Стволовые Клетки и Старение Миокарда
MYOCARDIAL AGING AND SENESCENCE: Where Have the Stem Cells Gone? Mark A. Sussman, Piero Anversa Annu. Rev. Physiol. 2004. 66:29–48
	Сохранение структуры и функции стареющего миокарда скорее всего может оказаться успешным посредством использования репарации и замещения с помощью клеток, благодаря выживанию существующих кардиомиоцитов. Противоречивые ранее находки плюрипотентных предшественников, принимающих кардиальные фенотипы, теперь общеприняты и центром сегодняшних споров является эффективность внесения клеток предшественников в миокард. Ещё многое предстоит сделать в определении подходящей популяции клеток предшественников и для оптимизации условий для эффективной дифференцировки и интеграции. Важно их использование для патологически поврежденного или стареющего миокарда, безусловно будущие подходы будут базироваться на использовании кардиальных стволовых клеток в качестве терапевтических агентов. Главная функция сердца, заключающаяся в создании сил для перекачки крови, зависит от координированного сокращения кардиальных миоцитов. Приблизительно 5 биллионов миоцитов содержится в нормальном левом желудочке человека (1), однако, эта популяция клеток с возрастом уменьшается за счет внешних и внутренних факторов. Кардиомиопатическая недостаточность и старение клеток с возрастом ведут к старению миокарда со снижением гемодинамики и уменьшением сократительных резервов (2-10). Часто эти функциональные нарушения ведут к структурному ремоделированию, заканчивающемуся инфарктом. Старый миокард наиболее чувствителен к повреждениям вследствие патологических инсультов, таких как реперфузионные повреждения (11). Сердечная недостаточность остается ведущей причиной болезненности и смертности в индустриальном мире. Современные вмешательства не способны лечить лежащие в основе дефекты: кардиомиоциты, которые не замещаются и снижение функции оставшихся клеток. AGING, SENESCENCE, AND STEM CELL REGENERATION Изменения генов, среды и вероятностные изменения, все они вносят вклад в продолжительность жизни организма (12, 13). Внешние и внутренние факторы кооперируют в детерминации скорости старения и старческого фенотипа (14, 15). Генетические искусственно созданные модели старения и преждевременных синдромов старения у человека, вызываемые генетическими мутациями, указывают на то. что старение, по крайней мере, частично контролируется генетически (16-18). Несмотря на присутствие системных часов, которые регулируют старение организма как целого, органы стареют с др. скоростью. Напр., при progeroid синдромах, при которых одна и та же генетическая мутация проявляется во всех клетках организма, но имеет разные последствия для разных органов (18). ЦНС и иммунная система не затрагиваются болезнью в течение длительного времени, тогда как др. органы тяжело нарушены уже в раннем возрасте (19, 20). Гибель кардиомиоцитов непонятным оразом связана с нормальным жизненным циклом структуры и функции миокарда (21). Апоптоз кардиомиоцитов не считается больше спорным, а накапливающиеся данные подтверждают важную роль апоптоза, по крайней мере, при некоторых кардиомиопатических заболеваниях. Ускорение клеточной гибели при старении миокарда (22) было предположено в качестве механизма понижения гемодинамической эффективности повышенного риска сердечной недостаточности у пожилых (23, 24). Считается, что кардиомиоциты не замещаются и что накапливающаяся потеря этих клеток в результате патологических инсультов или старения нарушает сократительную способность сердца. Параллельно стареющие миоциты накапливают маркеры клеточного старения, которые обычно появляются вблизи конца клеточного периода жизни. Клеточное старение является сложным фенотипом, который влечет за собой изменения как функции, так и способности к репликации. В отличие от апоптоза, который элиминирует поврежденные клетки из ткани, стареющие клетки остаются жизнеспособными несмотря на изменения в морфологии, метаболизме и расстройство дифференцированных функций (25). В этом смысле, было предположено, что старение вносит вклад в износ клеточных функций при старении. Накопление стареющих кардиомиоцитов сказывается на структуре и функции миокарда. Снижение контрактильной способности является результатом изменений на молекулярном уровне в экспрессии изоформ контрактильных белков и изменения уровней белков, связанных с использованием кальция (rev. 26). Нарушение использования кальция в стареющих миоцитах (27, 28) неизбежно ведет к реактивной гипертрофии, которая увеличивает объем клеток без соотв. увеличения контрактильности (29). Старые кардиомиоциты вносят вклад в недостаточность сердца не только из-за ослабления функции, но также из-за неадекватного скорее, чем адаптивного ремоделирования. Пролиферация ядер миоцитов, увеличение объема миоцитов и накопление соединительной ткани являются основными детерминантами ремоделирования гипертрофического стареющего миокарда (30). Увеличенные кардиомиоциты не способны к гипертрофии и пролиферации, экспрессируют ингибиторы клеточного цикла и не могут транскрипционно репрограммироваться в ответ на увеличение рабочей нагрузки (31, 32). Старение также увеличивает напряжение стенок, что не нормализуется за счет ремоделирования желудочков (33), и способность к адаптивному ремоделированию миокарда теряется у старых пациентов (34). Старение является гетерогенным процессом. Изучение старения просто у одноклеточных организмов, у которых старение всего тела отражает старение его единственной клетки (35). Если оцениваются более сложные организмы, то корреляцию между клеточным старением, старением тканей или органов и старением организма установить нелегко. Однако, эукариотические клетки стареют индивидуально in vitro и in vivo, как у простых, так и с сложных организмов (36, 37). Независимая продолжительность жизни каждой клетки указывает на то, что главный компонент старения находится на клеточном уровне и что ключевой вопрос о старении должен решаться на этом же уровне. Скорость старения органа сильно зависит от темпа клеточно-автономного процесса, приводящего в результате к накоплению старых клеток с нарушенными функциями (37). Это накопление, с вою очередь, связано со снижением способности органа замещать старые клетки лучше функционирующими боле молодыми клетками. Следовательно, старение сердца предопределяется на уровне контроля клеток, т.е. cardiac stem cell (CSC). THE NEWPARADIGM OF MYOCARDIAL CELLULAR REPLICATION Широко бытует мнение, что кардиомиоциты неспособны к регенерации, исходя из отсутствия доказательств противоположного: непрерывные клеточные линии кардиомиоцитов с высоко дифференцированными свойствами не могут быть получены, цитокинез взрослых кардиомиоцитов довольно редок и попытки заставить взрослые кардиомиоциты вступить повторно в клеточный цикл безуспешны. Более того, нормальные сердца после патологических инсультов остаются скорее с нерепарированными повреждениями. Хотя эти неоспоримые наблюдения и верны, однако имеются анекдотические доказательства, делающие вызов status quo (38, 39). Мы не будем углубляться в этот вопрос, см rev. (40). Короче морфометрический анализ показал, что количество миоцитов увеличивается от рождения до юношеского возраста у грызунов и человека (38). Использование цитологических и биохимических маркеров клеточного цикла и синтеза ДНК в миокарде выявило частоту репликации кардиомиоцитов до сих пор не ожидаемую и потребовало дальнейших исследований о происхождении этих клеток, происходят ли они от существующих миоцитов или из популяции предшественников кардиомиоцитов, ранее обозначенных как кардиальные стволовые клетки [породивших жаркие дебаты (41-43)]. Этот потребовало переоценки и регенерации и сохранения навсегда кардиоцитов в ходе жизни (Figure 1). Главный сдвиг пардигмы был вызван открытием стволовых клеток, способных дифференцироваться в три основные типа клеток миокарда: гладкомышечные, эндотелиальные и кардиомиоциты. Подтверждение этого наблюдения получено независимо многими лабораториями по всему миру (44-46). Несмотря на недавние диспуты относительно частоты (47-49), превалирующим мнением стало, что такие события трансдифференцировки происходят, В течение последних двух лет совместные усилия нескольких групп продемонстрировали интеграцию стволовых клеток в интактном сердце (50-53). Некоторые исследования наблюдали ре-популяцию поврежденного миокарда стволовыми клетками, происходящими из костного мозга, это приводило к улучшению гемодинамической функции (54-57). Т.о., больше не возникает вопроса, может ли происходить замещение кардиомиоцитов, а скорее, каковы характеристики популяции предшественников, сколь эффективно могут такие клетки интегрироваться в функционирующий миокард и допускает ли процесс манипуляции с помощью генетических или биохимических техник, чтобы усиливать регенеративные свойства этих клеток ? Большинство современных споров о кардиальных стволовых клетках касается вопроса о частоте и эффективности интеграции и дифференцировки стволовых клеток в ткань миокарда (58, 59). Во-первых, оценки широко варьируют в отношении способности жертвенных клеток выживать и затем интегрировать в ткани хозяина. Во-вторых, возникает скептицизм относительно слияния между жертвенными клетками и адаптирующей тканью хозяина для создания клеточного химеризма, который мог бы рассматриваться как интеграция (60-64). В-третьих, возникает вопрос, могут ли жертвенные (donated) стволовые клетки способствовать рекрутированию эндогенных предшественников, которые бы помогали регенерации. В-четвертых, влияние эндогенных факторов, таких как цитокины, факторы роста или локальная клеточная среда на стволовые клетки, остается полностью неизученным. Разрешение этого ключевого вопроса в конце концов определит эффективность и пригодность терапии стволовыми клетками в качестве вмешательства для репарации поврежденного или функционально недостаточного миокарда. Все согласны, что улучшение трафика, жизнеспособности и интеграции стволовых клеток в миокард приведет в конечном итоге к огромным успехам в лечении болезней сердца и в улучшении функции стареющего сердца. STEM CELL POPULATION CHARACTERISTICS Markers Стволовые клетки определяются как клоногенные клетки, способные к самообновлению и дифференцировке во множественные клоны (65, 66). Стволовые клетки дают олигоклональных предшественников, которые теряют свойство самообновления, дают потомство с ограниченным потенциалом дифференцировки. Окончательная судьба потомства это генерация функционально компетентных зрелых клеток (65). Эта модель клеточного роста идентифицирована только в гематопоэтической системе. Однако, это обычно приписывается все самообновляющимся органам. Недавние наблюдения, сделанные в нашей лаб., показали, что сердце обладает субпопуляцией клеток, которые обладаю функциональными характеристиками стволовых клеток (59, 67). Эти недифференцированные клетки являются клоногенными, самообновляющимися и плоюрипотентными. На базе in vitro и in vivo результатов было идентифицировано 3 класса CSCs: c-kit, MDR1 и Sca-1-like-позитивные клетки (59). Эти поверхностные антигены, обычно присутствуют в hematopoietic stem cells (HSCs), они были выявлены в CSCs независимо или в комбинации. Хотя c-kit позитивные клетки могут расти и дифференцироваться в различные кардиальные клоны (67), неизвестно, обладают ли MDR1 и Sca-1-like-позитивные клетки таким же потенциалом. Экспрессия MDR1 и способность исключать краску Hoechst предопределяет небольшую