FUNCTION AND REGULATION OF CULLIN–RING UBIQUITIN LIGASES
Matthew D. Petroski, Raymond J. Deshaies Nature Reviews Molecular Cell Biology6, No 1, 9-20 (2005); doi:10.1038/nrm1547
Cullin–RING complexes comprise the largest known class of ubiquitin ligases. Owing to the great diversity of their substrate-receptor subunits, it is possible that there are hundreds of distinct cullin–RING ubiquitin ligases in eukaryotic cells, which establishes these enzymes as key mediators of post-translational protein regulation. In this review, we focus on the composition, regulation and function of cullin–RING ligases, and describe how these enzymes can be characterized by a set of general principles.
Мультисубъединичные , которые собираются на остове, впервые были описаны 7 лет назад1,2. Открытию архетипической cullin–RING ubiquitin ligase — SCFCdc4 — благоприятствовали фундаментальные генетические исследования клеточных делений у Saccharomyces cerevisiae и Caenorhabditis elegans. Модель установленная с помощью м.б. распространена на сверхсемейство , которое выявлено у всех эукариот. Эти энзимы регулируют большой массив клеточных и организменных процессов — от определения глюкозы и репликации ДНК до формирования паттерна конечностей и циркадного ритма.
Хотя существует огромное разнообразие CRLs в смысле их композиции и функции, мы предполагаем. что эти энзимы м.б. охарактеризованы набором общих принципов, которые приложимы к большинству членов сверхсемейства.
Cullin–RING ligases are modular
The cullin family. Клетки человека экспрессируют 7 разных cullins (, , , , , and ), каждый из которых даёт начало (nucleate) мультисубъединичной ubiquitin ligase (Рис. 1). Кроме того, по крайней мере, два др. белка ( субъединица из (APC/C) и p53 cytoplasmic anchor protein ) содержат 'cullin-homology domain'3-5. Хотя APC2 и PARC и обладают ubiquitin-ligase активностью, но они совершенно отличны от др. cullins и не будут здесь рассматриваться. Архетипические CRLs, которые содержат CUL1, названы SCF ubiquitin ligases, тогда как др. CRLs, имеющие отличающийся субъединичный состав, обозначаются др. названиями (Табл. 1).
Cullin–RING ligases have an extended, rigid architecture. Наши знания об архитектуре CRLs получены в результате исслендования межбелковых взаимодействий и сравнения последовательностей, которые были интерпретированы в свете трехмерной (3D) рентгеновской кристаллической структуры (см. online (table)). CUL1 и по преимуществу все остальные cullins искривлённый, довольно ригидный, N-терминальный стебель, который представлен тремя повторами пучка из 5 спиралей (cullin repeat (CR)1–3) и сцеплен с C-терминальным глобулярным доменом6 (Рис. 2). Адаптор соединяется с N-терминальной областью CR1, тогда как zinc-связывающий белок — который известен или как , RBX1 или HRT1 (Refs 7–10; и обозначается 'RING' субъединица) — присоединяется отступя 100 A от и пальцеобразно вставлет себя в С-терминальный глобулярный домен. SKP1 рекрутирует рецепторы субстрата, а RING субъединица рекрутирует ubiquitin-conjugating энзим (E2), чтобы сформировать активный лигазный комплекс. Ригидность N-терминального стержня CUL1 м. сводить вместе E2 и субстрат, что способствует переносу ubiquitin, т.к. мутации, которые увеличивают флексибельность стержня, расстраивают активность SCFin vitro6.
Большое количество доказательств указывает на то, что CRLs возможно обладают общей сходной модулярной архитектурой (Рис. 1). В то время как N-терминальный домен CUL1 подводит субстрат к SCF путём связывания SKP1 адаптора, N-терминальные CUL2 и CUL3 рекрутируют субстраты путём связывания структурно сходными и 'Broad complex, Tramtrack, Bric-a-brac' , соотв. Наиболее сильно законсервированные C-терминальные домены cullins соединяются с RING субъединицей ROC1, за исключением CUL5, который, по-видимому, предпочитает ROC2 (Ref. 8). Однако, несмотря на общее сходство, имеются и вариации. Напр., CUL4A лишен большей части первого CR6, это указывает на то, что его взаимодействие с адпторным белком и относительное расположение между связываемым субстратом и E2 м.б. другим.
Substrate receptors for cullin–RING ligases
Субстраты рекрутируются на N-терминальные домены cullins с помощью рецепторного модуля, который представлен cullin- и субстрат-связывающими доменами. Эти домены м. располагаться в той же самой или отдельной полипептидной цепи. Большое семейство этих рецепторов существенно модулирует разнообразие набора субстратов, которые м. ubiquitylated каждым из CRL.
Substrate receptors are recruited by an adaptor. В каноническом примере CUL1, рецепторы субстрата рекрутируются с помощью адаптерного белка SKP1. SKP1 подразделен на два домена: N-терминальный сегмент, который соединяется с CUL1, и C-терминальная область, которая связывает рецепторов субстрата6,11 (Рис. 1a). N-терминальный сегмент CUL1, который контактирует с SKP1, высоко консервативен среди CUL1 ортологов у разных видов, но не среди др. cullins, это выявляет структурную основу того, как каждый cullin специфически рекрутирует разные наборы субстратов6.
