Передача сигналов Notch играет эволюционно законсервированную роль в обеспечении межклеточных взаимодействий во многих отличающихся клеточных контекстах у развивающихся эмбрионов (Artavanis-Tsakonas et al., [1999]; Schweisguth, [2004]). В контексте латеральной ингибиции передача сигналов Notch облегчает конкурентные взаимодействия между клетками, причем клетка, которая воспринимает определенную судьбу, сигнализирует соседним клеткам, чтобы предостеречь их от принятия той же самой судьбы. В этом контексте, она позволяет соседним клеткам со сходным потенциалом воспринимать др. судьбу, регулируя тем самым разнообразие в развивающейся ткани. Передача сигналов Notch участвует также в формировании границ и морфогенезе, а в сомитогенезе передача сигналов Delta-Notch облегчает синхронизированные осцилляции экспрессии генов в пресомитной мезодерме (Pourquie, [2001]; Lewis, [2003]). Эти примеры иллюстрируют несколько отличающиеся роли передачи сигналов Notch в развитии и поддержании почти всех тканей. Нарушение передачи сигналов Notch ведет к патологическим последствиям и вносит вклад в развитие рака, опухолей и растущий список болезней, подобных синдрому Alagilles и CADASIL, которые затрагивают системы множественных органов (Hansson et al., [2004]; Lasky and Wu, [2005]).

Передача сигналов Notch (Lewis, [1996]; Schweisguth, [2004]), как известно, играет роль в обеспечении латеральной ингибиции во время нейрогенеза. У Drosophila, напр., нервные клетки отбираются из пронейральных кластеров, в которые все клетки первоначально приобретают потенциал воспринимать нервную судьбу благодаря экспрессии пронейральных basic helix-loop-helix (bHLH) транскрипционных факторов. Пронейральные транскрипционные факторы способствуют своей собственной экспрессии, а также управляют экспрессией Notch лиганда Delta. Delta взаимодействует со своим рецептором Notch на поверхности соедних клеток, а активация Notch управляет экспрессией bHLH Enhancer-of-split (E(spl)) транскрипционных факторов, который функционируют как репрессоры. Они ингибируют нейральную судьбу путем подавления транскрипции пронейральных факторов. Это простая петля обратной связи амплифицирует небольшие отличия потенциала для нейральной судьбы. В конечном итоге клетки, которые приобретают высокие уровни пронейральной функции отбираются для наделения их нейральной судьбой. Отобранные клетки наиболее эффективны в передаче Delta стгнала соседним клеткам, в которых активация Notch детерминирует альтернативную судьбу.

Notch рецепторы являются type I трансмембранными белками, которые обычно подвергаются Furin обеспечиваемому расщеплению (S1), а зрелый рецептор представляется в виде гетеродимера на плазматической мембране (Fig. 1) (Logeat et al., [1998]). Notch гетеродимер состоит из Notch Extracellular Domain (NECD), который соединяется calcium-зависимым способом с закрепленным в мембране фрагментом, который включает внеклеточный пенек, трансмембранный домен и внутриклеточный домен. NECD состоит из варьирующего числа Epidermal-Growth-Factor-like (EGF-like) повторов, которые существенны для возаимоедействия с DSL семейством Notch лигандов, названных по Delta и Serrate у Drosophila и Lag2 у C. elegans. DSL лиганды также являются I трансмембранными белками (Fleming, [1998]). Они имеют DSL законсервированный мотив во внеклеточном домене, который необходим для связывания Notch и как и у Notch, варьирующие количества EGF-подобных повторов. Внутриклеточный домен не законсервирован среди некоторых DSL лигандов, но имеет законсервированный мотив на С-конце, который обеспечивает взаимодействия с PDZ домен содержащими белками (Ascano et al., [2003]; Pfister et al., [2003]; Six et al., [2004]; Wright et al., [2004]). Кроме того, имеются предполагаемые законсервированные мотивы; однако, они детально не охарактеризованы.


Рис.1.  | Basic Notch signaling pathway. During maturation, Notch undergoes Furin-dependent S1 cleavage. Following interaction with Delta, Notch undergoes metalloprotease-dependent S2 cleavage. The Notch Extracellular Domain (NECD) is released and the Notch Extracellular Truncated (NEXT) fragment that remains is a substrate for a gamma-secretase complex that releases the Notch Intracellular Domain (NICD). NICD functions as a transcriptional activator in a complex with CSL proteins and Mastermind (MAM) to activate target hairy E(spl) related (her) genes.