группу HSCs, называемых побочной популяцией, в костном мозге (68, 69) и скелетных мышцах (70, 71). MDR1POS клетки в костном мозге дают миэлоидный, лимфоидный и эритроидный клон клеток (68,69, 72, 73), тогда как в скелетных мышцах они регенерируют мышечные волокна (74). Кроме того, MDR1POS клетки из скелетных мышц происходят из костного мозга и могут снова засевать деплетированный костный мозг (75). Предварительные результаты in vivo у людей (59, 76) и у животных моделей (77, 78) показали, что MDR1POS клетки дифференцируются в родоначальников и предшественников миоцитов, эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и фибробластов. Сходный паттерн роста распознан in vitro с помощью дифференцировки клоногенных клеток. Sca-1-подобный белок, маркер стволовых клеток, найден с помощью конфокальной микроскопии в не дифференцированных клетках кардиальной ткани мышей (78), крыс (79), собак (80) и свиней (P.Anversa, unpublished observation) и в сердце людей (59, 76, 79). Sca-1-подобный белок выявлен не только в стволовых клетках, но и также на поверхности эндотелиальных клеток (76, 78), указывая тем самым, что этот антиген может быть особенно чувствительным к ростовым факторам, активным в генерации сосудистых структур. MDR1POS клетки дифференцируются в скелетно-мышечные клетки (74), и эта преимущественная клональная детерминация подчеркивает более значительный потенциал для форсирования кардиальных миоцитов. Большинство мощных регенерирующих клеток сердца могут быть теми, что экспрессируют c-kit и MDR1. Эта группа клеток может делиться и дифференцироваться в миоциты и coronary-resistance артериолы и капиллярные профили, важные для продукции миокарда de novo. Дифференциальная экспрессия антигенов поверхности стволовых клеток может давать в результате самостоятельный клеточный рост и детерминацию клонов, ведущую к преимущественному образованию миоцитов, коронарных сосудов или их комбинации. Additional Phenotypic Characteristics Мы установили, сердца взрослых крыс содержат популяцию недифференцированных клеток, которые экспрессируют поверхностные антигены, обычно обнаруживаемые в HSCs (65, 72, 81, 82): c-kit, MDR1 и Sca-1 (77, 78, 83, 84). Сходные результаты были получены у собак (80), свиней (P. Anversa, unpublished results) и что более важно в сердце человека (59, 76; P. Anversa, unpublished observation). Ограниченный пул клеток, позитивный по Sca-1-like эпитопу (59, 76) был идентифицирован с использованием антител против мышиного белка Ly6A/E (76, 77). Клетки с идентичным фенотипом были выявлены в нормальном костном мозге человека, которые также были позитивными по белку c-kit и Sca-1-like (P. Anversa, unpublished observation). Клон-негативные, c-kit-позитивные (Lin-/-kitPOS) были получены из сердца крыс, они были саом-обновляющимися, клоногенными и плюрипотентными (67). Одиночные клоногенные клетки были способны дифференцироваться в миоциты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и фибробласты. Т.о., CSCs могут давать все компоенты миокарда. CSCs были изолированы из миокарда и получены долговременные культуры (67). Т.о., только Lin-/-kitPOS клетки, как было покзано, оладают тремя компонентами стволовых клеток: само-обновлением, клоногенностью и множественным потенциалом. Свойства MDR1 и Sca-1-like-позитивных клеток не были определены. In vitro, Lin-/-kitPOS клетки росли в виде монослоя, когда засевались на чашки, покрытые субстратом, или формировали сфероиды, если культивировались в суспензии, воспроизводя биологию нейральных стволовых клеток (67, 86). In vivo, CSCs, имплантированные в инфарктный желудочек, или мобилизованные из места хранения в мертвый миокард (77, 87) мигрируют, внедряются, подвергаются мультиклональной детерминации и способствуют кардиальной регенерации. Т.о., CSCs существуют, но их распределение и характеристики роста в разных областях сердца неизвестны. NICHES Различия в микроусловиях и механических силах присутствуют в анатомических частях сердца. Эти переменные могут играть критическую роль в предписании функции и судьбы CSCs. Эта информация важна для понимания эффектов структурных и физических факторов на поведение CSCs в сердце взрослого (Figure 2). Стволовые клетки обычно находят приют в специализированных структурах, т.наз. нишах, концепция предложена в 1978 Schofield, определяется как "стабильные микроусловия, которые могут контролировать поведение гематопоэтических стволовых клеток" (88). Недавно ниши стали рассматривать как "как субнабор тканевых клеток и внеклеточных субстратов, которые могут до бесконечности давать кров одной или более стволовым клеткам и контролировать из самообновление и продукцию потомства in vivo" (89). Ниши стволовых клеток, создают микроусловия, предназначенные сохранять потенциал жизнеспособности и репликации стволовых клеток (89). Примитивные клетки делятся редко и те, что вносят вклад в нишу имеют более высокую вероятность само-обновления (89). Ниши присутствуют во всех само-обновляющихся органах (90-92). Предварительные результаты показали, что CSCs сохраняются в нишах, которые преимущественно локализуются в предсердии и верхушке (apex), но обнаруживаются также и в желудочках (77,93, 94). Специфической топографическое распределение CSCs в сердце подтверждает, что могут существовать взаимоотношения между функцией CSCs и уровнем гемодинамических стрессов. CSCs накапливаются в нишах, находящихся в предсердиях и апексе, которые являются анатомическими областями, подверженным низким уровням стрессов на стенку. Предпочтительная локализация CSCs в зонах, где физические силы скромные, согласуется с обычными сайтами хранения стволовых клеток в само-обновляющихся органах (89-91): CSCs занимают наиболее защищенные области сердца. RECEPTORS AND PARACRINE FACTORS CSCs экспрессируют два поверхностных рецептора: c-Met и IGF-1R (77). c-Met является рецептором для human growth factor (HGF), а insulin-like growth factor (IGF)-1R является рецептором для IGF-1. Системы HGF-cMet и IGF-1-IGF-1R присутствуют в CSCs мышей, крыс и собак. Связывание c-Met рецептором способствует инвазии примитивных клеток in vitro и in vivo (77, 87, 95,96). IGF-1 не обладает свойствами локомоции in vitro и in vivo (77), но участвует в клеточном росте и дифференцировке (77, 87, 95-98). IGF-1 активирует IGF-1R, это приводит в результате к транслокации Akt в ядро и тем самым способствует клеточной жизнеспособности (99, 100). HGF также предупреждает гибель клеток посредством PI3-K/Akt пути (101, 102). c-Met соединяется непосредственно с death рецептором Fas, блокируя Fas-обусловленный апоптоз (103). Наконец, HGF защищает миоциты от апоптоза, обусловленного реактивным O₂ (104). HGF и IGF-1 синтезируются в CSCs, родоначальниках и предшественниках и могут модулировать поведение, жизнеспособность и функцию CSC. Система IGF-1-IGF-1R играет позитивную роль в миграции клеток. Транслокация клеток, обеспечиваемая HGF, характеризуется клеточным делением, если присутствует IGF-1 вместе с мечением ядерных белков, участвующих в клеточном цикле (напр., Cdc6, MCM5 и Ki67), а также маркеров репликации ДНК (BrdU и mitosis) (38, 105-112). Т.о., IGF-1 является мощным митогеном для примитивных и ранних детерминированных клеток в сердце, а HGF является столь же мощным в стимулировании движения тех же самых клеток к областям мишеней внутри миокарда. Старение миокарда характеризуется снижением экспрессии IGF-1 и IGF-1R в миоцитах (113) и это ослабление системы IGF-1-IGF-1R может также затрагивать и CSCs и ранние детерминированные клетки. Предварительные результаты согласуются с возможностью, что и HGF-c-Met и IGF-1-IGF-1R системы подавляются с возрастом в CSCs. SENESCENCE IN THE AGING MYOCARDIUM Mechanisms Существуют три возможности, связанные с дефицитом регенерации в миокарде с возрастом: (a) CSC рост и дифференцировка с возрастом ослабляется; это мнение предполагает, что CSCs являются субъектом эффектов как и др. клетки миокарда. (b) Способность CSCs мигрировать в старом сердце снижена; это указывает на то, что старые CSCs не реагируют, точно также как молодые CSCs, на ростовые факторы, способствующие их активации и транслокации. (c) Количество функционально компетентных CSCs снижается с возрастом благодаря аресту роста, апоптической и/или некротической гибели старых CSCs; потому, что происходит ослабление факторов жизнеспособности в стареющих CSCs. Согласно догме, стволовые клетки обладают неограниченной способностью к само-обновлению или способностью замещать самих себя, которая превышает продолжительность жизни органа или организма (114, 115). Само-обновляющеся, плюрипотентные и клоногенные клетки д. избегать разрушительных эффектов времени и вредных изменений, ассоциированных с возрастом и старением. Стволовые клетки были интерпретированы как источник молодости и рассматривались как бессмертные, считалось, что они прекрасно экипированы против всех форм эффектов старения. Однако, это не так в случае с костным мозгом (116-118) и не так в случае с сердцем. Примитивные клетки, позитивные по p16INK4a, были выявлены в сердце пациентов с сердечной декомпенсацией и признаками преждевременного старения органов. Апоптоз c-kit-позитивных недифференцированных клеток был очень высоким в этих стареющих сердцах и всегда был ассоциирован с экспрессией p16INK4a (119). Фракция cycling предполагаемых CSCs увеличивается; этот феномен согласуется с результатами для костного мозга (114). Апоптоз и некроз миоцитов доказан у молодых взрослых Fischer 344 крыс (38, 120, 121) и FVB мышей (122) и он увеличивается с возрастом. Гипертрофия и репликация миоцитов стремятся сохранить мышечную массу и функцию, которые ухудшаются у старых животных (123, 124). Со временем деления миоцитов составляют превалирующую форму реактивного роста (79), тогда как гипертрофия миоцитов снижается (32, 113). Умножение миоцитов, однако, недостаточно, чтобы поддержать количество клеток и работу желудочков. Расширение полости, понижение соотношения вентрикулярной массы к объему камер, повышенные стрессы на стенки и нарушение механического поведения миоцитов становятся очевидными в старом сердце и это приводит к сердечной недостаточности (38, 121, 124). Т.