, однако, немногие большого калибра бронхиальные трубки открываются непосредственно в большие мешки, выстланные простым кубическим или столбчатым эпителием. Не видно морфологически дифференцированных альвеолярных клеток type II, обычно характеризующихся наличием ламеллярных телец, или ослабленных клеток type I соседствующих с капиллярными сосудами при transmission electron microscopy (not shown); большинство трансгенных кубических или цилиндрических эпителиальных клеток имело крупные цитоплазматические скопления из гликогена (Рис. 3m). Этот в основном аномальный фенотип рассматривается как несовместимый с постнатальным выживанием, т.к. ни одного детёныша не появилось на свет. In vivo мечение E18.5 лёгких 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) в течение 1 ч. выявило множество пролиферирующих клеток по всему трансгенному эпителию (Рис. 3h,i). Кроме того, более чем 10 раз более высокая пролиферация определена в бронхиальном эпителии трансгенных лёгких (Рис. 3h,i, и Additional data file 1, Figure S2). Не обнаружено очевидных признаков аномальной клеточной гибели.
Затем мы локализовали экспрессию генов, характерных для основноdys[ типов клеток лёгочного эпителия. Присутствие в лёгких дикого типа многочисленных дифференцированных клеток type II с типичной округлой морфологией подтверждено с помощью гибридизации in situ с зондом для StpfC РНК и иммуногистохимией для Pro-SftpC белка (Рис. 4 , Рис. 7). Трансгенные лёгкие обнаруживают также высокие уровни экспрессии SftpC и в периферическом эпителии и во внутренних участках клеток. Клетки, которые реагируют позитивно на окрашивание Pro-SftpC антителами, были скорее кубическими, чем округлыми, однако, подтверждено, что они являются незрелыми клетками type II cells (Рис. 4 и Рис. 7). Если бронхи примерно того же самого диаметра сравнивали в отношении экспрессии secretoglobin (Scgb1a1 или Cc10), маркёра для клеток Clara и Foxj1, маркёра для реснитчатых клеток, то безусловно было меньше клеток Clara в трансгенном эпителии, чем у дикго типа. Срезы, окарашенные антителами к ?-calcitonin/calcitonin-related polypeptide (Calca or Cgrp), обнаруживали меньше кластеров диффренцированных легочных нейроэпителиальных клеток и в дикого типа и в трансгенном бронхиальном эпителии, но количества были настолько малы чтобы провести надежное сравнение на этом уровне анализа.
Всё это демонстрирует, что неправильная экспрессия CatCLef1 в эмбриональном лёгочном эпителии ведет к накоплению пролиферирующих эпителиальных клеток, которые не экспрессируют морфологических или молекулярных признаков дифференцированных легочных эпителиальных клонов. Полностью дифференцированные альвеолярные клетки type II и type I отсутствуют, а относительные количества клеток, экспрессирующих маркёры бронхиальных клонов (реснитчатые и Clara клетки) снижены.

Microarray analysis of gene expression in wild-type and transgenic lungs


Чтобы выяснить побольше о фенотипе SftpC-CatCLef1 лёгких мы анализировали экспрессию генов, используя мышиный MOE430 Affymetrix microarray набор. РНК выделялась из каудально доли (энтодерма и мезодерма) трёх разных трансгенных и дикого типа лёгких. Всего выявлено 1,089 генов, которые обнаруживали более чем двукратное отклонение в экспрессии у трансгенных и контрольных мышей с p значением менее 0.05 (up-regulated, 513; down-regulated, 576). Они были распределены по разным функциональным группам, некоторые показаны в Табл. 1. (Данные целиком на нашем website [22] или в Additional data files 2-4 ).
в соответствии с морфологическими находками, klfyyst по микромассивам показывают, что гены, характерные для дифференцированных легочных клеток, заметно подавлены (Табл. 1). Напр., aquaporin 5, маркёр альвеолярных клеток type I, был снижен в 96 раз, а гены, кодирующие сурфактантные белки (SftpA, SftpD и StfpB) и лизозим, обычно экспрессируемые на высоких уровнях в клетках type II, были снижены в 10- и 30 раз. Транскрипты для Scgb1a1 и Foxj1 были подавлены с 5 и 2.3 раза, соотв., подтверждая соотв. данные гибридизации in situ (Рис. 4).
Напротив, гены, ассоциирующие с высокими скоростями клеточной пролиферации и метаболизма усиливали свою активность: напр., cyclinD2, cyclinD1, Brca1 и Rbl1, cdk4, 3-phosphoglycerate dehydrogenase (Phgdh), Myc гены (c-Myc, N-Myc and L-Myc), insulin-like growth factor binding protein 2 (Igfbp2) и eukaryotic translation initiation factor 2 (Eif2s3y). Не выявлено достоверных изменений в уровнях РНК для SftpC, который экспрессируется не только в зрелых клетках type II, но также в клетках легочных предшественников.
Ряд наиболее высоко up- и down-регулируемых генов был проанализирован с помощью RT-PCR, используя РНК из двух трансгенных и двух дикого типа линий E18.5 лёгких. Как показано на Рис. 5, эта техника подтверждает дифференциальную экспрессию, выявленную с микромассивами.