Критической ступенью в пути передачи сигналов Notch является взаимодействие DSL лиганда с Notch, которое облегчает внеклеточное отщепление (S2) от прикрепленного к мембране фрагмента Notch с помощью трансмембранной протеазы семейства ADAM/TACE family (Mumm et al., [2000]). Это высвобождает NECD вместе с коротким отщепленным фрагментом прикрепленного к мембране фрагмента Notch. Notch Extracellular Truncated (NEXT) фрагмент, который остается связанным с плазматической мембраной, является постоянным субстратом для финального внутри-мембранного протеолитического расщепления (S3), обеспечиваемого с помощью gamma secretase complex (De Strooper et al., [1999]). Это высвобождает NICD домен в цитоплазму. Он транслоцируется в ядро, где функционирует в качестве транскрипционного активатора в комплексе с кофактором Mastermind и CSL DNA-binding factor (CBF1 у людей, Suppressor-of-Hairless (Su(H)) у Drosophila и Lag1 у C. elegans). Notch активаторный комплекс дестабилизирует базовую репрессию генов мишеней и управляет экспрессией мишеней, подобных E(spl) факторам, описанным выше.

Последовательность событий, описанных выше предопределяет вазовые элементы пути передачи сигналов Notch. В контексте латеральной ингибиции, он подчеркивает негативную петлю обратной связи активации Notch на пронейральные или родственные atonal bHLH гены и на экспрессию Delta. Однако, известно уже давно, что пространственно-временной паттерн экспрессии Delta не всегда согласуется с некоторыми простыми предсказаниями латеральной ингибиции, это указывает на то, что выбранные клетки д. обладать высокими уровнями экспрессии Delta по сравнению с соседями с относительно высокими уровнями активации Notch. Напр., у Drosophila, транскрипты Delta накапливаются во всех клетках нейрогенной эктодермы, непосредственно предшествуя выделению нейробласта, указывая тем самым, что экспрессия Delta не отличается между презумптивными нейробластами и презумптивными эпидермобластами (Kopczynski and Muskavitch, [1989]; Kooh et al., [1993]). Относительно униформная экспрессия Delta среди взаимодействующих клеток интерпретируется, исходя из предположения, что Delta обеспечивает взаимное ингибирование скорее, чем латеральную ингибицию. Однако, эти наблюдения были интерпретированы также, как подтверждающие, что пост-транскрипционные и пост-трансляционные изменения в функции Delta могут более аккуратно отражать динамику изменений в способности клеток высвобождать ингибирующий сигнал во время латеральной ингибиции.

Стало ясно в 1990s, что эндоцитоз Delta является одной из модификаций, которая играет критическую роль в регуляции функции Delta. В 1993, Kooh et al. показали, что Delta и Notch накапливаются в эндоцитотических пузырьках (Kooh et al., [1993]), а в 1999 Seugnet et al. показали, что эндоцитоз является существенным для передачи сигналов Notch, продемонстрировав, что мутанты shibire/dynamin характеризуются избытком нейральных клеток (Seugnet et al., [1997]). Они показали, что когда Notch активируется с помощью Delta, dynamin необходим как передачющим, так и получающим сигнал клеткам для нормального прореживания нейральных предшественников. Было также показано Klueg and Muskavitch, что эндоцитоз Delta или Serrate в клетках экспрессирующих лиганд, сопровождается транс-эндоцитозом связанного Notch extracellular fragment (NECD), и реципрокно в клетках, экспрессирующих Notch, эндоцитоз Notch сопровождается транс-эндоцитозом DSL лигандов (Klueg and Muskavitch, [1999]). Дальнейшее исследование dynamin мутантов привело к подтверждению, что эндоцитоз NECD-связанных Delta в Delta-экспрессирующих клетках необходим для достижения процессинга и диссоциации Notch белка в соседней клетке (Parks et al., [2000]).

В 2001 был идентифицирован Neuralized в качестве RING E3 или ubiquitin лигазы, ответственной за ubiquitylation и эндоцитоз Delta (Deblandre et al., [2001]; Lai et al., [2001]; Pavlopoulos et al., [2001]; Yeh et al., [2001]). Ubiquitin лигазы выполняют критическую роль в распознавании субстратов и в облегчении ковалентной конфигурации убиквитина, пептида в 76-аминокислот, с лизинами на субстратных белках. Дополнительные убиквитины могут быть конъюгированы на инициальный убиквитиновый пептид, чтобы сформировать короткую убиквитиновую цепь, а poly-ubiquitylation не распознается более как метка, которая направляет белок на деградацию (Hershko, [1983]). Однако, mono-ubiquitylation или multi-ubiquitylation, которая является конъюгацией одиночного убиквитинового пептида с одним или множественными лизинами субстрата, как недавно было установлено является сигналом, который направляет трансмембранные белки на эндоцитоз (Hicke and Dunn, [2003]; d'Azzo et al., [2005]).