SKP1 взаимодействует избирательно с CUL1 и CUL7 (Refs 12,13). Однако, адаптерные белки, которые используются др. cullins, обнаруживают существенную структурную гомологию с SKP1. Область, связывающая cullin, в elongin C, который связывается с CUL2 и CUL5 (Ref. 14) (Рис. 1b), обнаруживает общую с SKP1 складку, которая впервые была выявлена в 11. Это указывает на то, что BTB-доменовые белки м.б. адаптерами для CRL и сегодня это подтверждено в случае некоторых BTB-доменовых белков. которые соединяются специфически с CUL3 (Refs 15-18) (Рис. 1c).
Хуже всего изучен адаптерный белок, DNA-damage-binding protein-1 (), не родственный SKP1, elongin C или BTB доменам, так что неясно, как он связывает рецепторы субстратов с CUL4A (Refs 19-21). Т.к. DDB1 значительно крупнее, чем SKP1 и elongin C, и это м. компенсировать каким-то образом более короткую длину N-терминальной области стебля CUL4A (Рис. 1d).
Cullin-RING ligases assemble with numerous receptors. Ключевым признаком CRLs является то, что каждый cullin м. собираться с многочисленными рецепторами субстратов, чтобы сформировать ubiquitin ligases, которые обладают общим каталитическим стержнем, но м. рекрутировать разные субстраты. Эти рецепторы обычно содержат N-терминальный домен, который соединяется с адаптером, и С-терминальную область, которая соединяется с субстратом. Известны два отдельных связывающих адаптер домена: 22 связывающие SKP1, который, в свою очередь, связывается с CUL1 и CUL7 (хотя только один F-box белок, FBW8/FBX29, как было установлено, собирается в ансамбль сCUL7); тогда как suppressor of cytokine signalling/elongin-BC () боксы23 соединяются с elongin BC, который, в свою очередь, связывается с CUL2 и CUL5 (Рис. 1a,b). Для CUL3-based ligases, функции адаптера и рецептора субстрата слиты в одиночном полипептиде, который соединяется с CUL3 непосредственно через N-терминальный BTB домен и с субстратом через С-терминальный домен15-18 (Рис. 1c). Рецепторы субстрата, которые рекрутируются на DDB1-CUL4A не имеют общего очевидного мотива21 (Рис. 1d).
Количество F-box, BTB и SOCS/BC-box белков, а , следовательно, и потенциальное число CRLs колеблется (Табл. 2). В то время как S. cerevisiae м. иметь минимум 11 разных комплексов, люди м. иметь сотни. Перед лицом таких довольно варьирующих количеств ключевым вопросом, становится, все ли или большинство из этих белков на самом деле функционируют в качестве рецепторных субъединиц для cullins. Правда. ответ неизвестен. Большинство из F-box белков, которые кодируются в геноме S. cerevisiae, связывают Skp1 in vitro24 и имеются строгие доказательства того, что, по крайней мере, 4 из них представляют ubiquitin ligases, которые специфицируют ubiquitylation физиологических субстратов1,2,10,25-27. Однако, по крайней мере, 2 S. cerevisiae F-box белка28,29 на собираются в комплекс SCF 30. 3D структура SCFSKP2 (Рис. 2) выявляет специфические контакты между CUL1 и F-box из SKP2, так что последовательности в F-box м. влиять на сборку комплексов F-box-SKP1-CUL16. Кажется разумным предположить, что одно и то же предостережение м.б. приложимо к SOCS/BC-box и BTB белкам, особенно учитывая, что BTB домен, по-видимому, имеет и др. функции (Ref. 31).
Существует ли некое простое правило, которое позволило бы нам предсказать, будут ли участвовать F-box, SOCS/BC-box и BTB белки в сборке CRL? Эти белки м. распадаться на две категории - те, которые содержат второй известный домен межбелкового взаимодействия, и те, которые не содержат (Табл. 2). Эти домены включают WD40 повторы, leucine-rich повторы, Kelch домены, CASH домены и цинковые пальчики. Из 4-х S. cerevisiae F-box белков, для которых имеются хорошие доказательства, что они собираются в лигазные комплексы, все они имеют традиционные мотивы межбелковых взаимодействий, которые занимают С-конец F-box. Напротив, оба Ctf13 и Rcy1 - которые не образуют SCF комплексов - лишены таких доменов29,32.