о., активация старых CSCs происходит в ограниченных количествах перед клеточным старением и арест роста можно наблюдать как процесс лежащий в основе старения сердца. Зависимая от времени редукция обновления CSC д. соответствовать повышенной детерминации клонов CSC, истощению атриальных и апикальных ниш, что ведет к клеточному старению, характеризующемуся потерей способности к репликации в ответ на избирательные альтерации в специализированных функциях регуляции клеточного цикла (125, 126). В частности, репликативное старение соответствует необратимому блоку клеточного цикла в G0/G1, запускаемому за счет интегрированного действия p53/p21/p19 и p16/Rb путей (127, 128). Эта фаза жизнеспособного ареста клеточного цикла сопровождается различными изменениями в клеточной физиологии, морфологии и экспрессии генов (129). Открытие, что теломеры укорачиваются с каждым клеточным умножением in vitro подтверждает механизм, с помощью которого клетки д. ощущать своё собственное старение. Миграция, пролиферация и дифференцировка некоторых типов клеток, включая и стволовые, модулируется интегринами (87, 130), которые являются трансмембранными гликопротеиновыми гетеродимерами, состоящими из одной α и одной β цепи (131, 132). Эти адгезивные рецепторы взаимодействуют с компонентами внеклеточного матрикса, это приводит к реорганизации цитоскелета и трансдукции сигналов от интерстициума во внутриклеточный компартмент (133). HGF стимулирует экспрессию, функцию и распределение в клеточной мембране специфических классов интегринов (87, 133-137). c-Met, который присутствует на CSCs и молодых детерминированных клетках (87), формирует комплексы с α6β4 интегриновым рецептором, который активируется с помощью своего лиганда плазматического фибронектина, усиливающего инвазивные свойства c-Met-позитивных клеток (136,137). Активация интегриновых рецепторов на CSCs может инициировать миграторный путь, использующий фосфорилирование FAK и paxillin и их физическую ассоциацию (130, 133, 138-140). Кроме того, phospho-FAK активирует PI3-kinase-Akt путь выживаемости (141), ещё больше усиливая клеточную жизнеспособность. Наконец, phospho-Akt усиливает экспрессию и активность теломеразы в миоцитах (122), и сходная функция может осуществляться в примитивных и клон-детерминированных клетках. Активность теломеразы усиливает рост и выживаемость миоцитов (142, 143). Эти пути клеточной миграции могут составлять часть молекулярного механизма, ответственного за транслокацию репарирующих клеток в поврежденное сердце. Telomerase Превалируют два постулата, связанные с фенотипом старения: (a) Репликативное старение ассоциирует с укорочением теломер, и (b) экспрессия p53 ассоциирует со старением. Феномен репликативного старения, который ограничивает клеточную митотическую активность вознкает в связи с укорочением теломер. Теломераза является клеточной transcriptase, которая противодействует началу репликативного старения путем сохранения теломер (144). По этой причине длина теломер может служить в качестве "mitotic clock", которые уменьшаются с каждым клеточным делением до тех пор, пока теломера становится критически укороченной и возникает хромосомная нестабильность (145, 146). Как и мыши, постоянно экспрессирующие активный p53, telomerase-дефицитные мыши также обнаруживают некоторые фенотипические изменения, согласующиеся с преждевременным старением (147). Управляемое теломерами старение может быть частью системы, вовлеченной в ограничение опухолевого роста (148). Высокий уровень теломеразной активности во многих раковых клетках человека согласуется с этим постулатом. В миокарде крыс укорочение теломер увеличивается с возрастом в подгруппе миоцитов, указывая тем самым, что некоторые кардиомиоциты реплицировали хроматин в течение всей жизни с пониженой теломеразной активностью у взрослых (149). Недавно внимание было обращено на роль теломеразы в примитивных клетках и в пролиферации, выживаемости кардиомиоцитов и репарации миокарда (Figure 3). Экспрессия теломеразы снижается после рождения в ходе постнатального развития (150) и старения, но сохраняется в течение всей жизни с зависимыми от пола различиями в активности (151). Экспрессия теломеразы, колокализуемая в ядрах делящихся миоцитов, идентифицируется с помощью иммуноокрашивания Ki67, маркера делящихся клеток (142). Повышенная экспрессия теломеразы в инфарктном миокарде способствует сохранению длины теломер и делает возможной дальнейшую пролиферацию миоцитов. Пролиферация миоцитов бесспорно сопровождает также избыточную экспрессию теломеразы in vivo, приводя к постнатальному гиперпластическому фенотипу сердца у трансгенных мышей (152). Сердца у таких трансгенных избыточно экспрессирующих теломеразу мышей резистентны также к апоптическим повреждениям; однако, форсирование экспрессии теломеразы до аномально высоких уровней индуцирует нежелательное гипертрофическое ремоделирование и in vivo и in vitro. Напротив, элиминация теломеразы у нокаутных мышей вызывает диляционную (dilated) кардиомиопатию, усиление апоптоза, снижение клеточной пролиферации и усиление экспрессии p53 (143). Все эти наблюдения подтверждают, что в нормальных условиях активность теломеразы необходима для нормальной пролиферации миоцитов и для поддержания структуры и функции сердца. Повышение активности теломеразы может также происходить в поврежденном или старом миокарде, чтобы повысить репаративные процессы, но потеря активности теломеразы ускоряет преждевременное старение и снижает функцию сердца. p53 Изменения в уровне экспрессии белка, ДНК-связывающей активности и состоянии фосфорилирования p53 характеризуют состояние старения (153, 154). Мыши, экспрессирующие мутации, вызывающие активацию p53, обнаруживают раннее появление фенотипов, ассоциированных со старением (155). В отношении миокарда, экспрессия p53 повышена при сердечной недостаточности (156), ischemia-reperfusion повреждениях (157) и правостороннем повышенном давлении (pressure overload) (158). Изолированные кардиомиоциты, подвергнутые воздействию гипоксии накапливают p53, а аденовирусная избыточная экспрессия p53 индуцирует апоптоз (159), подчеркивая точку зрения, что p53-обусловленные эффекты м. пересекать границы от старения к апоптозу клеток при определенных условиях. p53 ответственен также за апоптоз культивируемых кардиомиоцитов в ответ на механические усилия натяжения (stretch) (160). Динамическая регуляция p53 осуществляется посредством взаимодействия с Akt (известной также как protein kinase B) как показано на Рис. 4. В отношении p53, конфликтующие сигналы, передаваемые с помощью Akt (serine/threonine kinase, которая способствует выживаемости клеток) и p53 интегрируются посредством негативной петли обратной связи между двумя путями. В частности, проапоптическая стимуляция ведет к p53-зависимой деструкции Akt, в то время как активация Akt с помощью стимуляции сывороткой ведет к ингибированию p53 (161-163). Akt-зависимое подавление p53 обеспечивается в первую очередь посредством действия Mdm2 (164, 165). Akt фосфорилирует Mdm2, которая затем вступает (или остается внутри) в ядро, соединяется с и блокирует транскрипционный домен p53, покидает ядро в виде p53/Mdm2 комплекса и направляет p53 на деградацию. Напротив, протеин фосфатаза PTEN супрессирует активность Akt, тем самым защищает p53 от Mdm2 (166, 167). Инактивация PTEN ведет к кардиальной гипертрофии, обеспечиваемой посредством PI3-K, участвующей в активации Akt в балансе, обеспечиваемом с помощью передачи сигналов PTEN (168). Состояние этой сигнальной сети предопределяет судьбу клеток выживать и/или вступать в апоптоз и старение или гипертрофию. Механизм индукции старения или апоптоза с помощью p53 остается неизвестным, но имеющиеся доказательства указывают на то, что вовлечение p53 запускается с помощью укорочения теломер, ассоциированного со снижением репликативной способности стареющих клеток (25). ANTAGONIZING MYOCARDIAL AGING WITH AKT Старение ассоциирует с повышенным клеточным старением, апоптозом и повышенным p53, пониженной теломеразой и потерей локальной IGF-1/IGF-1 рецепторной системы в миокарде, которая управляет активацией Akt (169). Ассоциированная с возрастом потеря активности Akt обнаруживается в стареющих первичных культурах кардиальных фибробластов (170) и в старых гепатоцитах (171). Стареющие миокардиальные клетки обнаруживают депрессию передачи анти-апоптических сигналов, что может объяснить повышенную чувствительность к повреждениям и гибели (22). Активация Akt связана с регуляцией клеточного цикла, с ингибированием Akt ведущим к похожему на старение аресту (172) и активации, способствующей к переходу от G2 к M фазе клеточного цикла (173). Повышение активации Akt увеличивает репликативную продолжительность жизни сателлитных клеток скелетных мышц in vitro (174). Akt способствует росту и жизнеспособности популяции стволовых клеток эритроидных предшественников (175) и примордиальных зародышевых клеток (176). Фактически, повышенная активация Akt при сердечной недостаточности может быть компенсаторной в попытке обеспечить жизнеспособность, хотя и слишком поздно, чтобы восстановить сердце (177). Т.о., Akt может способствовать экспансии стволовых клеток и клеточной регенерации в дополнение к противодействию старению и апоптозу. Изучение миокардиальной Akt биологии дало неожиданную информацию, но также выявило камень преткновения, который вызвал крушение экспериментальной стратегии, предназначено, чтобы ингибировать патогенез путем усиления активации Akt и усиления клеточной жизнеспособности. Кардиальное развитие и рост зависят от активации Akt во время развития ранних кардиомиоцитов (178) и постнатального кардиального роста (179, 180). Эти способствующие росту эффекты Akt были очевидны у трансгенных мышей, созданных для сердце-специфической экспрессии постоянно активной Akt, которые вызывали увеличенные гипертрофические или с недостаточностью сердца (181). Гипертрофические эффекты были связаны с гиперконтрактильностью (182), сходной с эффектом, наблюдаемым вследствие инактивации PTEN phosphatase, негативного регулятора активности Akt (168). Т.о. потенциал Akt в пользу миокарда за счёт противодействия гибели и старению клеток остается невыполненным Подчеркивается благоприятный эффект IGF-1 на миокард, который индуцирует транслокацию Akt киназы, поэтому мы создали nuclear-targeted Akt (Akt/nuc) конструкцию. Сердца у Akt/nuc трансгенных животных отличались от таковых у др. cardiac-targeted Akt трансгенных животных следующими уникальными свойствами: отсутствием повреждающего ремоделирования, гипердинамичным действием, резистентностью к патологическому инсульту, к singular профилю генной экспрессии и экспансией их популяции клеток кардиальных предшественников. Стимулирующие эффекты Akt на активность теломеразы и ход клеточного цикла возможно объясняют увеличение количества кардиомиоцитов, меченных Ki67 антителами, которые идентифицируют делящиеся клетки (107). Отсутствуют сообщения о Ki67-позитивных клетках, которые не делятся. Akt/nuc мыши обладают в 1.7-раз большим количеством Ki67C клеток по сравнению с не трансгенным контролем (1.54 § 0.19 против 0.92 § 0.14, соотв.; p · 0.005). Akt/nuc мыши обладают в 2.2-раза большими c-kitC/®-sarcomeric actinC клетками по сравнению с не трансгенным контролем (59 § 7 против 27 § 8 per 100 mm2, соотв.; p D 0.005). Более того, c-kitC/myc-tagC клетки также были найдены на срезах от Akt/nuc мышей. Такие клетки представляют переходное состояние между состоянием предшественников и детерминированными миоцитами, экспрессирующими промотор тяжелой цепи ®-myosin, который управляет экспрессией трансгена Akt/nuc. Ранняя экспрессия трансгена м. дать объяснение потенциирующего эффекта Akt/nuc на популяцию клеток предшественников путем усиления пролиферации и жизнеспособности. Эти разные предварительные результаты дают строгое подтверждение предположению, что Akt/nuc противодействует старению миокарда на молекулярном, клеточном и структурном уровне. CONCLUSIONS This review questions the old paradigm of cardiac growth in the adult heart viewed as the consequence of myocyte hypertrophy only. Accumulating evidence supports the notion that a stem cell pool resides in the heart and that tissue regeneration occurs by activation, mobilization, and lineage commitment of these primitive cells. Understanding the mechanisms controlling the translocation, multiplication, and differentiation of cardiac stem cells, as illustrated by manipulation of the Akt signaling cascade, could promote novel approaches for the repair of the damaged heart. This is a major challenge that several laboratories have taken in the past few years and will aggressively pursue during the next decade in order to improve the currently devastating outcome of heart failure of ischemic and nonischemic origin in the old heart.