Идентификация Delta в качестве субстрата для ubiquitylation привела к модели, которая подчеркивает роль Neuralized в эндоцитозе или деградации Delta, в сигнал-посылающих или сигнал-воспринимающих клетках. Взаимодействия Delta и Notch внутри Golgi сигнал-воспринимающих клеток (цис взаимодействия) снижают способность Notch взаимодействовать с Delta in trans в соседних клетках. В этой связи было предположено, что Delta эндоцитоз и деградация в сигнал-воспринимающей клетке может быть критическим для ограничения цис взаимодействий с Notch, что д. каким-то способом мешает его функции в качестве рецептора (Deblandre et al., [2001]; Lai et al., [2001]). Напротив, было предположено, что E3 лигаза существенна в сигнал посылающей клетке, где эндоцитоз Delta д. облегчать активацию Notch в соседней клетке (Pavlopoulos et al., [2001]).

Неспособность передавать сигналы Notch у mind bomb (mib) мутантов рыбок данио приводит к продукции избытка ранних нейронов и преждевременной дифференцировке нейральных предшественников (Jiang et al., [1996]; Schier et al., [1996]; Itoh et al., [2003]). В 2003, Mib был идентифицирован как др. RING ubiquitin лигаза, которая необходима для ubiquitylation Delta (Itoh et al., [2003]; Chen and Casey Corliss, [2004]). Исследования по клеточным трансплантациям с mind bomb (mib) мутантами предоставили дополнительные доказательства, что ubiquitylation Delta важно в сигнал-посылающих клетках для эффективной активации Notch в соседних клетках (Itoh et al., [2003]). Растет количество исследований на Drosophila, подтверждающих, что ubiquitylation и эндоцитоз Delta необходим в сигнал-посылающих клетках для эффективной передачи сигналов Notch (Le Borgne and Schweisguth, [2003b]; Overstreet et al., [2004]; Wang and Struhl, [2004]).

Идентификация Drosophila Mib гомолога показало, что несмотря на структурные различия Neuralized и Mib обнаруживают функциональное соходство и частично перекрывающиеся роли (Lai et al., [2005]; Le Borgne et al., [2005b]; Pitsouli and Delidakis, [2005]; Wang and Struhl, [2005]). Т.к. Serrate является типичным субстратом для Mib у Drosophila, то Delta является типичным субстратом для Neuralized. Несмотря на это, Mib необходим для ubiquitylation Drosophila DSL лигандов в ситуациях, когда Neuralized не экспрессируется. Анализ мышиных Mibs также показал. что Delta и Jagged Notch лиганды являются субстратами для Mib ubiquitylation (Koo et al., [2005a], [b]).

Epsin является критическим компонентом эндоцитотической кухни с самостоятельными доменами, которые обеспечивают взаимодействия или с clathrin или с ubiquitylated грузом (Chen and De Camilli, [2005]). Недавние исследования показали, что эндоцитоз в ассоциации с Epsin является критическим для функции Delta (Overstreet et al., [2004]; Wang and Struhl, [2004], [2005]); т.к. Delta способен интернализоваться за счёт множественных механизмов, но только Serrate и Delta, которые интернализуются с помощью Mib в ассоциации с Epsin, способны передавать сигнал Notch (Wang and Struhl, [2005]).

Delta взаимодействует с Neuralized или Mib посредством своего внутриклеточного домена, а Delta^ΔICD, которые лишены своего внутриклеточного домена, не могут быть ubiquitylated и не могут эффективно активировать Notch. Замещение внутриклеточного домена Delta на внутриклеточный домен Low Density Lipoprotein Receptor (LDLR), рецептора, который подвергается быстрому эндоцитозу и рециклингу, восстанавливает способность Delta^ΔICD эффективно передавать сигнал к Notch ubiquitin-независмым способом. Это наблюдение Wang and Struhl сдвигает фокус истории по участию эндоцитоза Delta к роли эндоцитоза и рециклинга Delta в передаче сигналов Notch (Wang and Struhl, [2004]). Дополнительные исследования подтвердили важность рециклинга Delta в детерминации клеточной судьбы в потомстве Sensory Organ Precursors у Drosophila (Emery et al., [2005]; Jafar-Nejad et al., [2005]). Несмотря на взрыв сообщений, всё ещё не достигнуто консенсуса о том, как эндоцитоз Notch лигандов влияет на активацию Notch в соседних клетках (Le Borgne et al., [2005a]).

Имеются, по крайней мере, две широко распространенные модели, которые объясняют, как эндоцитоз Delta в одной клетке может влиять на активацию Notch в соседних клетках. Первый класс моделей связан с возможностью, что эндоцитоз Delta облегчает S2 расщепление и удаление NECD. Второй класс моделей связан с возможностью, что Delta ubiquitylation и эндоцитоз облегчают взаимодействия между Delta и Notch. В этом наборе моделей, Delta подвергается эндоцитозу, а его последующее восстановление (recycling back) на поверхности вследствие модификаций или некоторых изменений в контексте, в котором он представлен, делает Delta более эффективным лигандом.