Increased expression in transgenic lungs of genes associated with other endodermal cell lineages


Поразительным свойством данных по микромассивам была высокая экспрессия в трансгенных лёгких генов, обычно ассоциированных со спецификацией и дифференцировкой клонов секреторных клонов кишки/кишечника. В частности, выявлены очень высокие абсолютные уровни транскриптов, характерных для Paneth клеток, обычно локализующихся в основании крипт тонкого кишечника и отсутствующих в лёгких.[23,24]. Гены, ассоциированные с Paneth клетками, включают ?-defensin-related cryptdin гены (усиливающие свою активность в 3.4- и 844 раз, в зависимости от определенного гена), guanylate cyclase activator 2 (Guca2; в 322 раз), Spink4 (100-кратно), matrix metalloproteinase 7 (MMP7; 9-кратно) и Pla2g2e (8-кратно; Табл. 1). Кроме того, ген, кодирующий trefoil factor 3 (Tff3), который первоначально экспрессируется на ст. E14.5 в желудке и кишечнике и на высоких уровнях постнатально в goblet клетках кишечника (Рис. 6), увеличивал активность в 12 раз. 2 др. гена, обычно не встречаемых в лёгких, но транскрибируемых в др. тканях: ectodermal-neural cortex 1 (Enc1; 4-кратно) в кишечных криптах; и Sprr2a (34 раз) в желудке, двенадцатиперстной кишке и кишечнике [25] (Рис. 5). Также усиливал свою активность субнабор генов, обычно экспрессирующихся в нейроэндокринных клетках: neuropeptide Y (Npy; 7.2 раз) и calcitonin-related polypeptide α (Calca; известный также как Cgrp; 5-кратно).
Усиление активности не ограничивалось генами, характерными для энтодермы кишечника. Напр., ген Dcpp, кодирующий demilune cell and parotid белок, был очень активным в трансгенных лёгких (285-кратное изменение). Dcpp , как известно, активен в подъязычных и слюнных железах, которые не являются энтодермального происхождения. Мы показали (Рис.5,6), что РНК также локализуется в подслизистых железах, возникающих из проксимального трахейного эпителия мышей.
В дополнение к маркёрам дифференцированных клеток, данные микромассива также выявили усиление активности генов, кодирующих нейрогенный (bHLH) и др. транскрипц3ионные факторы, которые играют критическую роль в ранних процессах спецификации клонов в кишке (Табл. 1). Из них, Atoh1, который обычно активен в клетках предшественниках кишечника, необходим для генерации секреторных клеточных клонов и негативно регулируется с помощью Hes1 и Notch [8,26]. Предыдущие исследования оказались неспособными выявить существенную экспрессию Atoh1 в нормальных лёгких взрослых [8] и это было подтверждено с помощью RT-PCR на разних стадиях развития лёгких и с помощью гибридизации in situ (Рис. 5,7). Gfi1 кодирует zinc-finger транскрипционный фактор, который действует ниже Atoh1 во внутреннем ухе и экспрессируется в предшественниках нейроэндокринных клеток и кишки и лёгких [27]. В отношении сигнального пути Delta/Notch данные по микромассиву выявили высокие уровни активности Ascl1 и NeuroD4 в трансгенных лёгких по сравнению с контролем (6.1- и 5.2 раз, соотв.), повышенные уровни (16.7 раз) экспрессии Delta-like 3 (Dll3). Не выявлено изменений в экспрессии генов Notch или bHLH генов Hes1-Hes6 (hairy and enhancer of split), однако, те, которые расположены иерархически ниже Notch, хотя и родственные гены, Hey1 (hairy and enhancer of split related with YRPW motif 1) усиливают свою активность вдвое.
Уровни Lef1 РНК были примерно в 58 раз выше в трансгенных, по сравнению с контрольными лёгкими (Табл. 1). Учитывая, что транскрипты β-catenin-Lef1 с трансгена (показано с помощью RT-PCR на Рис. 5) как предполагалось д. перекрёстно гибридизироваться с зондом Lef1 , то это позволяет нам грубо оценить уровень усиления активности сигнального пути Wnt в трансгенных лёгких.
Наконец, мы изучали экспрессию Cdx1, caudal-type гомеодоменовый ген. Cdx1 обычно экспрессируется в двенадцатиперстной кишке и кишечнике, он является непосредственной мишенью передачи сигналов Wnt в пролиферативном компартменте кишечника и отсутствует у Tcf4-мутантных эмбрионов [28]. Усиление экспрессии этого гена, наблюдаемое с помощью Affymetrix array не было статистически достоверным. Как показано на Рис. 5 (and data not shown), однако, RT-PCR предоставляет чёткие доказательства усиления активности Cdx1 в трёх независимых трансгенных лёгких.

