Посещений:
Формирование Клапанов Сердца

Development of Heart Valve Leaflets and Suipporting Apparatus in Chicken and Mouse Embryos
J.Lincoln, C.M.Alfieri, K.E.Yutzey
Dev. Dyn. - 2004. - V.230, No 2, P. 239-250

Аномалии valvuloseptal развития вносят существенный вклад в возникновение врожденных пороков сердца. Ранние кардиальные регуляторные гены дифференциально экспрессируются во время valvuloseptal (клапанно-пергородчатого) развития, это согласуется с предположением об их новых функциях во время образования камер сердца у эмбринов кур и мышей. Идентифицированы самостоятельные клоны клеток в створках клапанов, в chordae tendineae и миосухожильных соединениях с папиллярными мышцами на базе ограниченной экспрессии молекул внеклеточного матрикса. Специфические типы клеток внутри этих структур демонстрируют характеристики, свойственные хондрогенезу и развитию сухожилий, они идентифицируются по экспрессии scleraxis, типа II коллагена и tenascin. У эмбрионов кур ремоделирование и созревание клапанов сопровождается снижением митотического индекса. Анализ Tie2-cre x ROSA26R мышей показал, что структуры зрелых клапанов, включая створки атриовентрикулярных и полулунных клапанов тракта оттока, chordae tendineae и фиброзного образования, соединяющего septal створки митрального и трёхстворчатого клапанов, возникают из эндотелиальных клеток эндокардиальных подушек. Всё это проливает новый свет на на возникновени и разноообразие клеточных клонов структур зрелых клапанов у позвоночных.


Рис.  | Normal closed mitral valve,



Collagen XVIII/endostatin is associated with the epithelial-mesenchymal transformation in the atrioventricular valves during cardiac development

Lorenza S. Carvalhaes, Othon L. Gerva'sio, Cristina Guatimosim, Ritva Heljasvaara, Raija Sormunen, Taina Pihlajaniemi, Gregory T. Kitten (kitten@icb.ufmg.br)

Developmental Dynamics Volume 235, Issue 1, Pages 132-142


Типа XVIII коллаген является мультидоменовым белком, который содержит отщепляемый С-терминальный NC1 и endostatin фрагменты, которые, как было показано, или индуцируют или ингибируют миграцию клеток. Endostatin интенсивно исследовался из-за своей анти-ангиогенной активности. Три варианта type XVIII коллагена, как было установлено, распределяются в эпителиальных и эндотелиальных базальных мембранах ткане-специфическим образом. Единственный ген, кодирующий collagen XVIII находится на хромосоме 21 внутри области, ассоциированной с фенотипом ВПР при синдроме Дауна. В данной работе мы исследовали паттерн экспрессии collagen XVIII в сердцах эмбрионов мышей во время формирования atrioventricular (AV) клапанов. Было установлено, что collagen XVIII локализуется не только в разных базальных мембранах, но и экспрессируется на высоком уровне во всей соединительной ткани сердцевины эндокардиальных подушек и в формирующихся створках AV клапанов. Он тесно ассоциирован с эпителиально-мезенхимной трансформацией эндотелиальных клеток в мезенхимные клетки ткани подушек и располагается вокруг этих клеток, как только они мигрируют в кардиальный гель, чтобы сформировать элементы инициальной соединительной ткани створок клапанов. Однако, после эмбрионального дня 17.5 экспрессия collagen XVIII быстро снижается в соединительной ткани и после этого остается обнаружимой только в базальных мембранах эндотелиального слоя, покрывающего створки. Паттерн окрашивания, наблюдаемый в AV эндокардиальных подушках указывает н то, что collagen XVIII может играть рольв морфогенезе кардиальных клапанов. Эти результаты могут помочь понять нормальное развитие сердца и аберантные механизмы, вызывающие вроженные пороки сердца при синдроме Дауна.