Сохранение структуры и функции стареющего миокарда скорее всего может оказаться успешным посредством использования репарации и замещения с помощью клеток, благодаря выживанию существующих кардиомиоцитов. Противоречивые ранее находки плюрипотентных предшественников, принимающих кардиальные фенотипы, теперь общеприняты и центром сегодняшних споров является эффективность внесения клеток предшественников в миокард. Ещё многое предстоит сделать в определении подходящей популяции клеток предшественников и для оптимизации условий для эффективной дифференцировки и интеграции. Важно их использование для патологически поврежденного или стареющего миокарда, безусловно будущие подходы будут базироваться на использовании кардиальных стволовых клеток в качестве терапевтических агентов.

Главная функция сердца, заключающаяся в создании сил для перекачки крови, зависит от координированного сокращения кардиальных миоцитов. Приблизительно 5 биллионов миоцитов содержится в нормальном левом желудочке человека (1), однако, эта популяция клеток с возрастом уменьшается за счет внешних и внутренних факторов. Кардиомиопатическая недостаточность и старение клеток с возрастом ведут к старению миокарда со снижением гемодинамики и уменьшением сократительных резервов (2-10). Часто эти функциональные нарушения ведут к структурному ремоделированию, заканчивающемуся инфарктом. Старый миокард наиболее чувствителен к повреждениям вследствие патологических инсультов, таких как реперфузионные повреждения (11). Сердечная недостаточность остается ведущей причиной болезненности и смертности в индустриальном мире. Современные вмешательства не способны лечить лежащие в основе дефекты: кардиомиоциты, которые не замещаются и снижение функции оставшихся клеток.