Удаление NECD является критической ступенью в активации Notch рецепторов. Мутантные формы Notch, которые устраняют NECD или манипуляции, которые высвобождают NECD, подобные calcium chelation, могут приводить к лиганд независимой S2 cleavage-зависимой активации Notch. Замещение Notch внеклеточного домена на альтернативный CD4 эктодомен, который не подвергается внеклеточному расщеплению, показало, что внеклеточный домен может предупреждать S3 расщепление (Mumm et al., [2000]). Однако, замещение CD4 внеклеточного домена укороченным CD4 эктодоменом делает возможным S3 расщепление, даже если всё ещё присутствует короткий эктодомен. Это указывает на то, что конформация укороченного CD4 эктодомена может способствовать доступу к S3 сайту для gamma secretases. Всё это указывает на то, что конформация juxta-membranous Notch внеклеточного домена, не обязательно его отсутствие, предопределяет доступ gamma secretase комплекса к S3 сайту.

В контексте этих наблюдений предполагается, что эндоцитоз Delta может активировать Notch с помощью физического удаления NECD, приводящего к тому, что связанный с мембранной фрагмент становится доступным для metalloproteases, ответственных за S2 расщепление. Альтернативно, механические стрессы, ассоциированные с инициацией Delta-NECD эндоцитоза, д. индуцировать конформационные изменения Notch, которые делают S2 сайт расщепления доступным для ADAM/TACE metalloproteases (Fig. 2A). В некоторых ситуациях было продемонстрировано, что Notch рецепторы не подвергаются базирующемуся на Furin S1 расщеплению (Kidd and Lieber, [2002]). В этом контексте было бы затруднительно удалить NECD фрагмент до S2 расщепления и это д. скорее всего указывать на то, что a Delta эндоцитоз облегчает конформационные изменения в Notch, которые делают сайт S2 доступным.


Рис.2  | Models for the role of Delta endocytosis. A: Delta endocytosis facilitates Notch S2 cleavage. B-D: Delta endocytosis and recycling returns a Delta that is more effective at interacting with Notch. B: Recycling returns Delta to the surface in a microdomain where it is clustered, associated with co-factors (yellow trapezoids), or with modifications (red asterisk) in the extracellular domain that make Delta interactions with Notch more effective. C: Following endocytosis, Delta is internalized in Multi Vesicular Bodies (MVBs) from which packets of clustered Delta are released as exosomes. D: Delta re-sensitization. Following endocytosis, the Delta-NECD complex dissociates, and unbound Delta returns to the surface via the recycling endosome for another round of interaction with Notch. NECD traffics to the late endosome and is eventually degraded in the lysosome.

NECD интернализация вместе с Delta в Delta-экспрессирующих клетках (Klueg and Muskavitch, [1999]; Parks et al., [2000]) согласуется с NECD транс-эндоцитозом, связанным с S2 расщеплением. Однако, это наблюдение согласуется также с альтернативной моделью, согласно которой эндоцитоз и рециклинг удаляют связанные NECD-Delta комплексы с клеточной поверхности, он диссоциируется во внутреннем компартменте и отделившаяся Delta повторно появляется на поверхности.

Вторая группа моделей описывает, как Delta эндоцитоз и последующее возвращение назад на поверхность делает Delta более привлекательным лигандом. Короче, Delta должен возвратиться на поверхность в состоянии кластера (clustered) с модификациями своего внеклеточного домена или в ассоциации с кофакторами, которые позволяют ему соединяться более легко с Notch (Fig. 2B-D). Кроме того, Delta интернализуется с апикальной поверхности поляризованных эпителиальных клеток и д. вернуться обратно на базолатеральную часть мембраны, где он может взаимодействовать с Notch на базолатеральной поверхности соседних клеток.

Используя секретируемую форму Delta, было показано, что она значительно более эффективна в отношении связывания и активации Notch на клеточной поверхности, если она находится в виде пре-кластера (pre-clustered) (Hicks et al., [2002]). Это наблюдение указывает на то, что образование кластера Delta делает его более эффективным лигандом для Notch. Одна из возможностей, что ubiquitylation, непосредственно или в следствие эндоцитоза и рециклинга, способствует образованию кластеров Delta (Fig. 2B). В этом контексте, ubiquitin д. способствовать взаимодействиям убиквитин распознающего домена, содержащегося в мембранных белках, которые способствуют образованию кластеров, или уникальному пост-эндоцитотическому переносу (trafficking) Delta, после ubiquitin-обусловленного эндоцитоза, что может гарантировать вступление в микродомены, где Delta и образует кластеры. Образование кластеров Delta белков д. способствовать лучшим взаимодействиям с Notch, если индивидуальные Delta-Notch взаимодействия слабы, то ассоциация множественных слабых связей является стратегией джля достижения достоверного молекулярного взаимодействия. Собранные в кластеры Delta д. формировать мультивалентые связи с рецепторами Notch на соседней мембране, особенно если Notch также собраны в кластеры. В самом деле, теперь в виде кластера секретируемый Delta соединяется с мембран-закрепленным Notch более эффективно, pre-clustering секретируемой формы Notch также важен для эффективного взаимодействия с Delta на клеточной поверхности (our unpublished data). Эти наблюдения указывают на то, что образование кластеров in vivo как Delta, так и Notch д. усиливать взаимодействия.