Рис.1.  | Collagen XVIII and collagen IV expression in embryonic day (ED) 11.5 hearts. A-F: Hematoxylin and eosin staining (A) and immunofluorescence staining (B-F). A: A section through a looped tubular heart in which a small number of endocardial cushion tissue (CT) cells (ct) have migrated into the cardiac jelly (CJ) in both the atrioventricular canal (AV) and outflow tract (ot). B: Collagen XVIII is localized in the endothelial (en; arrow) and myocardial (m; arrowhead) basement membranes (BMs) in cushion tissue regions using an antibody that recognizes all three variants (ELQ, anti-all). C: A strong collagen XVIII staining pattern is also seen in association with the CT cells that have migrated into the CJ (ELQ). No staining was detected in the acellular regions of the CJ. D: With an antibody (Q36.4) specific to the two longest forms of collagen XVIII, prominent staining is observed in the endothelial and myocardial BMs but only weakly in CT cells. E: Collagen IV is present in the endothelial (en; arrow) and myocardial (m; arrowhead) BMs. F: All control sections were negative. A section from ED11.5 incubated with secondary antibody alone is shown here. L, lumen; v, ventricle. Scale bars = 200 m in A, 100 m in B-F.

Врожденные пороки сердца (ВПС) широко распространены у людей и возникают с частотой примерно 1 на 100 живорожденных в США (Hoffman, Kaplan, 2002). Большинство ВПС обусловлено аномалиями клапанно-перегородчатого развития, имеются указания на генетический вклад в структурные аномалии сердца (Pierpont et al., 2000, Srivastava, 2001). Во время эмбрионального развития инициальные события образования клапанов - индукция образования эндокардиальных подушек в atrioventricular (AV) канале и outflow tract (OFT) (Eisenberg, Markwald, 1995; Barnett, Desgrosellier, 2003; Schroeder et al., 2003). AV эндокардиальные подушки сливаются и конденсируются в самостоятельные зачатки митрального и трёхстворчатого клапанов, которые впоследствии ремоделируются, чтобы сформироать створки клапанов и поддерживающие структуры. Сигнальные пути инициального образования эндокардиальных подушек известны, последующие события изучены в меньшей степени.
Зрелые клапаны, которые образуются в результате реконструкции мезенхимы эндокардиальных подушек в организованные створки и поддерживающий аппарат состоят из разных типов клеток и внеклеточного матрикса (Wenink, Gittenberger-de Groot, 1986; Icardo, Cplvee, 1995; Larners et al., 1995; Wessels et al., 1996; Oosthoek et al., 1998). Створки трёхстворчатого и митрального клапанов, которые формируются в AV соединении, состоят из сложной сети соединительно тканных и интерстициальных клеток. Сhordae tendineae поддерживают створки клапанов и вставлены непосредственно в папилярные мышцы, которые выпячиваются из стенок желудочков (Lamers et al., 1995). Гистологический и иммунохимический анализ былиспользован для характеристики образования зрелых AV створок клапанов и поддерживающего аппарата во время развития птиц, мышей и человека (Chin et al., 1992; Lamers et al., 1995; Wessels et al., 1996; Oosthoek et al., 1998; Webb et al., 1998). Согласно предварительным данным створки AV клапанов и chordae tenduneae происходят из клеток эндокардиальных подушек (De la Cruz et al., 1983; Oosthoek et al., 1998).
Идентифицировано несколько критичеких регуляторов индукции ранних кардиальных клонов, но специфические роли этих сигнальных молекул и транскрипционных факторов в более поздних событиях формирования камер сердца менее изучены (Brueau, 2002; Yutzey, Kirby, 2002; Brand, 2003). У эмбрионов птиц экспрессия bmp2, smad6, nkx2.5, gata4, tbx5, tbx20 перекрывает область образования сердца (Schulthesis et al., 1995; 1997; Ehrman, Yutzey, 1999; Yamada et al., 1999; Liberatore et al., 2000; Lio et al., 2001). Экспрессия этих же генов у ранних эмбрионов мышей менее ясна, однако, нулевые мутации или редукция экспрессии этих генов ассоциирована с очень ранними летальными эффектами сердца у эмбрионов мышей и/или рыбок данио (Lyons et al., 1995; Zhang, Bradley, 1996; Molkentin et al., 1997; Kraus et al., 2001; Szeto et al., 2002). Первоначальные доказательства более поздней роли этих факторов при формировании камер сердца получены с помощью ассоциации гетерозиготных мутаций в TBX5, NKX2-5, GATA4 с ВПС и с аномалиями проводящей системы у людей (Basson et al., 1997; Li et al., 1997; Schott et al., 1998; Garg et al., 2003). Имеются дополнительные подтверждения от изучения генного таргетинга у мышей для критических функций передачи сигналов Tbx5, Nkx2.5, BMP и Smad6 во время клапанно-перегородчатого развития в AV канале и OFT (Biben et al., 2000; Galvin et al., 2003). Нужда в некоторых ранних кардиальных регуляторных генах во время поздних событий органогенеза сердца м. указывать на новые функции этих генов в деверсификации специализированных кардиальных клонов клеток и в развитии специфических valvuloseptal структур.
Молекулярные и клеточные регуляторные механизмы, которые контролируют образование сердечных клапанов, изучены у мышей и кур. Дифференциальная экспрессия ранних кардиальных регуляторных генов обнаруживается в отдельных клапанно-перегородчатых структурах конкурентно с формированием камер сердца. В дифференцирующихся клапанах ограниченная экспрессия молекул внеклеточного матрикса предопределяет отдельные клеточные компартменты в створках и поддерживающих структурах. Области повышенных клеточных делений во время образования клапанов у эмбрионов кур согласуются с механизмом дистальных выростов элонгации клапанов и редукцией клеточной пролиферации в дифференцирующихсся структурах клапанов. Кроме того, продемонстрированы источники эндотелиальных клеток створок зрелых клапанов и поддерживающих структур у мышей. Всё это даёт новые доказательства специфических клеточных и молекулярных механизмов, с помощью которых эндокардиальные подушки ремоделируются и созревают в клпаны сердца.