Receptors can form oligomers and are often unstabe. Хотя мы описали CRLs как представляющие собой субстрат связывающие полипептиды, которые сцеплены с cullin посредством адаптерного белка, имеются вариации этой темы. Некоторые рецепторные белки, включая BTB-доменовый белок (Ref. 16) и F-box-белки / и /, м. гомо- и гетеро-олигомеризоваться и за счёт этого м. расширять репертуар субстратов посредством комбинаторного механизма16,33,34. Способность некоторых F-box белков олигомеризоваться м. использоваться для создания доминантно-негативных мутаций35. Однако, SCFβ-TrCP, который состоит из одиночного мономера β-TrCP м. эффективно ubiquitylate пептидный субстрат in vitro36, так что олигомеризация не обязательна для E3 активности. Структура рецепторных олигомеров не известна, т.к. области, которые являются N-терминальными по отношению к F-box, который м. обеспечить сборку, были делетировны из F-box белков, для которых структура была определена11,36,37. Хотя отношение к олигомеризации остаётся неясным, имеются прекрасные доказательства того, что функция F-box белков м.б. обеспечена с помощью неродственных партнёров по связыванию. Напр., активность по связыванию субстрата F-box-белка SKP2 стимулируется сборкой с CKS1 (Refs 38,39). Вторым примером является гетердимерный substrate-receptor комплекс DET1-COP1, который рекрутирует субстрат на DDB1-CUL4A (Ref. 21).
Рецепторы субстратов в CRLs иногда нестабильны, это демонстрируют S. cerevisiae, у которых F-box белки деградируют с периодом полу-жизни 5-30 мин. после сборки с Skp1 (Refs 40,41), то же самое сообщалось для MEL-26 у C. elegans16. Напротив, некоторые рецепторы субстрата млекопитающих стабильны. Особенно впечатляющий пример - SOCS/BC-box белок SOCS1 (Refs 23,42), который стабилизируется с помощью сборки с и C (Ref. 23). Хотя дестабилизация рецепторов субстрата у S. cerevisiae,как полагают. происходит в первую очередь благодаря '', эта простая идея м. оказаться неприложимой к аналогам у млекопитающих. Напр., F-box-белки TOME-1, SKP2 и EMI1 подвергаются обмену с помощью регулируемых путей, которые нуждаются в APC/C (для TOME-1 и SKP2) или в F-box-белке β-TrCP (для EMI1)43-47. Тем не менее autoubiquitylation - которое возможно регулируется с помощью связывания субстрата substrate48 - м.б. важным в поддержании уровня устойчивого состояния некоторых рецепторов49.
Ещё одна вариация темы нестабильности F-box-белков связана с S. cerevisiae Ctf13. F-box в Ctf13 обеспечивает быстрый оборот, когда он слит с обычно стабильным белком32, это указывает на то, что F-box сам м. функционировать как внутренний , сходный с destruction боксом циклина B. Вопрос остаётся открытым, является ли Ctf13 или 'канонический' рецептор, подобный Cdc4 более представительной моделью для размышлений над большим числом 'orphan' F-box белков у Arabidopsis thaliana и C. elegans.
Regulating function without promoting degradation. Хотя большинство белков-мишеней, которые связывают CRL субстратные рецепторы, ubiquitylated в качестве прелюдии к деградации, но протеолиз является не единственным исходом. Напр., ubiquitylation транскрипционного фактора Met4 с помощью SCF ингибирует его способность активировать транскрипцию50. В богатой среде, которая содержит высокие уровни methionine, SCFMet30 собирает на Lys163 в Met4 (Ref. 51). Хотя ubiquitylated Met4 не деградирует он больше не трансактивирует экспрессию генов биосинтеза methionine, а вместо этого способствует экспрессии генов, которые участвуют в биосинтезе S-adenosylmethionine52. Итак, стабильная Lys48-сцепленная polyubiquitin цепь репрограммирует активность Met4 с помощью механизма, который не использует протеолиз.
Lh/ атипические функции CRLs включают процессинг белка Drosophila melanogaster Cubitus interruptus () и человеческого nuclear factor (NF)-κB предшественника p100. Ci подвергается процессингу из 155-kDa транскрипционного фактора (Ci155) в 75-kDa транскрипционный репрессор (Ci75). Генетический анализ показал, что последовательное фосфорилирование Ci155с помощью трёх разных протеин киназ активирует его ubiquitylation с помощью SCF, которое ведет к PROTEASOME-обусловленному образованию Ci75 (Ref. 53). Сходным образом фосфорилирование p100 с помощью ингибитора NF-κB (IκB) kinase (IKK) активрует SCFβ-TrCP-зависимую ubiquitylation, которое вызывает его протеосом-зависимое расщепление, чтобы сформировать зрелую p52 субъединицу NF-κB54.
Недавно сообщалось, что SCFSKP2 способствует активации генов, которые регулируются с помощью транскрипционного фактора Myc55,56. Было предположено, что в короткий интервал времени между ubiquitylation и его деструкцией Myc усиливает свою способность обеспечивать транскрипцию. Доказательства. которые согласуются с этой гипотезой получены для синтетиче кого транскрипционного фактора GAL4-VP16. SCFMet30 способствует как ubiquitylation, так и трансактивирующей способности этого фактора у S. cerevisiae57. Более того, роль SCFMet30 в трансактивации м.б. обойдена с помощью экспрессии GAL4-VP16, который является слитым с ubiquitin.
Substrate receptors have many targets and functions. Хотя остаётся неясным, сколько человеческих F-box, SOCS/BC-box и BTB-доменовых белков образуют ансамбли с cullins, чтобы сформировать ubiquitin ligases, обзор доступной литературы показывает, что более 50 различных CRLs собираются в клетках человека (Табл. 2; см. online (table)). Кроме того, очевидно, что эти лигазы помогают регулировать awe-inspiring набор биологических процессов (Рис. 3). Рецепторы для этих лигаз используются вирусными и бактериальными патогенами, чтобы разрушить нормальные клеточные процессы (см. (table)). О др. физиологических функциях CRLs и о том, как их дисфункция вносит вклад в болезни, см. Refs 58-61.