Образование кластеров рецепторов, как предполагается, динамически регулирует взаимодействия, обусловленные cadherins (Iino et al., [2001]) и integrin рецепторами (van Kooyk and Figdor, [2000]). Напр., в то время как комплемент integrin рецепторов неактивен в покоящихся фагоцитах, то обработка нейтрофилов соотв. стимулами, такими как phorbol ester, способствует образованию кластеров рецепторов в виде небольших агрегатов из 2-6 молекул и это изменение ассоциирует с соотв. увеличением клеточной способности связывать complement-покрытые частицы (Detmers et al., [1987]). Это и др. исследования указывают на то, что передача сигналов inside-out изменяет степень образования кластеров интегриновых рецепторов на клеточной поверхности, тем самым регулируется эффективность адгезивных взаимодействий, базирующихся на физиологической статусе клетки. Если образование кластеров Delta усиливает взаимодействия с Notch, и если уровень активации Notch регулируется образованием кластеров, то это может составлять новый механизм динамического регулирования эффективности передачи сигналов во время латеральной ингибиции.

Эндоцитоз Delta может также способствовать образованию кластеров путем внесения вклада в формирование exosomes (Denzer et al., [2000]; Fevrier and Raposo, [2004]). Эндоцитотический груз на ограничивающей мембране эндосом интернализуется путем отпочкования внутрь, чтобы сформировать пузырьки внутри просвета (intra-luminal) в мультивезикулярных эндосомах или multi-vesicular bodies (MVE/MVB) (Fig. 2C). Ubiquitylation служит сигналом для интернализации груза на эндоцитотических ограничивающих мембранах, так как это происходит на клеточной поверхности. В большинстве случаев MVBs сливаются с предсуществующими лизосомами, чтобы деградировать интернализованный груз. Однако, в ряде контекстов было показано, что вместо того, чтобы MVBs сливали с плазматической мембраной, происходит высвобождение 50-100-nm пузырьков вместе с ассоциированными белками во внеклеточное пространство. Эти пузырьки наз. exosomes. Высвобождение экзосом первоначально было описано в ретикулоцитах в качестве стратегии, с помощью которой клетки теряли transferrin рецепторы во время процесса созревания. Было также описано в контексте Antigen Presenting cells (APCs), что присутствуют собранные в кластеры антигены на экзосомах, чтобы активировать соседние Т-лимфоциты. Если Delta была интернализована с ограничивающей мембраны эндоцитотического пузырька, чтобы сформировать такие пузырьки, то каждый из них содержит множественные копии Delta с их внеклеточными доменами обращенными лицом снаружи в просвет MVE. Высвобождение Delta-несущих пузырьков в этом контексте д. воздействовать на соседние клетки небольшими пакетами собранных в кластеры Delta, в форме, в которой они могут наиболее эффективно взаимодействовать с Notch (Le Borgne and Schweisguth, [2003a]) (Fig. 2C). Хотя отсутствуют прямые доказательства Delta-переносящих экзосом, но интересно отметить, что 5Ч концентрированная кондиционная среда после Delta-экспрессирующих S2 клеток, как было показано, содержит растворимый полной длины лиганд Delta со способностью индуцировать экспрессию генов мишеней в Notch-экспрессирующих S2 клетках (Mishra-Gorur et al., [2002]). Значение этого наблюдения не было исследовано.

Эндоцитоз и рециклинг могут также способствовать ассоциации с др. кофакторами в микродоменах, которые изменяют способ, с помощью которого он представляется to Notch (Fig. 2B). Липидные плотики являются, например, микродоменами, которые, как полагают, функционируют как сигнальные платформы, в которые происходит образование кластеров рецепторов и ассоциированных белков не клеточной поверхности, что облегчает передачу сигналов (Simons and Toomre, [2000]). Липидные плотики и cholesterol и богатые sphingolipid липидные упорядоченный домены, которые обычно распознаются по их резистентности к экстракции детергентами с cold triton-X100 и др. реагентами, Недавние исследования, однако, поставили вопрос о физиологическом значении липидных плотиков (Munro, [2003]). Тем не менее, очевидно, что в контексте передачи сигналов Т-клеточными рецепторами, где липидные плотики, как полагали, играют критическую роль, временно формируя белковые сети на клеточной поверхности, динамически регулируя многие аспекты передачи сигналов (Douglass and Vale, [2005]).