DISCUSSION


Изучали сердца кур и мышей во время valvuloseptal ремоделирования и дифференцировки для выявления компартментализованной экспрессии ранних кардиальных регуляторных генов и молекул внеклеточного матрикса. Кроме того, определены времнной и пространственный контроль клеточной пролиферации и эндотелиальные источники клапанов и поддерживающего аппарата. Органиченная экспрессия в отдельных клеточных клонах и кардиальных структурах наблюдалась для gata4, nkx2.5, tbx5, tbx20, smad6 и bmp2 у эмбрионов кур и мышей, чтонаходится в контрасте с с их паттернами перекрывающейся экспрессии во время инициальных стадий детерминации и дифференцировки кардиальных клонов. Специфические компартменты зрелых клапанов, включая створки, chordae tenduneae и myotendinous соединения, были идентифицированы на базе ограниченной экспрессии молекул внеклеточного матрикса. Экспрессия некоторых маркёров хондрогенеза и и развития сухожилий, включая bHLH ген scleraxis, в зрелых клапанах м. указывать на общие регуляторные механизмы между этмим соединетельно тканными клонами и поддерживающими структурами клапанов. Локальные области клеточной пролиферации в зачатках клапанов у кур согласуются с механизмом дистальных выростов элонгации клапанов и демонстрируют, что дифференцировка клапанов сопровождается пониженной пролиферацией. Эндотелиальные источники зрелых створок клапанов и поддерживающих структур, включая клапанно-пергородчатое фиброзное соединение между митральными и трёстворчатыми клапанами, были продемонстрированы у Tie2-cre x ROSA26R мышей. Всё это указывает на регуляторные события , которые трансформируют эндокардиальные подушки в зрелые клапаны и поддерживающие структуры.
Анализ пространственно-временной экспрессии ранних карлиальных регуляторных генов во время клапанно-перегородчатого развития выявил ассоциацию с разными типами клеток в ртдельных компартментах сердца Экспрессия Nkx2.5 в клонах атриальных и вентрикулярных миоцитов и в мышечной стенке трёхстворчатого клапана эмбрионов кур согласуется с его функцией в качестве транскрипционного регулятора экспрессии карлиальных мышечных генов (Bruneau, 2002). В противоположность nkx2.5 gata4 экспрессируется в зачатках клапанов у кур и мышей и это м.б. индуктивной новой функцией в клетках немышечного типа во время клпанно-перегородчатого развития. Сходным образом мышиный gata5 экспрессируется в эндокарде, где он регулирует дифференцировку эндокардиальных клеток и экспрессию гена endothelin-1 в сочетании с NFATc1 (Nemer, Nemer, 2002). Колокализованная экспрессия куринных tbx5 и nkx2.5 в субпопуляции клеток, ассоциированных со специализированной проводящей системой, это согласуется с аномалиями проводящей системы, ассоциированных с мутациями генов NKX2.5 и TBX5 человека (Basson et al., 1997; Schott et al., 1998)/ Эта колокализация tbx5 и nkx2.5 не обнаруживается в сердце эмбрионов мыши, однако, мыши, гетерозиготные по мутациям tbx5 обнаруживают аномалии проводящей системы (Bruneau et al., 2001). И у эмбрионов кур и мышей экспрессия tbx20 превалирует в зачатках клапанов и зрелых клапанах, однако, его регуляторная функция во время клапанно-перегородчатого развития неизвестна. Т.к. Экспрессия всех этих транскрипционных факторов перекрывается во время раннего разития сердца, то кажется вполне вероятным, что их регуляторные функции дивергируют во время поздних событий спецификации камер сердца.