Post-translational substrate targeting
Почти в каждом случае, который был проверен, субстраты поставлялись на CRLs с помощью ковалентных модификаций. Наблюдается фосфорилирование мишеней многочисленных субстратов для SCF ligases, включая cyclin-dependent kinase (CDK) inhibitor Sic1 для SCF у S. cerevisiae, cyclin E для SCFCDC4 у людей, CDK inhibitor p27 для SCFSKP2 у людей и G1-cyclin Cln2 для SCF у S. cerevisiae (Refs 62-66). Однако, хотя фосфорилирование, по-видимому, является предоминирующим сигналом, однако стержневые олигосахариды, которые имеют высокое содержание mannose, распознаются SCF/FBS1 у людей (Ref. 67), и hydroxyproline epitope on hypoxia-inducible factor-1α (HIF1α) с помощью CUL2-elongin-BC- (von-Hippel-Lindau) комплеса68,69. Известен также, по крайней мере, один случай, при котором пост-трансляционные модификации, по-видимому, не участвуют16-18. Однако, общая потребность, что субстрат д.б. модифицирован перед тем как он будет связан CRLs, имеет, по крайней мере, 4 следствия.
Covalent modifications expand the substrate reperoire. У S. cerevisiae, SCFCdc4 регулирует клеточный цикл, обеспечивая обмен Sic170. Sic1 соединяется и ингибирует S-agpyst cyclin-CDK комплексы, блокируя тем самым репликацию ДНК. Позднее в G1, Sic1 фосфорилируется с помощью G1 cyclin-CDK62, это позволяет ему связаться с SCFCdc4 и стать ubiquitylated1,2. Ubiquitylated Sic1 затем деградирует с помощью протеасом, это даёт активную S-фазную cyclin-CDK и обеспечивает в результате вступление в S фазу62,71. SCFCdc4 также регулирует экспрессию генов, которая обеспечивается с помощью транскрипционного фактора Gcn4 (дрожжевой активатор, который участвует в биосинтезе аминокислот и пуринов; Ref. 72). Ubiquitylation Gcn4 с помощью SCFCdc4 и его последующая деградация нуждаются в фосфорилировании Gcn4 за счёт или Pcl1/2-Pho85 или Srb11-Srb10 cyclin-CDK комплексов72,73. Активность Pcl1/2-Pho85 снижается при аминокислотном голодании, это позволяет Gcn4 накапливаться74. Итак, одиночный ubiquitin-ligase комплекс регулирует отдельные процессы в ответ на разные сигналы (Рис. 4a). То же самое верно и для SCFβ-TrCP у людей, которая ubiquitylates β-catenin в ответ на активность glycogen synthase kinase-3 (GSK3) и IκB в ответ на активность IKK48.
Selective ubiquitylation of a specific substrate pool. CRLs часто не находят всего пула определенного субстрата (Рис. 4b). Напр., ubiquitylation CDK ингибитора Xic1 с помощью SCF в экстрактах яиц Xenopus laevis зависит от replication-origin-licensing factor Cdc6, источник распознающего комплекса и активного cyclin-E-Cdk2. Это указывает на то, что обмен Xic1 пространственно ограничен сайтами, в которых инициируется репликация ДНК75. Др. примером является p27. В то время как ubiquitylation p27 с помощью SCFSKP2 нуждается и в фосфорилировании p27 и его сборке в тримерный комплекс с cyclin-CDK76, но не все cyclin-CDK-p27 комплексы являются субстратами для SCFSKP2 (Ref. 77). Замечательная специфичность CRLs для специфических молекул субстрата имеет важное значение для изучения регулируемого обмена белков.
Generation of 'AND'/'OR' logic gates. Деградация CRL субстратов м.б. связана с сигнальными путями с помощью логических ходов, которые напоминают те, что используются для computation (Рис. 4c). Пример 'AND' входа предоставляется циклином E у людей. Cyclin E д.б. фосфорилирован как на GSK3 'AND' CDK сайтах, чтобы эффективно поставляться на SCFCDC4 (Ref. 78). Сходный принцип контролирует ubiquitylation Ci с помощью SCFSlimb у D. melanogaster (Ref. 53). Напротив, S. cerevisiae Gcn4 предоставляет пример ворот 'OR', т..к. Gcn4 м. поставляются для SCFCdc4-обусловленного ubiquitylation и деградации с помощью или Srb11-Srb10 'OR' Pcl1/2-Pho85 cyclin-CDK комплекса72,73.
