Hanada, K. et al. Molecular machinery for non-vesicular trafficking of ceramide. Nature426, 803–809 (2003) | | | |
The biosynthesis of lipids involves steps that occur in different intracellular compartments, and the intracellular movement of lipids might also be important in lipid-mediated signalling. However, the intracellular trafficking of lipids remains poorly understood, although it has been suggested to occur by both vesicle-dependent and -independent mechanisms. Now, though, in Nature, Hanada et al. provide new insights by describing a protein that mediates the ATP-dependent transport of ceramide from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi in a vesicle-independent manner.
Ceramide продуцируются в ER и затем транспортируются в Golgi, где они превращаются в sphingomyelin. В линии мутантных клеток LY-A оварий китайского хомячка основной путь транспорта ceramide в Golgi генетически нарушен, при отсутствии дефектов перноса белков ER-to-Golgi. Авт. предприняли эксперименты по функционалному восстановлению, чтобы показать, что белок, который наз. CERT, дефектен в этой линии клеток. CERT человека идентичен сплайс-варианту человеческого (GPBPΔ26).
Клетки LY-A неспособны преваращать ceramide в sphingomyelin. Hanada et al. показали, что этот дефект м.б. устранён с помощью трансфекции этих клеток человеческим CERT или большим сплайс-вариантом GBPB/CERTL. Кроме того, используя флюоресцентный аналог ceramide, они показали, что, как и ожидалось, нарушен перенос ER-to-Golgi ceramide в LY-A клетках, и что он становитсяпочти идентичным тому, что наблдается в клетках дикого типа, когда клетки LY-A трансфицированы человеческим CERT. Далее они показали, что истощение внутриклеточного уровня АТФ нарушает перенос ER-to-Golgi керамидов в клетках дикого типа, LY-A клетках и в LY-A клетках, трансфицированных человеческим CERT. Очевидно, что CERT и CERTL участвуют в АТФ-зависимом транспорте ER-to-Golgi керамидов в LY-A клетках.
CERT содержит phosphoinositide-связывающий (который направляет CERT в Golgi путём связывания phosphatidylinositol-4-phosphate (PtdIns4P)), среднюю область и предполагаемый lipid-transfer-catalysing домен, названный . Авт. показали, что CERT и CERTL м. специфически экстрагировать керамиды из фосфолипидного бислоя START-domain-зависимым способом в бесклеточной системе и что CERT взаимодействует с мембранами ER и специяически экстрагирует керамиды. Далее они показали, что in vitro CERT м. катализировать и специфическую экстракцию керамидов из донорских пузырьков и их перенос к акцепторным пузырькам START-domain-зависимым образом.
Hanada et al. затем установили, что мутация законсервированного глицина в домене PH в CERT ответственна за фенотип LY-A клеток и что эта мутация нарушает распознавание PtdIns4P. Когда они сравнили внутриклеточное распределение CERT и мутантного CERT с помощью их слияния с green fluorescent protein, то они нашли, что мутация нарушает ассоциацию с Golgi. Следовательно, очевидно, что CERT м. ассоциировать с Golgi таким образом, который зависит от распознавания PtdIns4P с помощью его PH домена.
Эта работа т.о. показывает, что CERT обеспечивает ATФ-зависимый ER-to-Golgi перенос керамидов без использования пузырьков. Домен START в CERT специфически распознаёт CERT и катализирует его межмембранный перенос, тогда как домен PH м. направлять CERT в Golgi. Кроме того средняя область CERT содержит ER-обнаруживающий мотив. Авт. полагают, что эта работа "...is the first example of the molecular identification of a specific lipid-sorting factor that operates in the synthesis of membrane phospholipids".