AGING, SENESCENCE, AND STEM CELL REGENERATION

Изменения генов, среды и вероятностные изменения, все они вносят вклад в продолжительность жизни организма (12, 13). Внешние и внутренние факторы кооперируют в детерминации скорости старения и старческого фенотипа (14, 15). Генетические искусственно созданные модели старения и преждевременных синдромов старения у человека, вызываемые генетическими мутациями, указывают на то. что старение, по крайней мере, частично контролируется генетически (16-18). Несмотря на присутствие системных часов, которые регулируют старение организма как целого, органы стареют с др. скоростью. Напр., при progeroid синдромах, при которых одна и та же генетическая мутация проявляется во всех клетках организма, но имеет разные последствия для разных органов (18). ЦНС и иммунная система не затрагиваются болезнью в течение длительного времени, тогда как др. органы тяжело нарушены уже в раннем возрасте (19, 20).

Гибель кардиомиоцитов непонятным оразом связана с нормальным жизненным циклом структуры и функции миокарда (21). Апоптоз кардиомиоцитов не считается больше спорным, а накапливающиеся данные подтверждают важную роль апоптоза, по крайней мере, при некоторых кардиомиопатических заболеваниях. Ускорение клеточной гибели при старении миокарда (22) было предположено в качестве механизма понижения гемодинамической эффективности повышенного риска сердечной недостаточности у пожилых (23, 24). Считается, что кардиомиоциты не замещаются и что накапливающаяся потеря этих клеток в результате патологических инсультов или старения нарушает сократительную способность сердца. Параллельно стареющие миоциты накапливают маркеры клеточного старения, которые обычно появляются вблизи конца клеточного периода жизни. Клеточное старение является сложным фенотипом, который влечет за собой изменения как функции, так и способности к репликации. В отличие от апоптоза, который элиминирует поврежденные клетки из ткани, стареющие клетки остаются жизнеспособными несмотря на изменения в морфологии, метаболизме и расстройство дифференцированных функций (25). В этом смысле, было предположено, что старение вносит вклад в износ клеточных функций при старении.

Накопление стареющих кардиомиоцитов сказывается на структуре и функции миокарда. Снижение контрактильной способности является результатом изменений на молекулярном уровне в экспрессии изоформ контрактильных белков и изменения уровней белков, связанных с использованием кальция (rev. 26). Нарушение использования кальция в стареющих миоцитах (27, 28) неизбежно ведет к реактивной гипертрофии, которая увеличивает объем клеток без соотв. увеличения контрактильности (29). Старые кардиомиоциты вносят вклад в недостаточность сердца не только из-за ослабления функции, но также из-за неадекватного скорее, чем адаптивного ремоделирования. Пролиферация ядер миоцитов, увеличение объема миоцитов и накопление соединительной ткани являются основными детерминантами ремоделирования гипертрофического стареющего миокарда (30). Увеличенные кардиомиоциты не способны к гипертрофии и пролиферации, экспрессируют ингибиторы клеточного цикла и не могут транскрипционно репрограммироваться в ответ на увеличение рабочей нагрузки (31, 32). Старение также увеличивает напряжение стенок, что не нормализуется за счет ремоделирования желудочков (33), и способность к адаптивному ремоделированию миокарда теряется у старых пациентов (34).

Старение является гетерогенным процессом. Изучение старения просто у одноклеточных организмов, у которых старение всего тела отражает старение его единственной клетки (35). Если оцениваются более сложные организмы, то корреляцию между клеточным старением, старением тканей или органов и старением организма установить нелегко. Однако, эукариотические клетки стареют индивидуально in vitro и in vivo, как у простых, так и с сложных организмов (36, 37). Независимая продолжительность жизни каждой клетки указывает на то, что главный компонент старения находится на клеточном уровне и что ключевой вопрос о старении должен решаться на этом же уровне. Скорость старения органа сильно зависит от темпа клеточно-автономного процесса, приводящего в результате к накоплению старых клеток с нарушенными функциями (37). Это накопление, с вою очередь, связано со снижением способности органа замещать старые клетки лучше функционирующими боле молодыми клетками. Следовательно, старение сердца предопределяется на уровне контроля клеток, т.е. cardiac stem cell (CSC).

THE NEWPARADIGM OF MYOCARDIAL CELLULAR REPLICATION

Широко бытует мнение, что кардиомиоциты неспособны к регенерации, исходя из отсутствия доказательств противоположного: непрерывные клеточные линии кардиомиоцитов с высоко дифференцированными свойствами не могут быть получены, цитокинез взрослых кардиомиоцитов довольно редок и попытки заставить взрослые кардиомиоциты вступить повторно в клеточный цикл безуспешны. Более того, нормальные сердца после патологических инсультов остаются скорее с нерепарированными повреждениями. Хотя эти неоспоримые наблюдения и верны, однако имеются анекдотические доказательства, делающие вызов status quo (38, 39). Мы не будем углубляться в этот вопрос, см rev. (40). Короче морфометрический анализ показал, что количество миоцитов увеличивается от рождения до юношеского возраста у грызунов и человека (38). Использование цитологических и биохимических маркеров клеточного цикла и синтеза ДНК в миокарде выявило частоту репликации кардиомиоцитов до сих пор не ожидаемую и потребовало дальнейших исследований о происхождении этих клеток, происходят ли они от существующих миоцитов или из популяции предшественников кардиомиоцитов, ранее обозначенных как кардиальные стволовые клетки [породивших жаркие дебаты (41-43)]. Этот потребовало переоценки и регенерации и сохранения навсегда кардиоцитов в ходе жизни (Figure 1).

Главный сдвиг пардигмы был вызван открытием стволовых клеток, способных дифференцироваться в три основные типа клеток миокарда: гладкомышечные, эндотелиальные и кардиомиоциты. Подтверждение этого наблюдения получено независимо многими лабораториями по всему миру (44-46). Несмотря на недавние диспуты относительно частоты (47-49), превалирующим мнением стало, что такие события трансдифференцировки происходят, В течение последних двух лет совместные усилия нескольких групп продемонстрировали интеграцию стволовых клеток в интактном сердце (50-53). Некоторые исследования наблюдали ре-популяцию поврежденного миокарда стволовыми клетками, происходящими из костного мозга, это приводило к улучшению гемодинамической функции (54-57). Т.о., больше не возникает вопроса, может ли происходить замещение кардиомиоцитов, а скорее, каковы характеристики популяции предшественников, сколь эффективно могут такие клетки интегрироваться в функционирующий миокард и допускает ли процесс манипуляции с помощью генетических или биохимических техник, чтобы усиливать регенеративные свойства этих клеток ?