Generation of 'nanoswitches'. Фосфорилирование Sic1 на CDK сайтах способствует его связыванию с SCFCdc4, сопровождаемому его ubiquitylation и деградацией. degradation. Даже когда Cdc4 , по-видимому, содержит один высокого сродства сайт связывания phosphopeptide, Sic1 м.б. фосфорилирован по любому 6 из его 9 CDK сайтов, чтобы соединяться эффективно с Cdc4 (Ref. 37). Эта находка рационализирована с помощью математической модели, чтобы показать, что вероятность диссоциированного Sic1 повторно связаться с Cdc4 прежде чем он диффундирует увеличивается экспоненциально с увеличением числа сайтов, которые фосфорилированы79. Термин '' предложен, чтобы описать этот эффект. При условии, что Sic1 фосфорилируется in vivo распределительно, скорость деградации Sic1 д.б. пропорциональна концентрации CDK, увеличиваясь до 6 раз (хотя это еще необходимо показать). Это д. приводить в результате к 'switch-like' элиминации Sic1 т.к. активность CDK формируется во время G1 фазы (Рис. 4d).
Cullin-RING ligases activate ubiquitin transfer
Несмотря на важность CRLs в клеточной регуляции мы очень мало знаем о том, как они работают.
Ubiquitin transfer does not involve a ligase intermediate. открытие субъединицы RING в SCF создало ключ к успеху нашего понимания того, как CRLs и многочисленные RING-based лигазы способствуют ubiquitylation7,8,10,26. Исследования субъединицы RING в SCF показало, что она непосредственно связывается с и активирует E2 . Хотя сама по себе субъединица RING оказывает незначительное влияние на активность CDC34 (хотя см. Refs 80,81 по доказательству, что RING достаточна для активации некоторых E2s), комплекс CUL1-RING мощно активирует CDC34, чтобы полимеризовать свободные цепочки ubiquitin7,8, а также цепочки, которые прикреплены к самой S. cerevisiae10,26. В отличие от ubiquitin ligases, CRLs обеспечивают убиквитилирование без образования ковалентных промежуточных структур с ubiquitin10. Способность CUL1-RING актививровать CDC34 указывает на то, что каталитический стержень д. осуществлять и др. вещи помимо простого сведения CDC34 и субстрата в тесное соприкосновение10.
E2s used by cullin-RING ligases. CRLs м. активировать образование isopeptide-мостиков с помощью, по крайней мере, 4-х разных E2 энзимов. S. cerevisiae Cul1-RING , как полагают, функционирует исключительно с E2 Cdc34 in vivo, хотя он м. оперировать и с др. E2s in vitro24. SCF млекопитающих и др. CRLs м. работать или с CDC34 () или E2s из in vitro82, но остаётся некая неопределенность, верно ли это также и для in vivo. В дополнение к CDC34 и , каталитическая сердцевина cullin-RING рекрутирует также , которая конъюгирует ubiquitin-подобный белок с cullins83. Два аспекта этой кажущейся гибкости в выборе E2 партнера усложняют ситуацию. Во-первых, CDC34 и UBC4/5 принадлежат к самостоятельным E2 подсемействам84, возникает вопрос, работают ли они и регулируются за счёт идентичных механизмов. Во-вторых, даже несмотря на то, что UBC12 очень близок к ubiquitin E2s, он не м. переносить к субстрату, а вместо этого он модифицирует только одиночный Lys в субъединице cullin, которая плохо модифицируется (если вообще) с помощью ubiquitin E2s. Вообще-то UBC12 присоединяется к cullin-RING по иному, чем ubiquitin E2s.
The mechanism of ubiquitin transfer is unknown. Мало известно о том, как CDC34 или UBC4/5 собирают в ансамбль цепочки ubiquitin на субстратах или как они включаются с помощью SCF. Несколько линий доказательств подчеркивают роль олигомеризации для функции Cdc34. Данные по внутригенной комплементации и физическим исследованиям показывают, что Cdc34 олигомеризуется и что олигомеризация использует уникальный С-терминальный хвост85 и образование Cdc34-ubiquitin thioesters, а также пару остатков и acidic петлю, которые не обнаруживаются у UBC4/5 гомологов86. Важно, что мутанты Cdc34, которые не м. олигомеризоваться, неактивны in vivo86. Однако неясно, как Cdc34 олигомеры д. приспосабливаться к 3D архитектуре комплекса SCF.
Уникальное свойство CDC34, которое привлекло существенное внимание, в том, что у него длинный С-терминальный хвост. Этот домен обеспечивает стабильное связывание с SCF (Ref. 87). Однако, простая замена в каталитическом домене E2 Rad6 позволяет ей восстанавливать рост у S. cerevisiae cdc34Δ мутантов88. Итак, хотя это безусловно важно, но функция, которая обеспечивается уникальным хвостом Cdc4 м.ю. обойдена.