Spatial expression of genes characteristic of intestinal epithelial lineages


Затем мы изучали распределение up-regulated РНК с помощью in situ гибридизации. Как показано на Рис. 6, defensin-related cryptdin 6 (Defcr6, известный также как cryptdin6) высоко экспрессируется в индивидуальных или небольших группах клеток, разбросанных по всему эпителию. Этот паттерн напоминает распрделение Paneth клеток в трансгенном кишечнике, в котором пространственная сегрегация крипт от ворсинок нарушена в отсутствие EphB и EphrinB [29]. Транскрипты Tff3 (trefoil factor 3), Dcpp (demilune cell and parotid protein) и Dll3 (Delta-like 3) генов обнаруживают сходное showed испещрённое распределение, но с меньшим количеством позитивных клеток по сравнению с cryptdin6. В результате анализа соседних срезов в 7 µm (Рис. 6 и Additional data file 1, Figure S3) становится очевидным, что клетки, экспрессирующие высокие уровни SftpC (и , следовательно, высокие уровни трансгена) не ко-локализуются с клетками, экспрессирующими Dcpp или cryptdin6. Напротив, Atoh1 обнаруживает более широкий паттерн экспрессии и транскрипты широко распределены в трансгенном эпителии (Рис. 7). Чтобы проверить гипотезу, что Atoh1 усиливает свою активность в клетках, которые экспрессируют трансген, использовали двойную флюоресцентную in situ гибридизацию, используя зонды для Atoh1 и SftpC. Как показано на Рис. 7, некоторые из клеток, экспрессирующие SftpC экспрессируют также Atoh1, но Atoh1 транскрибируется также в клетках негативных по SftpC РНК. Сходное заключение достигнуто и при анализе соседних 5 µm срезов с использование радиоактивной in situ гибридизации (Additional data file 1, Figure S4).