Имеются обширные доказательства важности передачи сигналов DVH во время клапанно-перегородчатого развития, но точные регуляторные функции и вовлекаемые типы клеток окончательно не определены (Delot, 2003). В некоторых исследованиях передача сигналов DVH была ассоциирована с пониженной пролиферацией, миграцией, дифференцировкой и апоптозом клеток эндокардиальных подушек во время созревания и ремоделирования клапанов (Nakajima et al., 2000; Abdelwahid et al., 2001; Jackson et al., 2003). У мышей мутации в DVH лигандах, рецепторах или сигнальных белках ведут к дефектам клапанов и перегородки в AV канале и тракте оттока (Galvin et al., 2000; Kim et al., 2001; Jiao et al., 2003; Delot et al., 2003). В отличие от кур, где bmp2 экспрессируется в AV подушках, экспрессия bmp2 у мышей, по-видимому, более ограничена трактом оттока. Однако, др. ВМР лиганды , включая ВМР4 экспрессируются в AV канале мышей и необходим для нормального AV клапанно-перегородчатого развития (Jiao et al., 2003). Дополнительные BMPs, включая ВМР5, -6, -7 также экспрессируются в AV valvuloseptal структурах мышей и кур и скорее всего регулруют аспекты клеточного роста, миграции, дифференцировки и гибели (Kim et al., 2001; Yamagishi et al., 2001). Роль ВМР2 в зачатках AV клапанов сложна, она м. включать индуктивные функции в специфических клонах клеток клапанов, также как и контроль морфогенетических событий.
Анализ экспрессии регуляторных генов и распределения молекул внеклеточного матрикса демонстрирует видо-специфические различия в типах клеток створок зрелых клапанов и поддерживающих структур у эмбрионов кур и мышей. У кур муральная часть створок трёхстворчатого клапана обладает уникальным мышечным составом и не поддерживается с помощью инсерций фиброзных поддерживающих структур в вентрикулярные папиллярные мышцы (Chin et al., 1992; Sedmera et al., 2000; данное исследование). Митральный клапан у птиц не является мышечным и состоит из определенного фенотипа внеклеточного матрикса в створках клапанов, chordae tenduneae и myotendinous соединения. У мышей наблюдаются сходные паттерны экспрессии коллагена типа I, коллагена типа II и tenascin в створках митрального и трёстворчатого клапанов и в поддерживающих структурах. Преимущественно мышечные трехстворчатые клапаны без вентрикулярной фиброзной поддержки у цыплят, по-видимому, являются уникальрными для птиц, т.к. фиброзные створки клапанов и поддерживающие структуры очевидны в AV клапанах эмбрионов Xenopus, рыбок данио, мышей и человека (Wessels et al., 1996; Sedmera et al., 2000). Дополнительным признаком AV клапанов человека является тесная аппозиция предшественников створок клапанов и chordae tenduneae смышечными поддерживающими структурами в зачатках клапанов (Oosthoek et al., 1998). Ассоциация производных подушек структур фиброзных клапанов со слоем дифференцированных мышечных клеток не обнаруживается в митральном клапане цыплят или в любом из AV клапанов мышей. Следовательно, вычленение фиброзных створок клапанов из пдлежащего миокарда м.б. уникальным свойством развития клапанов человека (Wessels et al., 1996; Oosthoek et al., 1998). Все эти гистологические анализы демонстрируют, что т.к. ранние события кардиогенеза сильно законсервированы у разных видов, тогда как поздние события созревания и ремоделирования клапанов оказываются специализированными среди позвоночных.
Молекулярные маркёры хондрогенеза и развивающихся сухожилий присутствуют в створках зрелых клапанов и поддерживающих структурах сердца как у Е14 цыплят, так и у новорожденных мыышей (Рис. 7).