Отсутствие знаний относительно того, как SCF активирует перенос ubiquitin на субстрат, заставляет искать помощи в детальных 3D структурных данных, которые доступны для SCF (Рис. 2). Субстрат-связывающие платформы SCFβ-TrCP и SCFCdc4 расположены ~ 50-60 A от предполагаемой локализации E2-ubiquitin-thioester сцепления36,37. Потенциальным решением этой неприятной проблемы служит , согласно которой активированный Cdc34-ubiquitin thioester отсоединяется от SCF и диффундирует до тех пор, пока не столкнётся с остатком Lys субстрата, к которому он переносит ubiquitin89. В подтверждение этого предположения мутации S. cerevisiae Cdc34 (Phe72Val), которые стабилизируют его связывание с SCFCdc4 существенно снижают ubiquitylation субстрата Sic1. Однако, имеется существенное затруднение для этой гипотезы. Напр., будучи высвобожденным из SCF, свободно диффундирующий комплекс Cdc34-ubiquitin д., в большинстве случаев, диффундировать прочь, пока он не столкнётся с субстратом. Чистый эффект д.б. двукратным: неспецифический перенос ubiquitin на невинные побочные белки; и медленное, distributive (non-processive) убиквитилирование субстрата, который связан с SCF. Напротив, SCF является чрезвычайно специфичным и высоко процессивным.
Flexibility in the selection of substrate lysine residues. Исследования с очищенными компонентами показали, что м. сущестовать значительная пластичность в выборе остатков Lys субстратов с помощью SCF ubiquitin ligases. Этот принцип подкрепляется Sic1, который имеет 3 пары тесно расположенных Lys остатков в своём N-терминальном домене. Любой из этих остатков лизина достаточен, чтобы поддержать быстрое убиквитилирование Sic1 in vitro и деградацию Sic1 in vivo90. Однако. скорость деградации молекул Sic1, несущих цепочки ubiquitin в разных местоположениях, варьирует пятикратно in vitro, это указывает на то, что расположение цепочек убиквитина вносит вклад в эффективность деградации субстрата с помощью протеосом. Остаётся, однако, неясным, как к SCFCdc4 привязанный Sic1 убиквитилируется столь эффективно по столь многим разным остаткам Lys, которые распределены в промежутке из ~50 аминокислот. Анализ др. SCF субстратов (напр., Gcn4, Far1 и p27) в воссозданных системах показал, что эти белки также м.б. модифицированы по нескольким остаткам Lys38,73,91.
В отличие от Sic1, исследования на IκB показали, что ubiquitylation в основном затрагивает два соседних остатка Lys (Lys21 и Lys22), которые располагаются на 9 остатков выше первого phosphoserine, который прикрепляет фосфорилированный IκB to β-TrCP. Систематически варьируя положение ubiquitin-акцепторного сайта в phosphopeptide субстрате, Wu et al.36 показали, что SCFβ-TrCP м. эффективно модифицировать остатки Lys, которые находятся на расстоянии 10, 14, 18 или 22 остатков от phosphoserine, который присоединяет пептид к β-TrCP, хотя пептид с Lys, расположенным на расстоянии 10 остатков, ubiquitylated ~1.3-2.5-раз быстрее. Парадоксально, если этот phosphopeptide является гибкой случайной спиралью, то теория полимеров предсказывает, что средним оптимальным остатком Lys д.б. тот, что расположен ~10 A от точки прикрепления (~40 A от thioester связи в E2) a Lys, который располагается на расстоянии 10 остатков, д. проецироваться только на 32 A в направлении своей мишени, если пептид и Lys боковая цепь находятся в полностью растянутой конформации36. Единственный пептид, для которого убиквитилирование было сильно затруднённым (т.е. оно происходило в 5 раз медленнее), имел Lys на расстоянии 6 аминокислот от degron - расстояние, которое слишком коротко, чтобы связать мостиком щель между E2 и пептид-связывающими сайтами. (Это наблюдение ставит новую загадку для hit-and-run модели, т.к. оно трудно объяснимо, как перемещение Lys акцептора с 10 до 6 остатка выше phosphoserine прикрепления снижает скорость убиквитилирования почти в 8 раз36, если фактически перенос ubiquitin сопровождается диффузией молекулы E2, которая высвобождается из SCF.) Все эти данные по SCFCdc4 и SCFβ-TrCP указывают на то, что ряд сайтов ubiquitylation зависит от влияния архитектуры ligase комплекса, количества независимых degrons, которые привязывают субстрат к лигазе, и количества и относительного положения остатков Lys вблизи этих лигандов. Те же самые факторы, по-видимому, приложимы ко всем CRLs.
Regulation of cullin-RING ligases
В то время как пост-трансляционные модификации и разнообразие рецепторных субъединиц CRLs предопределяют, какой субстрат будет предоставлен для ubiquitylation и если ubiquitylation произойдет, то активность каталитической сердцевины будет далее модифицирована за счёт нескольких регуляторных контролей.
Reversible cycles of NEDD8 attachment and removal. Все cullins, оцененные столь подробно92, м.б. модифицированы с помощью ковалентного прикрепления ubiquitin-подобного белка NEDD8 к законсервированным остаткам Lys в cullin-homology домене93. CUL1 с помощью UBC12 , как известно, не нуждается в NEDD8 ligase, но нуждается в субъединице RING83. Neddylation усиливает CUL1-зависимую активность ubiquitin-ligase in vitro94-96, потенциально, облегчая рекрутирование нагруженных ubiquitin E2s97. Генетические исследования93,98-100 показали, что neddylation является важным для функционирования CUL1, CUL2 и CUL3 in vivo, a NEDD8 и его conjugating энзимы существеннц у многочисленных организмов от Schizosaccharomyces pombe до мышей93,101, с заметным исключением S. cerevisiae102,103. In vivo, обычно только фракция от общего пула cullin белков neddylated, это указывает на то, что вообще только субнабор молекул cullin плностью активен.