Discussion




Wnt signaling and cell proliferation and differentiation in the embryonic lung


Полученные результаты предоставляют строгие доказательства того, что передача сигналов Wnt позитивно регулирует эпителиальную пролиферацию в лёгких, так как она это делает в кишечнике. Это следует из высокой скорости включения BrdU в трансгенные лёгкие на ст. E18.5, т.е. во время, когда клеточные деления обычно снижаются, и из усиление активности генов, ассоциированных с ходом клеточного цикла (Табл. 1). Некоторые из этих генов, напр., cyclinD1 и c-Myc, являются непосредственными мишенями для передач сигналов Wnt [5]. Мы не м. исключить возможности, что частично повышенная пролиферация трансгенного эпителия, обнаруживаемая на ст. E18.5 обусловлена действием пептидов ростовых факторов - таких как parathyroid-hormone-like peptide, transforming growth factor-? (TGF-?), bone morphogenetic protein 2 (BMP2), insulin-like growth factor 1 (IGF1) or fibroblast growth factor 2 (FGF2) - и/или различных лигандов хемокиновых рецепторов, котороые были выявлены при анализе микромассивов, они также экспрессируются на повышенных уровнях в трансгенных лёгких. Это условие открывает возможность того, что избыточная пролиферация метапластического эпителия в повреждениях у людей управляется частично с помощью пролиферативных сигналов, которые являются вторичными по отношению локальной неправильной экспрессии одиночного сигнального пути.
Наши результаты показывают, что высокие уровни передачи сигналов Wnt в лёгочном эпителии ингибируют окончательную дифференцировку специфичных для лёгких эпителиальных типов клеток, как свидетельствует клеточная морфология и экспрессия генов. Кроме того, паттерн экспрессии TOPGAL, который мы наблюдали, подтверждает модель, согласно которой передача сигналов Wnt обычно способствует пролиферации и/или поддержанию мультипотентных клеток легочных предшественников, заключение, согласующееся с недавними исследованиями, в которых предача сигналов Wnt была ингибирована в эпителиальных клетках лёгких с помощью условной делеции гена β-catenin [17]. Во время большей части pseudoglandular стадии активность TOPGAL наивысшая в недифференцированных, мультипотентных и быстро пролиферирующих клетках дистального эпителия. На ст. E15.5, активность снижается в дистальных канальцах, которые будут генерировать только альвеолярных предшественников, но остаётся высокой в bronchiolar/bronchial популяциях эпителиальных клеток, которые всё ещё подразделяются на множественные клеточные типы (реснитчатые, нейроэндокринные и Clara клетки). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы охарактеризовать TOPGAL-позитивные bronchiolar клетки постнатальных лёгких и чтобы посмотреть усиливается ли TOPGAL активность в клетках предшественниках, генерируемых из предположительно стволовых клеток взрослых воздушных путей в нормальных и патологических условиях (см. [30-32]).

Transgenic lungs contain multiple intestinal and non-lung secretory cell types


Наиболее неожиданной находкой явилось присутствие, разбросанного повсюду эпителия SftpC-CatCLef1 в трансгенных лёгких, клеток, экспрессирущих гены, характерные для секреторных клеток кишки. Доказательства получены не только на базе данных микромассивов, но и из RT-PCR анализа и in situ гибиридизации срезов от нескольких независимых трансгенных лёгких. Более того, идентификация Paneth клеток достигнута с использованием нескольких независимых маркёров не только ?-defensin-related cryptdins. Хотя уровни транскриптов были относительно высокими (см. данные по микромассиву в Additional data files 2-4), антитела к cryptdins не выявляли этих белков, локализованных в типичных секреторных гранулах в E18.5 трансгенных лёгких (data not shown). В этом нет ничего удивительного, однако, т.к. Paneth клетки в кишечнике обычно не становятся полностью дифференцированными вплоть рождения, поэтому окрашивение антителами на ст. E18.5 кишечника неспособно выявить cryptdin-содержащие гранулы в клетках в основании крипт (данные не показаны; отметим, что трансгенных новорожденных не было). Тот факт, что презумптивные Paneth клетки разбросаны по всему эпителию, согласуется с наблюдениями, что Paneth клетки м. дифференцироваться внутри ворсинок скорее, чем в основании крипт, если организация оси крипта/ворсинка искусственно нарушена изменениями в экспрессии Eph/Ephrin [29]. Эпителий трансгенных лёгких также содержит разбросанные клетки, экспрессирующие trefoil factor 3, характерный для goblet клеток кишечника. Не выявлено очевидного усиления активности генов, типичных для энтероцитов. Единственное объяснение этому заключается в том, что трансгенный эпителий экспрессирует высокие уровни Atoh1, который позитивно регулирует дифференцировку клонов секреторных клеток в кишечнике, но не способствует спецификации абсорбтивных энтероцитов.
Предыдущие исследования показали, что Lef1 необходим мышам для развития подслизистых желез из эпителия трахей [16]. Следовательно, м. ожидать, что сильный эктопический CatCLef1 в первичных зачатках лёгких будет приводить к эктопической дифференцировке подслизистых желез. Мы не м. исключить некоторую дифференцировку в этом направлении, т.к. Dcpp, кодирующий demilune cell and parotid protein, транскрибируется во взрослых подслизистых железах трахей и усиливает свою активность в трансгенных лёгких. Ни ?-defensin-related cryptdins, Tff3, ни Sprr2a не экспрессируются во взрослых подслизистых железах, однако, это ведет к заключению, что множественные кишечник-специфические клоны генерируются в трансгенных лёгких.