Tetraspanin-обогащенные микродомены, отличные от микродоменов из липидных плотиков, как было предположено помогают обслуживать сборку и модуляцию сигнальных платфйорм на клеточной поверхности (Vogt et al., [2002]; Levy and Shoham, [2005]). Напр., tetraspanin CD9 ассоциирует с и модулирует функцию связанных с мембраной агонистов для EGF рецепторов. CD9 ассоциация усиливает потенциал этих лигандов во время juxtacrine передачи сигналов (Higashiyama et al., [1995]; Inui et al., [1997]; Shi et al., [2000]) с помощью ещё неизвестного механизма, который может участвовать в предупреждении расщепления мембранного лиганда, за счёт концентрации лиганда в CD9 микродоменах и за счет повышения количества лиганда, доступного на клеточной поверхности (Shi et al., [2000]).

Передача сигналов Delta-Notch часто происходит в контексте поляризованных эпителиальных клеток, где происходят взаимодействия между клетками посредством базолатеральных поверхностей. Для таких взаимодействий критическим является то, что клетки соответственно противостоят др. др. и что Delta и Notch экспрессируются на поверхностях, где взаимодействия возможны. Белки или непосредственно направляются в соответствующие мембранные компартменты после синтеза в Trans-Golgi Network или опосредованно вследствие вступления в систему эндоцитотического рециклинга. Анализ доставки E-cadherin, напр., показал, что эндоцитоз и рециклинг являются критическими для доставки E-cadherin на базолатеральную поверхность (Lock and Stow, [2005]). В отсутствие рециклинга посредством Rab11 эндоцитотического recycling компартмента, базолатеральная экспрессия снижается. Сходным образом, эндоцитоз и рециклинг могут вносить вклад в наличие Delta на базолатеральной поверхности клетки, где он д. взаимодействовать с Notch.

Эндоцитоз и рециклинг могут служить и как механизм для возвращения несвязанного Delta на клеточную поверхность, общая стратегия для ре-сенсибилизации рецепторов после взаимодействия с агонистами. Вследствие взаимодействия Delta с Notch, Delta-NECD комплексы могут быть интернализованы в эндоцитотических пузырьках, Delta и NECD диссоциируют, а несвязанный Delta возвращается на поверхность посредством рециклинга пузырьков, тогда как NECD остается и в конечном итоге разрушается (Fig. 2D). Факторы, которые влияют на принятие решения о возвращении несвязанного Delta на поверхность после его эндоцитоза, вместо направления на деструкцию, д. играть критическую роль в определении силы и продолжительности передачи сигналов Notch.

Механизмы, которые предопределяют пост-эндоцитотический трафик DSL Notch лигандов, остается плохо охарактеризованным. Однако, G-protein coupled receptors (GPCRs) могут служить в качестве примера рецепторов, которые подвергаются десенсиблизации и ресенсибилизации после взаимодействия со своими лигандами в зависимости от того, рецепторы интернализуются и деградируют или подвергаются рециклингу (Grady et al., [1997]; Oakley et al., [1999]; Trapaidze et al., [2000]; Rosenfeld et al., [2002]; Whistler et al., [2002]; Qiu et al., [2003]; Fan et al., [2004]; Bomberger et al., [2005]). В этом контексте ассоциации с beta arrestin, по-видимому, являются важным детерминантом для рециклинга рец3епторов и ре-сенсибилизации. Напр., воздействие на bradykinin type-2 receptor (B2R) bradykinin (BK) ведет к ассоциации B2R с beta arrestin. После удаления агониста beta arrestin быстро диссоциирует от B2R в эндосомы, а рецепторы возвращаются обратно в плазматическую мембрану, полностью компетентные для реактивации передачи сигналов B2R. Напротив, постоянная ассоциация с beta arrestin направляет рецепторы на деградацию (Simaan et al., [2005]). Др. исследования показали, что C-концы ряда GPCRs содержат мотивы, которые обеспечивают взаимодействия с PDZ домен содержащими белками, которые являются критическими для обеспечения пост-эндоцитического рециклинга рецепторов (Bomberger et al., [2005]; Paasche et al., [2005]; Trejo, [2005]). Играют ли C-терминальные PDZ-домен содержащие мотивы в DSL лигандах сходную роль еще предстоит решить.