Большинство современных споров о кардиальных стволовых клетках касается вопроса о частоте и эффективности интеграции и дифференцировки стволовых клеток в ткань миокарда (58, 59). Во-первых, оценки широко варьируют в отношении способности жертвенных клеток выживать и затем интегрировать в ткани хозяина. Во-вторых, возникает скептицизм относительно слияния между жертвенными клетками и адаптирующей тканью хозяина для создания клеточного химеризма, который мог бы рассматриваться как интеграция (60-64). В-третьих, возникает вопрос, могут ли жертвенные (donated) стволовые клетки способствовать рекрутированию эндогенных предшественников, которые бы помогали регенерации. В-четвертых, влияние эндогенных факторов, таких как цитокины, факторы роста или локальная клеточная среда на стволовые клетки, остается полностью неизученным. Разрешение этого ключевого вопроса в конце концов определит эффективность и пригодность терапии стволовыми клетками в качестве вмешательства для репарации поврежденного или функционально недостаточного миокарда. Все согласны, что улучшение трафика, жизнеспособности и интеграции стволовых клеток в миокард приведет в конечном итоге к огромным успехам в лечении болезней сердца и в улучшении функции стареющего сердца.

STEM CELL POPULATION CHARACTERISTICS

Markers

Стволовые клетки определяются как клоногенные клетки, способные к самообновлению и дифференцировке во множественные клоны (65, 66). Стволовые клетки дают олигоклональных предшественников, которые теряют свойство самообновления, дают потомство с ограниченным потенциалом дифференцировки. Окончательная судьба потомства это генерация функционально компетентных зрелых клеток (65). Эта модель клеточного роста идентифицирована только в гематопоэтической системе. Однако, это обычно приписывается все самообновляющимся органам. Недавние наблюдения, сделанные в нашей лаб., показали, что сердце обладает субпопуляцией клеток, которые обладаю функциональными характеристиками стволовых клеток (59, 67). Эти недифференцированные клетки являются клоногенными, самообновляющимися и плоюрипотентными. На базе in vitro и in vivo результатов было идентифицировано 3 класса CSCs: c-kit, MDR1 и Sca-1-like-позитивные клетки (59). Эти поверхностные антигены, обычно присутствуют в hematopoietic stem cells (HSCs), они были выявлены в CSCs независимо или в комбинации. Хотя c-kit позитивные клетки могут расти и дифференцироваться в различные кардиальные клоны (67), неизвестно, обладают ли MDR1 и Sca-1-like-позитивные клетки таким же потенциалом. Экспрессия MDR1 и способность исключать краску Hoechst предопределяет небольшую группу HSCs, называемых побочной популяцией, в костном мозге (68, 69) и скелетных мышцах (70, 71). MDR1POS клетки в костном мозге дают миэлоидный, лимфоидный и эритроидный клон клеток (68,69, 72, 73), тогда как в скелетных мышцах они регенерируют мышечные волокна (74). Кроме того, MDR1POS клетки из скелетных мышц происходят из костного мозга и могут снова засевать деплетированный костный мозг (75). Предварительные результаты in vivo у людей (59, 76) и у животных моделей (77, 78) показали, что MDR1POS клетки дифференцируются в родоначальников и предшественников миоцитов, эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и фибробластов. Сходный паттерн роста распознан in vitro с помощью дифференцировки клоногенных клеток. Sca-1-подобный белок, маркер стволовых клеток, найден с помощью конфокальной микроскопии в не дифференцированных клетках кардиальной ткани мышей (78), крыс (79), собак (80) и свиней (P.Anversa, unpublished observation) и в сердце людей (59, 76, 79). Sca-1-подобный белок выявлен не только в стволовых клетках, но и также на поверхности эндотелиальных клеток (76, 78), указывая тем самым, что этот антиген может быть особенно чувствительным к ростовым факторам, активным в генерации сосудистых структур. MDR1POS клетки дифференцируются в скелетно-мышечные клетки (74), и эта преимущественная клональная детерминация подчеркивает более значительный потенциал для форсирования кардиальных миоцитов. Большинство мощных регенерирующих клеток сердца могут быть теми, что экспрессируют c-kit и MDR1. Эта группа клеток может делиться и дифференцироваться в миоциты и coronary-resistance артериолы и капиллярные профили, важные для продукции миокарда de novo. Дифференциальная экспрессия антигенов поверхности стволовых клеток может давать в результате самостоятельный клеточный рост и детерминацию клонов, ведущую к преимущественному образованию миоцитов, коронарных сосудов или их комбинации.

Additional Phenotypic Characteristics

Мы установили, сердца взрослых крыс содержат популяцию недифференцированных клеток, которые экспрессируют поверхностные антигены, обычно обнаруживаемые в HSCs (65, 72, 81, 82): c-kit, MDR1 и Sca-1 (77, 78, 83, 84). Сходные результаты были получены у собак (80), свиней (P. Anversa, unpublished results) и что более важно в сердце человека (59, 76; P. Anversa, unpublished observation). Ограниченный пул клеток, позитивный по Sca-1-like эпитопу (59, 76) был идентифицирован с использованием антител против мышиного белка Ly6A/E (76, 77). Клетки с идентичным фенотипом были выявлены в нормальном костном мозге человека, которые также были позитивными по белку c-kit и Sca-1-like (P. Anversa, unpublished observation). Клон-негативные, c-kit-позитивные (Lin-/-kitPOS) были получены из сердца крыс, они были саом-обновляющимися, клоногенными и плюрипотентными (67). Одиночные клоногенные клетки были способны дифференцироваться в миоциты, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и фибробласты. Т.о., CSCs могут давать все компоенты миокарда. CSCs были изолированы из миокарда и получены долговременные культуры (67). Т.о., только Lin-/-kitPOS клетки, как было покзано, оладают тремя компонентами стволовых клеток: само-обновлением, клоногенностью и множественным потенциалом. Свойства MDR1 и Sca-1-like-позитивных клеток не были определены. In vitro, Lin-/-kitPOS клетки росли в виде монослоя, когда засевались на чашки, покрытые субстратом, или формировали сфероиды, если культивировались в суспензии, воспроизводя биологию нейральных стволовых клеток (67, 86). In vivo, CSCs, имплантированные в инфарктный желудочек, или мобилизованные из места хранения в мертвый миокард (77, 87) мигрируют, внедряются, подвергаются мультиклональной детерминации и способствуют кардиальной регенерации. Т.о., CSCs существуют, но их распределение и характеристики роста в разных областях сердца неизвестны.

NICHES Различия в микроусловиях и механических силах присутствуют в анатомических частях сердца. Эти переменные могут играть критическую роль в предписании функции и судьбы CSCs. Эта информация важна для понимания эффектов структурных и физических факторов на поведение CSCs в сердце взрослого (Figure 2). Стволовые клетки обычно находят приют в специализированных структурах, т.наз. нишах, концепция предложена в 1978 Schofield, определяется как "стабильные микроусловия, которые могут контролировать поведение гематопоэтических стволовых клеток" (88). Недавно ниши стали рассматривать как "как субнабор тканевых клеток и внеклеточных субстратов, которые могут до бесконечности давать кров одной или более стволовым клеткам и контролировать из самообновление и продукцию потомства in vivo" (89). Ниши стволовых клеток, создают микроусловия, предназначенные сохранять потенциал жизнеспособности и репликации стволовых клеток (89). Примитивные клетки делятся редко и те, что вносят вклад в нишу имеют более высокую вероятность само-обновления (89). Ниши присутствуют во всех само-обновляющихся органах (90-92). Предварительные результаты показали, что CSCs сохраняются в нишах, которые преимущественно локализуются в предсердии и верхушке (apex), но обнаруживаются также и в желудочках (77,93, 94). Специфической топографическое распределение CSCs в сердце подтверждает, что могут существовать взаимоотношения между функцией CSCs и уровнем гемодинамических стрессов. CSCs накапливаются в нишах, находящихся в предсердиях и апексе, которые являются анатомическими областями, подверженным низким уровням стрессов на стенку. Предпочтительная локализация CSCs в зонах, где физические силы скромные, согласуется с обычными сайтами хранения стволовых клеток в само-обновляющихся органах (89-91): CSCs занимают наиболее защищенные области сердца.