NEDD8, который конъюгирует с cullins, отсоединяется (процесс известен как deneddylation) с помощью (CSN)104, и это расщепление обеспечивается с помощью в CSN5 субъединице105, которая специфицирует metalloprotease-подобный активный сайт106,107. CSN регулирует также CRLs с помощью др. механизмов (Ref. 108) - напр., за счёт рекрутирования deubiquitylating энзима UBP12, который противодействует внутренне присущей ubiquitin-polymerizing активности каталитического центра109. Кроме того, CSN субъединицы Csn1 и Csn2 соединяются с и регулируют активность у S. pombe Cul4 с помощью неизвестного механизма110.
Активность NEDD8 и ubiquitin isopeptidase, которая ассоциирует с CSN, указывает на двушаговую атаку на функцию CRL - deneddylating куллина снижает рекрутирование/активацию E2s96,97, тогд как UBP12 метаболизирует ubiquitin цепи, которые собраны в ансамбль с помощью связанной E2109. парадоксально, но генетические исследования показали, что CSN является позитивным регулятором CRLs, т.к. мутации потери функции в субъединицах CSN воспроизводят или усиливают вредные эффекты мутаций в субъединицах CRL99,105,111,112. Итак, динамический цикл NEDD8, который обеспечивается с помощью оппозитных активностей UBC12 и CSN м.б. необходим для поддержания функции CRL (Рис. 5).
Deneddylated cullins are sequestered. (известный также как TIP120A) недавно идентифицирован как взаимодействующий с CUL1 белок113,114. Хотя он первоначально был обнаружен в клетках млекопитающих, предполагаемые ортологи, кодируются и геномами S. pombe, C. elegans, A. thaliana и D. melanogaster113, а близко родственный гомолог (TIP120B/CAND2) обнаружен в геноме человека. S. cerevisiae не экспрессирует CAND1-подобного белка, это подтверждает идею, что существуют важные отличия в регуляции CRLs между видами. Имеется некоторая несогласованность относительно специфичности CAND1, но известно, что он связывает все cullins за исключением CUL7, который не был тестирован113-117.
CAND1 конкурирует с SKP1 за связывание CUL1, и единственный связывается с молекулами CUL1, которые не конъюгированы с NEDD8. Более того, независимо от конъюгации NEDD8 (Ref. 113; хотя см. Ref. 115), или одновременного присутствия SKP1 плюс высокой концентрации ATP114, CAND1 м. отсоединяться от CUL1. Предполагается, что CAND1, NEDD8-conjugating энзим UBC12 и NEDD8-isopeptidase CSN поддерживают активность SCF путём обеспечения циклов сборки и разборки SCF108. В согласии с этой идеей и недавние данные, показавшие, что мутации CAND1 потери функции у A. thaliana обнаруживают фенотип, который напоминает таковой мутантов SCF118-120.
Pseudosubstrates can regulate cullin-RING function. Идентификация heterogeneous nuclear ribonuclear protein U () в качестве ключевого партнёра по связыванию β-TrCP в клетках млекопитающих подкрепляет др. механизм регуляции CRL121. hnRNP U связывает ядерный SCFβ-TrCP в конкуренции с фосфорилированным IκB (который является bona fide субстратом SCFβ-TrCP), хотя и с более низким сродством. Однако, в отличе от фосфорилированного IκB, hnRNP U, который связан с β-TrCP, не убиквитилируется. hnRNP U м. , следовательно, функционировать в качестве 'affinity gate', которые не влияют на связывание с высоким сродством субстрата, такого как IκB, но блокируют неподходящие белки от неспецифического связывания с β-TrCP. Напротив, hnRNP U м. функционировать в качестве экрана, блокирующего ubiquitylation β-TrCP в SCFβ-TrCP комплексах.
RING subunits can contribute to substrate specificity. Метазоа обычно экспрессируют более одного RING белка, которые м. формировать ансамбли с cullins. У D. melanogaster, которая экспрессирует 3, SCFSlimb-зависимый процессинг Ci блокируется у мутантов, которые лишены RING субъединицы Roc1a, тогда как SCFSlimb-зависимый обмен β-catenin (который известен как Armadillo у D. melanogaster) осуществляется нормально80. Разные RING белки м. , следовательно, специфицировать убиквитилирование Armadillo и Ci даже когда оба субстрата используют одну и ту же рецепторную субъединицу. Структура SCF делает мало вероятным, чтобы RING субъединицы контактировали с субстратом непосредственно, но механизм, лежащий в основе этого эффекта неясен.