Анализ химерных DSL лигандов представил некоторые указания на то, как ubiquitylation делает Notch DSL лиганды более эффективными. Делеция всего Delta intracellular domain (DeltaICD) или специфическое удаление всех внутриклеточных Lysines, которые служат субстартом для конъюгации Ubiquitin, предохраняет Delta от убиквитилирования и от высвобождения эффективного сигнала (Itoh et al., [2003]; Wang and Struhl, [2004]). Интересно, что слияние DeltaICD с 76-аминокислотным ubiquitin пептидом создает DeltaICD-Ub химеру с восстановленной способностью активировать Notch (Itoh et al., [2003]; Wang and Struhl, [2004]). Как обсуждалось раньше, замещение Delta внутриклеточного домена на внутриклеточный домен Low Density Lipoprotein receptor (LDLR) также восстанавливает функцию Delta (Wang and Struhl, [2004]). В этом контексте, функция не зависит от ubiquitin и E3 лигазы и доставка управляется с помощью мотивов в LDLR внутриклеточном домене, который может функционально замещать функцию поставки, обычно обеспечиваемую с помощью ubiquitylation. LDLR подвергаются быстрому рециклнигу и это интерпретируется как подтверждение, что эндоцитоз и рециклинг Delta, или с помощью ubiquitin-зависимого пути или с помощью ubiquitin-независимого пути, как в случае Delta-LDLR химеры, позволяют Delta быть представленным более эффективным способом для Notch. Интересно отметить, что поставка LDLR на базолатеральную поверхность эпителиальных клеток зависит от эндоцитоза с апикальной поверхности, сопровождаемого рециклингом в ассоциации с AP1B (Gan et al., [2002]). Однако, нет прямых доказательств для следования этому пути химер Delta-LDLR. Дальнейший анализ специфических изменений в организации, доставке и доступности на поверхности этих химерных форм Delta позволит выяснить роль ubiquitylation.

Помимо взаимодействия с E3 лигазами, взаимодействие с Epsin, a Ubiquitin-Interaction Motif (UIM) содержащим белком, является абсолютно необходимым для эффективной передачи сигналов Delta. Считается, что Epsin часто ассоциирует с clathrin-обеспечиваемым эндоцитозом, недавние исследования роли E3 лигазы CBL и Espin в эндоцитозе EGF receptor (EGFR) предоставили некоторую новую информацию (Sigismund et al., [2005]). Это исследование показало, что если EGFR подвергается воздействию низких уровней EGF, то он интернализуется с помощью clathrin-зависимого механизма. В этом контексте, CBL не ubiquitylate EGFR. Вместо этого, он существенен для ubiquitylation ассоциированных белков, участвующих в эндоцитозе. Напротив, если EGFR подвергается действию высоких уровней EGF, то он ubiquitylated с помощью CBL; он ассоциирует сh Epsin, Eps15 и Eps15R,и затем также интернализуется с помощью non-clathrin-обеспечиваемого пути, где он также ассоциирует с caveolin. Интересно, что EGFR/ubiquitin химера с poly-ubiquitylation дефицитным Ubiquitin, также ассоциирует с Epsin и Eps15 и исключительно интернализуется с помощью non-clathrin-зависимого пути. Важно определить, способствует ли ассоциация Epsin с Delta также интернализации с помощью non-clathrin-обеспечиваемой интернализации и может ли вступление на этот путь также облегчать рециклинг и ассоциацию с критическими кофакторами, которые делают DSL лиганды более эффективными.

Т.к. EGFR/ubiquitin химеры воспроизводят многие аспекты поставки EGFR вследствие ubiquitylation, то это может служить чрезвычайно удобным инструментом для выявления специфических изменений пост-эндоцитотической сортировки, которая регулируется с помощью ubiquitylation EGFR. Более того, т.к. transferrin receptor/ubiquitin химеры также используют non-clathrin-обеспечиваемый путь, путь не используемый transferrin рецепторами дикого типа, то очевидно, что ubiquitin химеры обладают общим поведением и их анализ может давать общие уроки о роли ubiquitylation в поставке трансмембранных белков. Однако, некоторые отличия в поставке между натуральными ubiquitylated субстратами и мембранный белок/ubiquitin химерами следует ожидать, т.к. de-ubiquitylation невозможна в химерах.

Sensory organ precursors (SOP) генерируют внешние сенсорные органы Drosophila посредством серии стереотипических асимметричных делений. Основой для разных судеб дочерних клеток, продуцируемых в каждом из таких делений является то, что передача сигналов Notch активируется только в одной из дочерних клеток. Numb и Neuralized белки асимметрично локализуются в переднем кортексе делящихся SOPs и сегрегируют исключительно в переднюю pIIb дочернюю клетку. Numb ингибирует активацию Notch, а Neuralized способствует эндоцитозу Delta в pIIb клетках. Асимметричное наследование Numb и Neuralized в pIIb клетках гарантирует, что в них не происходит активации Notch и они оказываются более эффективными в посылке сигнала Delta. Напротив, pIIa клетки оказываются более эффективными в восприятии сигнала Delta и в активации Notch, что помогает специфицировать их судьбу.