Evidence for transdetermination of lung progenitors


Полученные результаты предоставляют строгие доказательства, что высокие уровни активности Wnt пути в эмбриональных клетках предшественниках лёгких, экспрессирующих специфичный для лёгких ген (Sftpc), ведут к генерации кишечных предшественников, которые постепенно дают множественные типы клеток кишечника и кишки. Дистальные клетки лёгочного эпителия, в которых SftpC экспрессируется, уже компетентны отвечать на повышенные уровни передачи сигналов Wnt, т.к. они экспрессируют TOPGAL reporter. Они также трансдуцируют др. межклеточные сигналы, включая те, что из FGF и BMP пути [10,33]. Мы полагаем, что в таком особенном клеточном контексте более высокие, чем в норме уровни β-catenin-Lef1 активруют новые нижестоящие мишени, включая Cdx1, который кодирует гомеодоменовый белок, который обычно экспрессируется в двенадцатиперстной кишке и кишечнике и является ключевым регулятором развития энтодермы средней кишки. Cdx1 один или в комбинации с TCF/LEF факторами м. затем активировать кишечный proneural bHLH ген Atoh1. Эти изменения ведут к трансдетерминации клеток предшественников лёгких в те, что детерминируются в кишечные секреторные клоны. Во внутреннем ухе, Atoh1 регулирует экспрессию гена zinc-finger Gfi1 , который необходим для спецификации определенных клонов эпителиальных клеток [27]. Имеются доказательства, что в кишке м. выполняться сходные взаимоотношения (Huda Zhogbi and Hugo Bellen, personal communication), которые м.б. объяснить усиление активности Gfi1 , наблюдаемое в трансгенных лёгких. Некоторые вариации в уровнях экспрессии в популяции легочных предшественников м. приводить к разным уровням экспрессии CatCLef1 , это в свою очередь вызывает трансдетерминацию в др. клоны помимо кишечных, напр., в подслизистые железы. Одновременно с трансдетерминацией в др. клоны происходит подавление специфичных для лёгких генов, включая SftpC и трансген, управляющий экспрессией CatCLef1 .
Некоторые доказательства, подтверждающие эту модель, схематизированы на Рис. 7i. Во-первых, имеются множественные Cdx1- и TCF/LEF-консенсусы связывающих сайтов на 3' untranslated region (UTR) гена Atoh1 ([34] and data not shown). Во-вторых, Atoh1 экспрессируемый эктопически в клетках, экспрессирующих высокие уровни SftpC (а , следовательно, и трансгена) и в соседних клетках, которые этого не делают.. Последние, по-видимому, являются дочерними клетками, которые подвергаются трансдетерминации и которых активность трансгена подавляется. Это будет проверено в будущем с использование клеточно-автономных клонов, меченных, чтобы проследить их судьбу. Кроме того, будут проведены исследования эффекта временного усиления активности нормального пути передачи сигналов Wnt в клетках лёгких у взрослых, включая презумптивные стволовые клетки воздушных путей и клетки предшественники, генерируемые после тканевого turnover или повреждения. Единственной помехой на пути современной экспреиментальной стратегии является то, что она связана с высоким уровнем экспрессии конституитивно активного β-catenin трансгена. Важно отметить, что трансген скорее всего д.б. подавлен после трансдетерминации. Опухоли лёгких у людей, известные как фетальные аденокарциномы и пульмональные бластомы ассоциированы с активирующими мутациями в гене β-catenin [35], но о глобальной экспрессии гена в этих опухолях не сообщалось.
Наконец, наша модель (Рис. 7i) совместима с рядом недавних сообщений об ассоциации между нарушениями передачи сигналов Wnt и изменениях клеточных клонов в эпидермисе и волосяных фолликулах [36-38]. Кроме того, экспрессия конституитивно активированного β-catenin в секреторных эпителиальных клетках трансгенных молочных желез или простаты [39,40] ведет к избыточной пролиферации и дифференцировке кератиноцитов (сквамозная метаплазия). Это указывает на то, что повышенные уровни Wnt м. способствовать переключению клеточной судьбы на др. нежели кишечную в зависимости от клеточного контекста. Наша модель, т.о., открывает возможность, что повышенная передача сигналов Wnt во взрослых стволовых клетках или клетках предшественников является, по крайней мере, одним из факторов, способствующих кишечной метаплазии у людей, напр., premalignant рак желудка или Barrett's esophagus [1,2]. В этих случаях процесс трансдетерминации м. иметь два компонента. Во-первых, стволовые клетки, индуцированные к пролиферативной реакции в ответ на повторяющиеся воспаления или повреждения. Во-вторых, судьба клеток м.б. изменена в ответ на существенное увеличение экспрессии Wnt лигандов или подавления Wnt антагонистов в мезенхимных клетках, которые заполняют нишу стволовых клеток, снова в ответ на воспаление или тканевые повреждения.