RECEPTORS AND PARACRINE FACTORS CSCs экспрессируют два поверхностных рецептора: c-Met и IGF-1R (77). c-Met является рецептором для human growth factor (HGF), а insulin-like growth factor (IGF)-1R является рецептором для IGF-1. Системы HGF-cMet и IGF-1-IGF-1R присутствуют в CSCs мышей, крыс и собак. Связывание c-Met рецептором способствует инвазии примитивных клеток in vitro и in vivo (77, 87, 95,96). IGF-1 не обладает свойствами локомоции in vitro и in vivo (77), но участвует в клеточном росте и дифференцировке (77, 87, 95-98). IGF-1 активирует IGF-1R, это приводит в результате к транслокации Akt в ядро и тем самым способствует клеточной жизнеспособности (99, 100). HGF также предупреждает гибель клеток посредством PI3-K/Akt пути (101, 102). c-Met соединяется непосредственно с death рецептором Fas, блокируя Fas-обусловленный апоптоз (103). Наконец, HGF защищает миоциты от апоптоза, обусловленного реактивным O₂ (104). HGF и IGF-1 синтезируются в CSCs, родоначальниках и предшественниках и могут модулировать поведение, жизнеспособность и функцию CSC. Система IGF-1-IGF-1R играет позитивную роль в миграции клеток. Транслокация клеток, обеспечиваемая HGF, характеризуется клеточным делением, если присутствует IGF-1 вместе с мечением ядерных белков, участвующих в клеточном цикле (напр., Cdc6, MCM5 и Ki67), а также маркеров репликации ДНК (BrdU и mitosis) (38, 105-112). Т.о., IGF-1 является мощным митогеном для примитивных и ранних детерминированных клеток в сердце, а HGF является столь же мощным в стимулировании движения тех же самых клеток к областям мишеней внутри миокарда. Старение миокарда характеризуется снижением экспрессии IGF-1 и IGF-1R в миоцитах (113) и это ослабление системы IGF-1-IGF-1R может также затрагивать и CSCs и ранние детерминированные клетки. Предварительные результаты согласуются с возможностью, что и HGF-c-Met и IGF-1-IGF-1R системы подавляются с возрастом в CSCs.

SENESCENCE IN THE AGING MYOCARDIUM

Mechanisms

Существуют три возможности, связанные с дефицитом регенерации в миокарде с возрастом: (a) CSC рост и дифференцировка с возрастом ослабляется; это мнение предполагает, что CSCs являются субъектом эффектов как и др. клетки миокарда. (b) Способность CSCs мигрировать в старом сердце снижена; это указывает на то, что старые CSCs не реагируют, точно также как молодые CSCs, на ростовые факторы, способствующие их активации и транслокации. (c) Количество функционально компетентных CSCs снижается с возрастом благодаря аресту роста, апоптической и/или некротической гибели старых CSCs; потому, что происходит ослабление факторов жизнеспособности в стареющих CSCs.

Согласно догме, стволовые клетки обладают неограниченной способностью к само-обновлению или способностью замещать самих себя, которая превышает продолжительность жизни органа или организма (114, 115). Само-обновляющеся, плюрипотентные и клоногенные клетки д. избегать разрушительных эффектов времени и вредных изменений, ассоциированных с возрастом и старением. Стволовые клетки были интерпретированы как источник молодости и рассматривались как бессмертные, считалось, что они прекрасно экипированы против всех форм эффектов старения. Однако, это не так в случае с костным мозгом (116-118) и не так в случае с сердцем. Примитивные клетки, позитивные по p16INK4a, были выявлены в сердце пациентов с сердечной декомпенсацией и признаками преждевременного старения органов.

Апоптоз c-kit-позитивных недифференцированных клеток был очень высоким в этих стареющих сердцах и всегда был ассоциирован с экспрессией p16INK4a (119). Фракция cycling предполагаемых CSCs увеличивается; этот феномен согласуется с результатами для костного мозга (114). Апоптоз и некроз миоцитов доказан у молодых взрослых Fischer 344 крыс (38, 120, 121) и FVB мышей (122) и он увеличивается с возрастом. Гипертрофия и репликация миоцитов стремятся сохранить мышечную массу и функцию, которые ухудшаются у старых животных (123, 124). Со временем деления миоцитов составляют превалирующую форму реактивного роста (79), тогда как гипертрофия миоцитов снижается (32, 113). Умножение миоцитов, однако, недостаточно, чтобы поддержать количество клеток и работу желудочков. Расширение полости, понижение соотношения вентрикулярной массы к объему камер, повышенные стрессы на стенки и нарушение механического поведения миоцитов становятся очевидными в старом сердце и это приводит к сердечной недостаточности (38, 121, 124). Т.о., активация старых CSCs происходит в ограниченных количествах перед клеточным старением и арест роста можно наблюдать как процесс лежащий в основе старения сердца. Зависимая от времени редукция обновления CSC д. соответствовать повышенной детерминации клонов CSC, истощению атриальных и апикальных ниш, что ведет к клеточному старению, характеризующемуся потерей способности к репликации в ответ на избирательные альтерации в специализированных функциях регуляции клеточного цикла (125, 126). В частности, репликативное старение соответствует необратимому блоку клеточного цикла в G0/G1, запускаемому за счет интегрированного действия p53/p21/p19 и p16/Rb путей (127, 128). Эта фаза жизнеспособного ареста клеточного цикла сопровождается различными изменениями в клеточной физиологии, морфологии и экспрессии генов (129). Открытие, что теломеры укорачиваются с каждым клеточным умножением in vitro подтверждает механизм, с помощью которого клетки д. ощущать своё собственное старение.

Миграция, пролиферация и дифференцировка некоторых типов клеток, включая и стволовые, модулируется интегринами (87, 130), которые являются трансмембранными гликопротеиновыми гетеродимерами, состоящими из одной α и одной β цепи (131, 132). Эти адгезивные рецепторы взаимодействуют с компонентами внеклеточного матрикса, это приводит к реорганизации цитоскелета и трансдукции сигналов от интерстициума во внутриклеточный компартмент (133). HGF стимулирует экспрессию, функцию и распределение в клеточной мембране специфических классов интегринов (87, 133-137). c-Met, который присутствует на CSCs и молодых детерминированных клетках (87), формирует комплексы с α6β4 интегриновым рецептором, который активируется с помощью своего лиганда плазматического фибронектина, усиливающего инвазивные свойства c-Met-позитивных клеток (136,137). Активация интегриновых рецепторов на CSCs может инициировать миграторный путь, использующий фосфорилирование FAK и paxillin и их физическую ассоциацию (130, 133, 138-140). Кроме того, phospho-FAK активирует PI3-kinase-Akt путь выживаемости (141), ещё больше усиливая клеточную жизнеспособность. Наконец, phospho-Akt усиливает экспрессию и активность теломеразы в миоцитах (122), и сходная функция может осуществляться в примитивных и клон-детерминированных клетках. Активность теломеразы усиливает рост и выживаемость миоцитов (142, 143). Эти пути клеточной миграции могут составлять часть молекулярного механизма, ответственного за транслокацию репарирующих клеток в поврежденное сердце.

Telomerase

Превалируют два постулата, связанные с фенотипом старения: (a) Репликативное старение ассоциирует с укорочением теломер, и (b) экспрессия p53 ассоциирует со старением. Феномен репликативного старения, который ограничивает клеточную митотическую активность вознкает в связи с укорочением теломер. Теломераза является клеточной transcriptase, которая противодействует началу репликативного старения путем сохранения теломер (144). По этой причине длина теломер может служить в качестве "mitotic clock", которые уменьшаются с каждым клеточным делением до тех пор, пока теломера становится критически укороченной и возникает хромосомная нестабильность (145, 146). Как и мыши, постоянно экспрессирующие активный p53, telomerase-дефицитные мыши также обнаруживают некоторые фенотипические изменения, согласующиеся с преждевременным старением (147). Управляемое теломерами старение может быть частью системы, вовлеченной в ограничение опухолевого роста (148). Высокий уровень теломеразной активности во многих раковых клетках человека согласуется с этим постулатом. В миокарде крыс укорочение теломер увеличивается с возрастом в подгруппе миоцитов, указывая тем самым, что некоторые кардиомиоциты реплицировали хроматин в течение всей жизни с пониженой теломеразной активностью у взрослых (149). Недавно внимание было обращено на роль теломеразы в примитивных клетках и в пролиферации, выживаемости кардиомиоцитов и репарации миокарда (Figure 3). Экспрессия теломеразы снижается после рождения в ходе постнатального развития (150) и старения, но сохраняется в течение всей жизни с зависимыми от пола различиями в активности (151). Экспрессия теломеразы, колокализуемая в ядрах делящихся миоцитов, идентифицируется с помощью иммуноокрашивания Ki67, маркера делящихся клеток (142). Повышенная экспрессия теломеразы в инфарктном миокарде способствует сохранению длины теломер и делает возможной дальнейшую пролиферацию миоцитов. Пролиферация миоцитов бесспорно сопровождает также избыточную экспрессию теломеразы in vivo, приводя к постнатальному гиперпластическому фенотипу сердца у трансгенных мышей (152). Сердца у таких трансгенных избыточно экспрессирующих теломеразу мышей резистентны также к апоптическим повреждениям; однако, форсирование экспрессии теломеразы до аномально высоких уровней индуцирует нежелательное гипертрофическое ремоделирование и in vivo и in vitro. Напротив, элиминация теломеразы у нокаутных мышей вызывает диляционную (dilated) кардиомиопатию, усиление апоптоза, снижение клеточной пролиферации и усиление экспрессии p53 (143). Все эти наблюдения подтверждают, что в нормальных условиях активность теломеразы необходима для нормальной пролиферации миоцитов и для поддержания структуры и функции сердца. Повышение активности теломеразы может также происходить в поврежденном или старом миокарде, чтобы повысить репаративные процессы, но потеря активности теломеразы ускоряет преждевременное старение и снижает функцию сердца.