Fig. 7. Compartmentafizatlon of mature valve leaflets and supporting structures. B: The E14 avian mitral valve structures highlighted in the boxed area are shown schematically. The valve leaflets (yellow) predominantly express type I collagen. The valve leaflet is attached to the papillary muscles by means of chordae tendineae (blue). The chordae tendineae show further diversification between the junctions with the valve leaflet, marked by type II collagen (dark biue), and scleraxis in the region adjacent to the myatendinous junctions (light blue). The myatendinous junctions (red) with the papillary muscle are marked by Cl reactivity.

Коллаген типа II является характерным для хряща и экспрессируется в chordae tenduneae, соседствующими со створкой клапанов (Chimal-Monroy et al., 2003). Scleraxis, транскрипционный регулятор, важный для развития предшественников сухожилий в конечностях и сомитах, экспрессируется также в соединениях поддерживающего аппарата клапанов и папиллярных мышц митральных клапанов птиц (Schweitzer et al., 2001). Tenascin и антигены С1 и С5, которые присутствуют в хрящах и сухожилиях развивающихся конечностей и сомитов, экспрессируются также в поддерживающем аппарате клапанов и кариальных myotendinous соединениях (George-Weinstein et al., 1988; Edom-Vovard et al., 2002). В развивающихся конечностях и сомитах развитие сухожилий детерминируется с помощью передачи сигналов fibroblast growth factor и активности Scleraxis, регулирующей экспрессию tenascin (Edom-Vovard et al., 2002). Хондрогенез конечностей характеризуется индукцией с помощью ВМР Sox9, транскрипционного фактора, который активирует экспрессию гена type II collagen (Ng et al., 1997; Chimal-Monroy et al., 2003). В развивающемся сердце птиц критические регуляторные компоненты как детерминации сухожильного клона, так и хондрогенеза пространственно и во времени регулируются в зачатках клапанов и в зрелых клапанах (данное исследование; Karabagli et al., 2002; Sugi et al., 2003). Однако, точная функция этих регуляторных путей в дифференцировке и формировании паттерна зрелых клапанов и поддерживающих структур ещё не установлена.
Происхождение структур зрелых клапанов из недифференцированных эндокардиальных подушек является спорным (Ву laCruz et al., 1983; Lamers et al., 1995; Wessels et al., 1996; Oosthoek et al., 1998). Использовали Tie2-Cre x ROSA26R генетический подход у мышей, позволяющий метить клетки, происходящие из эндотелиальных клонов. Ранее эта система была использована, чтобы показать, что мезенхима эндокардиальных подушек на Е12.5 целиком происходит из эндотелиальных предшественников (Kisanuki et al., 2001). У новорожденных мышей створки AV и OFT клапанов и поддерживающие chordae tenduneae AV клапанов преимущественно происходят из эндотелиальных клонов подушек. Кроме того, поразительное фиброзное соединение (continuity) между створками от перегородки трёхстворчатого и митрального клапанов через межжелудочковую перегородку также происходит из эндотелия подушек. Это valvuloseptal фиброзное соединение очевидно в сердце эмбрионов людей и скорее всего поддерживает септальные створки AV клапанов в течение всей жизни (oosthoek et al., 1998). У кур популяция клеток, происходящих из эпикарда, вносит существенный вклад в AV клапаны (Gittenberger-de Groot et al., 1998). Следовательно, неполное происхождение mural створок AV клапанов из эндотелиальных клеток в сердце Tie2-cre x ROSA26R м.б. обусловлено вкладом эпикарда в митарльные и трёхстворчатые клапаны у мышей. В OFT экспрессия Tie2-cre x ROSA26R является комплементрной той, что наблюдается для маркёра клона нерального гребня, wnt1-cre, это демонстрирует разное клеточное происхождение структур OFT septal и полуллунных клапанов (Jiang et al., 2000). Итак, огромное большинство клеток как в полулунных, так и AV клапанах мышей имеет эндотелиальное происхождение.
Аномальное образование и морфология клапанов являются признаком многих врожденных аномалий клпанов (Bartram et al., 2001). Нарушения функции сердечных клапанов часто обусловлены аномалиясми структуры створок клапанов или неэффективностью поддерживающего аппарата, включая chordae tenduneae и папиллярные мышцы. Имеется множество доказательств генетических причин ВПС, включая уродства клапанов, ассоциированные с DioGeorge синдромом, трисомией 18, трисомией 21 и мутациями генов транскрипционных факторов и молекул внеклеточного матрикса (Johnson et al., 1997; Pierpont et al., 2000; Bruneau , 2002; Hoffman, Kaplan, 2002).
Сайт создан в системе uCoz