Affymetrix array analysis


Total RNA (10 ?g) was extracted from the caudal lobe of three different wild-type and three different transgenic lungs using RNeasy and assessed for quality with an Agilent Lab-on-a-Chip 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, USA). Hybridization targets (probes for hybridization) were prepared from total RNA according to standard Affymetrix protocols. Briefly, first strand cDNA was synthesized using a T7-linked oligo-dT primer, followed by second strand synthesis. An in vitro transcription reaction was performed to generate the cRNA containing biotinylated UTP and CTP, which was subsequently fragmented chemically at 95°C for 35 min. The fragmented, biotinylated cRNA was hybridized in MES buffer (2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid) containing 0.5 mg/ml acetylated bovine serum albumin to Affymetrix GeneChip Mouse 430A arrays at 45°C for 16 h, according to the Affymetrix protocol [42,43]. Arrays were washed and stained with streptavidin-phycoerythrin (SAPE; Molecular Probes Inc, Eugene, USA). Signal amplification was performed using a biotinylated anti-streptavidin antibody (Vector Laboratories) at 3 ?g/ml. This was followed by a second staining with SAPE. Normal goat IgG (2 mg/ml) was used as a blocking agent.

Measurement data and specifications


Scans were performed with an Affymetrix GeneChip scanner and the expression value for each gene was calculated using the Affymetrix Microarray Analysis Suite (v5.0), computing the expression intensities in 'signal' units defined by the software. Scaling factors were determined for each hybridization based on an arbitrary target intensity of 500. Files containing the computed single intensity value for each probe cell on the arrays (CEL files), files containing experimental and sample information, and files providing the signal intensity values for each probe set, as derived from the Affymetrix Microarray Analysis Suite (v5.0) software (pivot files), can be found on our project web site [22].

Statistical analysis


The analysis of the microarray data obtained from lung tissue of three transgenic and three wild-type embryos from the same litters utilized the signal intensity values generated in the Affymetrix MAS 5.0 software. Analysis was performed in GeneSpring 6.0 [44]. The data were normalized by dividing each measurement by the 50th percentile of all measurements in that sample, and each gene was divided by the median of its measurements in all samples. If the median of the raw value was below ten then each measurement for that gene was divided by ten. The statistically significant differences were determined with an ANOVA analysis. A parametric test, variances not assumed equal (Welch t-test) was performed to identify genes that exhibited significant differences between the wild-type and transgenic samples (p < 0.05).

Note added in proof


We have recently used mice carrying a floxed allele of endogenous β-catenin to generate a stabilized form of β-catenin protein specifically in embryonic lung epithelial cells. This was achieved by crossing Catnblox(ex3)/+ mice [45] with a transgenic line in which Cre recombinase is expressed under the control of the Sftpc promoter. After excision of exon 3 (amino acids 5-80), the single recombined endogenous allele encodes a stabilized protein that can function in conjunction with endogenous TCF/LEF transcription factors. All embryos with a single recombined allele died soon after birth with highly abnormal lungs. Preliminary RT-PCR analysis shows that all lungs express intestinal genes, including Atoh1, Cdx1, Ttf3 and defensin-related cryptdin 4 and defensin-related cryptdin 6, and down-regulation of lung-specific genes. This result suggests that induction of a program of intestinal genes occurs in the developing lung even when the level of activated β-catenin is presumably much lower than in the experiments described in this paper.
Сайт создан в системе uCoz