p53

Изменения в уровне экспрессии белка, ДНК-связывающей активности и состоянии фосфорилирования p53 характеризуют состояние старения (153, 154). Мыши, экспрессирующие мутации, вызывающие активацию p53, обнаруживают раннее появление фенотипов, ассоциированных со старением (155). В отношении миокарда, экспрессия p53 повышена при сердечной недостаточности (156), ischemia-reperfusion повреждениях (157) и правостороннем повышенном давлении (pressure overload) (158). Изолированные кардиомиоциты, подвергнутые воздействию гипоксии накапливают p53, а аденовирусная избыточная экспрессия p53 индуцирует апоптоз (159), подчеркивая точку зрения, что p53-обусловленные эффекты м. пересекать границы от старения к апоптозу клеток при определенных условиях. p53 ответственен также за апоптоз культивируемых кардиомиоцитов в ответ на механические усилия натяжения (stretch) (160). Динамическая регуляция p53 осуществляется посредством взаимодействия с Akt (известной также как protein kinase B) как показано на Рис. 4. В отношении p53, конфликтующие сигналы, передаваемые с помощью Akt (serine/threonine kinase, которая способствует выживаемости клеток) и p53 интегрируются посредством негативной петли обратной связи между двумя путями. В частности, проапоптическая стимуляция ведет к p53-зависимой деструкции Akt, в то время как активация Akt с помощью стимуляции сывороткой ведет к ингибированию p53 (161-163). Akt-зависимое подавление p53 обеспечивается в первую очередь посредством действия Mdm2 (164, 165). Akt фосфорилирует Mdm2, которая затем вступает (или остается внутри) в ядро, соединяется с и блокирует транскрипционный домен p53, покидает ядро в виде p53/Mdm2 комплекса и направляет p53 на деградацию. Напротив, протеин фосфатаза PTEN супрессирует активность Akt, тем самым защищает p53 от Mdm2 (166, 167). Инактивация PTEN ведет к кардиальной гипертрофии, обеспечиваемой посредством PI3-K, участвующей в активации Akt в балансе, обеспечиваемом с помощью передачи сигналов PTEN (168). Состояние этой сигнальной сети предопределяет судьбу клеток выживать и/или вступать в апоптоз и старение или гипертрофию. Механизм индукции старения или апоптоза с помощью p53 остается неизвестным, но имеющиеся доказательства указывают на то, что вовлечение p53 запускается с помощью укорочения теломер, ассоциированного со снижением репликативной способности стареющих клеток (25).

ANTAGONIZING MYOCARDIAL AGING WITH AKT

Старение ассоциирует с повышенным клеточным старением, апоптозом и повышенным p53, пониженной теломеразой и потерей локальной IGF-1/IGF-1 рецепторной системы в миокарде, которая управляет активацией Akt (169). Ассоциированная с возрастом потеря активности Akt обнаруживается в стареющих первичных культурах кардиальных фибробластов (170) и в старых гепатоцитах (171). Стареющие миокардиальные клетки обнаруживают депрессию передачи анти-апоптических сигналов, что может объяснить повышенную чувствительность к повреждениям и гибели (22). Активация Akt связана с регуляцией клеточного цикла, с ингибированием Akt ведущим к похожему на старение аресту (172) и активации, способствующей к переходу от G2 к M фазе клеточного цикла (173). Повышение активации Akt увеличивает репликативную продолжительность жизни сателлитных клеток скелетных мышц in vitro (174). Akt способствует росту и жизнеспособности популяции стволовых клеток эритроидных предшественников (175) и примордиальных зародышевых клеток (176). Фактически, повышенная активация Akt при сердечной недостаточности может быть компенсаторной в попытке обеспечить жизнеспособность, хотя и слишком поздно, чтобы восстановить сердце (177). Т.о., Akt может способствовать экспансии стволовых клеток и клеточной регенерации в дополнение к противодействию старению и апоптозу.

Изучение миокардиальной Akt биологии дало неожиданную информацию, но также выявило камень преткновения, который вызвал крушение экспериментальной стратегии, предназначено, чтобы ингибировать патогенез путем усиления активации Akt и усиления клеточной жизнеспособности. Кардиальное развитие и рост зависят от активации Akt во время развития ранних кардиомиоцитов (178) и постнатального кардиального роста (179, 180). Эти способствующие росту эффекты Akt были очевидны у трансгенных мышей, созданных для сердце-специфической экспрессии постоянно активной Akt, которые вызывали увеличенные гипертрофические или с недостаточностью сердца (181). Гипертрофические эффекты были связаны с гиперконтрактильностью (182), сходной с эффектом, наблюдаемым вследствие инактивации PTEN phosphatase, негативного регулятора активности Akt (168). Т.о. потенциал Akt в пользу миокарда за счёт противодействия гибели и старению клеток остается невыполненным

Подчеркивается благоприятный эффект IGF-1 на миокард, который индуцирует транслокацию Akt киназы, поэтому мы создали nuclear-targeted Akt (Akt/nuc) конструкцию. Сердца у Akt/nuc трансгенных животных отличались от таковых у др. cardiac-targeted Akt трансгенных животных следующими уникальными свойствами: отсутствием повреждающего ремоделирования, гипердинамичным действием, резистентностью к патологическому инсульту, к singular профилю генной экспрессии и экспансией их популяции клеток кардиальных предшественников. Стимулирующие эффекты Akt на активность теломеразы и ход клеточного цикла возможно объясняют увеличение количества кардиомиоцитов, меченных Ki67 антителами, которые идентифицируют делящиеся клетки (107). Отсутствуют сообщения о Ki67-позитивных клетках, которые не делятся. Akt/nuc мыши обладают в 1.7-раз большим количеством Ki67C клеток по сравнению с не трансгенным контролем (1.54 § 0.19 против 0.92 § 0.14, соотв.; p · 0.005). Akt/nuc мыши обладают в 2.2-раза большими c-kitC/®-sarcomeric actinC клетками по сравнению с не трансгенным контролем (59 § 7 против 27 § 8 per 100 mm2, соотв.; p D 0.005). Более того, c-kitC/myc-tagC клетки также были найдены на срезах от Akt/nuc мышей. Такие клетки представляют переходное состояние между состоянием предшественников и детерминированными миоцитами, экспрессирующими промотор тяжелой цепи ®-myosin, который управляет экспрессией трансгена Akt/nuc. Ранняя экспрессия трансгена м. дать объяснение потенциирующего эффекта Akt/nuc на популяцию клеток предшественников путем усиления пролиферации и жизнеспособности. Эти разные предварительные результаты дают строгое подтверждение предположению, что Akt/nuc противодействует старению миокарда на молекулярном, клеточном и структурном уровне.

CONCLUSIONS

This review questions the old paradigm of cardiac growth in the adult heart viewed as the consequence of myocyte hypertrophy only. Accumulating evidence supports the notion that a stem cell pool resides in the heart and that tissue regeneration occurs by activation, mobilization, and lineage commitment of these primitive cells. Understanding the mechanisms controlling the translocation, multiplication, and differentiation of cardiac stem cells, as illustrated by manipulation of the Akt signaling cascade, could promote novel approaches for the repair of the damaged heart. This is a major challenge that several laboratories have taken in the past few years and will aggressively pursue during the next decade in order to improve the currently devastating outcome of heart failure of ischemic and nonischemic origin in the old heart.

MYOCARDIAL AGING AND SENESCENCE: Where Have the Stem Cells Gone?Mark A. Sussman, Piero Anversa Annu. Rev. Physiol. 2004. 66:29–48

MYOCARDIAL AGING AND SENESCENCE: Where Have the Stem Cells Gone?
Mark A. Sussman, Piero Anversa
Annu. Rev. Physiol. 2004. 66:29–48