New frontiers in cullin-RING-ligase research
Are there further regulators? Количество описанных факторов, которые взаимодействуют с или регулируют CRLs, но функция которых неизвестна, растёт. Среди этих факторов находятся S. cerevisiae и млекопитающих Sgt1, D. melanogaster Encore и S. cerevisiae Cic1 и Cdc48 белки. Sgt1 соединяется непосредственно с Skp1 и его активность необходима для поддержания активности SCF in vivo и в лизатах клеток S. cerevisiae122. Т.к. Sgt1 соединяется с Hsp90 (heat-shock protein of 90 kDa), он м. способствовать сборке Skp1-based белковых комплексов123,124. Cdc48 (Ref. 125), Cic1 (Ref. 126) and Encore127, с др. стороны, соединяются с компонентами SCF и протеосом и , следовательно, необходимы для оптимальной деградации - но не для ubiquitylation - специфических SCF субстратов.
Formation of ubiqutin-ligase supercomplexes. Некоторые CRLs, по-видимому, mix-and-match домены и компоненты из др. ubiquitin-ligase путей. Напр., SCF-подобный комплекс, идентифицированный в нейрональных клетках C. elegans м. использовать - крупный белок с многочисленными RING доменами128 - вместо ROC-1/RBX-1/HRT-1. Этот комплекс, который содержит SKP-1, CUL-1 и F-box-белок , м. регулировать стабильность белков, которые участвуют в пресинаптической дифференцировке, таких как рецепторная тирозин киназа ALK. Ещё одним примером высокой комбинационной сложности в сборке CRLs является CUL4-based DCXDET1-COP1 ubiquitin ligase21 и предполагаемый SCF/Parkin ubiquitin-ligase суперкомплекс129. В первом случае, как упоминалось выше, DET1 и COP1 функционируют в качестве гетеродимерных рецепторов субстрата, которые связывают субстратный белок Jun с адапторным белком DDB1, который, в свою очередь, связывает CUL4A-RING. Максимальный обмен Jun с помощью этого пути нуждается в субъединице RING из DCXDET1-COP1 комплекса, но не в RING домене из COP1, даже если RING мотив COP1 обладает ubiquitin-ligase активностью130.
How is ubiquitylation linked to function? Установлено, что обмен данной молекулы субстрата зависит от ее локализации, сборки и состояния модификации помимо др. признаков. Напр., оборот p27 (Ref. 76), cyclin E (Ref. 64) and Xic1 (Ref. 75) регулируется с помощью их связывания с др. молекулами. Большинство примеров касаются событий ubiquitylation, которые связаны со специфическими процессами, такими как экспрессия генов и метаболизм нуклеиновых кислот, учитывая, что многие BTB белки имеют цинковые пальчики и имеются даже F-box белок () с DNA-helicase активностью131. Ещё одной сложностью является то, что разные пулы данного белка м. поставляться избирательно на разные CRLs. Фосфорилированный cyclin E, который соединяется с CDK2 доставляется к SCFCDC4 (Refs 132,133),тогда как cyclin E, который не связан с CDK доставляется к SCFSKP2 (Ref. 134) и к CUL3-based ligase135. Сходным образом, фосфорилированый Jun доставляется к SCFCDC4 (Ref. 136), тогда как DCXDET1-COP1 м. убиквитилировать нефосфорилированный Jun21.
Exploiting cullin-RING ligases for research and therapy. CRLs осуществляют обширный контроль физиологии клеток и организмов и две генеральные стратегии используют эти силы. В первом примере,F-box слит с партнером по взаимодействию для желаемого таргетинга137,138. Измененный F-box белок собираются, чтобы сформировать SCF комплекс, который рекрутирует белок-мишень для ubiquitylation. Химера β-TrCP-E-cadherin рекрутирует цитоплазматический β-catenin (но не связанный с мембраной пул) для ubiquitylation и деградации137. В отличие от традиционных генетических методов этот 'protein-knockdown' подход позволяет индуцируемое элиминирование специфического субнабора молекул белков. Вторая стратегия связана с конструкцией бивалентных молекул (обозначаемых как 'protac'), которые связывают желаемые белки-мишени с CRL. Рrotac, который представлен VHL-связывающим hydroxyproline пептидом из HIF1α, сцепленным с androgen dihydroxytestosterone, поддерживает быстрый и эффективный оборот androgen рецепторов в клетках139. Было бы интересно посмотреть, м. ли protein-knockdown и protac подходы использоваться в качестве общего инструмента для модуляции белковой функции.
Concluding remarks
Since the discovery of SCFCdc4 in 1997, ubiquitin ligases that are based on a cullin–RING catalytic core have moved to centre stage in regulatory biology. This superfamily of enzymes controls a broad spectrum of cellular processes by coupling the destruction of regulatory proteins to intracellular and extracellular signals. The specificity of CRLs, which share a modular organization, can be reprogrammed by exchangeable receptor subunits that recruit substrates to the cullin–RING catalytic core. This enables the assembly of potentially hundreds of different ligase complexes. The structural biology of CRLs is providing key insights into the conserved architecture of this superfamily of enzymes and the chemical basis for their specificity, but has also served to highlight how little we know about how these enzymes work. Recent research has emphasized the importance of a post-translational-modification cycle — neddylation — that might control the dynamic equilibrium of CRL assembly and disassembly. As the field matures, practical applications for harnessing the extraordinary power and specificity of these enzymes to effect cellular regulation are also beginning to emerge. Although progress over the past seven years has been truly impressive, our understanding of the CRL superfamily of enzymes remains in its infancy.