Сегодня идентифицирован третий независимый игрок, который гарантирует, что pIIb клетка будет более эффективной в посылке сигнала Delta (Emery et al., [2005]; Jafar-Nejad et al., [2005]). Nuclear Fallout (Nuf), гомолог arfophilin позвоночных, который связывает Rab11 (Hickson et al., [2003]), ассоциирует с центросомой и помогает создавать перицентросомный recycling центр в pIIb клетке сразу после митоза SOP (Emery et al., [2005]). Напротив, ассоциация Nuf с центросомой предупреждается с помощью пока ещё не идентифицированного механизма в pIIa клетке и поэтому recycling эндосомы не столь быстро возникают в этой дочерней клетке. И как результат Delta, которая интернализуется до деления SOP клетки, подвергается рециклингу в pIIb клетке и это вносит вклад в быстрое создание pIIb клетки как лучшей сигнал-посылающей клетки. Если механизмы, которые гарантируют асимметрическую сегрегацию Neuralized и Numb разрушены, то Rab 11-ассоциированные перицентросомные recycling эндосомы всё ещё образуются асимметрично в pIIb клетке и этого достаточно, чтобы специфицировать асимметрические судьбы на базе дифференциальной активации Notch в pIIa и pIIb клетках, Эти наблюдения иллюстрируют, как перекрывающиеся механизмы гарантируют асимметрические судьбы потомкам SOP и как они подчеркивают важность Delta recycling в образовании pIIb клетки, как наиболее эффективно передающей сигнал.

Анализ Drosophila sec15 мутантов предоставил дальнейшие доказательства роли рециклинга в эффективности передачи сигналов Delta (Jafar-Nejad et al., [2005]). Sec15, первоначально был идентифицирован как компонент комплекса exocyst, сравнительно недавно был также идентифицирован как эффектор для Rab11 (Zhang et al., [2004]), необходимый для доставки груза в recycling эндосомах на плазматическую мембрану. В этом контексте, sec15 мутанты характеризуются дефектами наружных сенсорных органов, заключающихся в трансформациях pIIa в pIIb, что происходит в результате снижения передачи сигналов Notch.

In this review, I have speculated about potential mechanisms by which Delta endocytosis facilitates activation of the Notch receptor and used examples from other signaling pathways to illustrate how each of the mechanisms is relevant in specific contexts. Though the precise mechanism by which Delta ubiquitylation and endocytosis contributes to Notch activation remains unclear, there is mounting evidence for endocytosis and recycling ultimately playing a critical role. The explosion of recent reports on this subject raises a number of questions that pose an exciting challenge for future research in this area. Is Delta ubiquitylation and endocytosis stimulated by interaction with Notch and/or does constitutive endocytosis and recycling generate a more effective ligand prior to interaction? Does endocytosis and recycling affect clustering of Delta, promote association with specific proteins critical for its function, or permit entry into specific microdomains that facilitate interaction Notch? Is Delta-Notch binding weaker in the absence of endocytic recycling and recycling? Is Delta endocytosis and recycling an absolute requirement for interaction and activation of Notch in specific contexts or is it more important for making these events more efficient in specific cells? Is Delta endocytosis also directly required to facilitate S2 cleavage?

Interestingly, formalin-fixed Delta-expressing S2 cells can induce expression of target genes when they are mixed with Notch-expressing S2 cells, showing that presentation of membrane-bound Delta can, in principal, activate Notch without active Delta internalization (Mishra-Gorur et al., [2002]). Furthermore, compared to non-fixed cells, fixed Delta-expressing S2 cells produce more sustained target gene expression in Notch-expressing cells. These observations argue against an absolute requirement for membrane-tethered Delta actively pulling on Notch to facilitate S2 cleavage, though it remains possible that this mechanism makes activation more efficient. The unusually sustained effect of fixed Delta-expressing also argues against endocytosis and recycling being essential for sustained presentation of active Delta. Since endocytosis and recycling could have contributed to making a more effective Delta ligand prior to fixation, it would be interesting to examine if interference with Delta recycling prior to fixation reduces the ability of Delta-expressing cells to deliver a signal. It should be kept in mind that in experiments like this, over-expression of Delta could obscure the relevance of trafficking mechanisms that are essential in vivo, where there might be limiting amounts of Delta available. Indeed, a better understanding of the specific contexts in which Delta endocytosis is required for signaling will provide clues about how it contributes to signaling.

This review started with a description of Delta-Notch signaling in lateral inhibition emphasizing a role for negative feedback of Notch activation on proneural gene and Delta transcription. However, as noted earlier, Delta expression levels are often not obviously different in cells selected by Delta-Notch signaling. In this context, it will be important to investigate if the level of Notch activation or proneural function in a cell directly regulates endocytosis and recycling of Notch ligands and if this provides a dynamic post-translational mechanism for regulating the outcome of Notch signaling.