Посещений:
Эндотелиальные Клетки Артерий, Вен и Лимфатических Сосудов

В раннем эмбриогенезе

Vascular development: from precursor cells to branched arterial and venous networks
ANNE EICHMANN, LI YUAN, DELPHINE MOYON, FERDINAND LENOBLE, LUC PARDANAUD and CHRISTIANE BREANT
Int. J. Dev. Biol. 49: 259-267 (2005) doi: 10.1387/ijdb.041941ae

The adult vascular system is composed of an arterial, a venous and a lymphatic compartment. These different compartments respectively provide oxygen and nutrients to peripheral organs, remove carbon dioxide and waste products and maintain an immune barrier to defend the host against foreign organisms. Malfunctions of the vascular system represent a major cause of mortality and disease in developed countries. Understanding of the molecular mechanisms regulating vascular system development and maintenance is thus crucial for the design of therapies to cure vascular diseases. The molecules implicated in the control of physiological and pathological angiogenesis in the adult already function during embryonic development. Indeed, the survival of the embryo also critically depends on the establishment of a functional circulatory loop. Here we review our current knowledge about the emergence of endothelial precursor cells in the embryo, of their assembly into the primary vascular plexus and of the remodeling of this plexus into arteries and veins. We also focus on the molecular mechanisms controlling the development of arteries, veins and lymphatic vessels.



B. H. Herzog, J. Fu, S. J. Wilson, P. R. Hess, A. Sen, J. M. McDaniel, Y. Pan, M. Sheng, T. Yago, R. Silasi-Mansat, S. McGee, F. May, B. Nieswandt, A. J. Morris, F. Lupu, S. R. Coughlin, R. P. McEver, H. Chen, M. L. Kahn, L. Xia, Podoplanin maintains high endothelial venule integrity by interacting with platelet CLEC-2. Nature 502, 105–109 (2013).


Лимфоциты поступают в лимфатические узлы посредством специальных кровеносных сосудов, наз. high endothelial venules (HEVs), инфекция или иммунизация повышают скорость этой доставки. Это перемещение клеток поперек стенки сосудов может происходить без нарушения целостности сосудов. Тромбоциты являются критическими для предупреждения избыточной кровточивости и имеют целью репарировать кровеносные сосуды. Podoplanin (PDPN) является лигандом для тромбоцитами актируемых рецепторов CLEC-2 и концентрируется в лимфатических узлах. Herzog et al. получили мышей с постнатально индуцируемым нокаутом PDPN или избирательным нокаутом в фибробластных ретикуолярных клетках, окружающих HEVs. Оба типа мышей обнаруживают спонтанную кровоточивость в лимфатических узлах слизистой, характеристика, которая также возникает у мышей со специфичным для тромбоцитов недостатком CLEC-2. Мыши, дефицитные по CLEC-2 (в тромбоцитах) или по PDPN (глобально индуцибельным) также обнаруживают кровотечения в периферические лимфатические узлы после иммунного вызова, это также ассоциирует с повышенной проницаемостью HEVs в периферических лимфатических узлах. Блокирование доставки лимфоцитов в лимфатические узлы с помощью обработки лимфоцитов антителами против молекулы адгезии L-selectin предупреждало кровоточивость из периферических лимфатических узлов после иммунного вызова. Тромбоциты обнаруживались на abluminal стороне HEVs в периферических лимфатических узлах у иммунизированных мышей дикого типа, это подтверждает, что тромбоциты могут мигрировать через HEVs, чтобы соединиться с PDPN на фибробластических ретикулярных клетках. Молекула клеточной адгезии VE-cadherin и др. белки, ассоциированные со слипчивыми соединениями, были редуцированы в лимфатических узлах мышей, дефицитных по PDPN или CLEC-2. Блокирование агрегации тромбоцитов не предупреждает повышенной проницаемости периферических лимфатических узлов иммунизированных мышей дикого типа. Вместо этого изолированные тромбоциты дикого типа, но не дефицитные по CLEC-2 тромбоциты, высвобождали sphingosine 1-phosphate (S1P), и PDPN-позитивные-но не PDPN-негативные-клетки меланомы, стимулированные высвобождением S1P из тромбоцитов диго типа. Количество VE-cadherin снижалось в срезах лимфатических узлов слизистой, культивируемых на среде, содержащей сыворотку плодов телят, истощенную по липидам. Добавление тромбоцитов дикого типа, но не тех, что от S1P-дефицитных мышей, к истощенной по липидам среде предупреждало это снижение VE-cadherin в срезах дикого типа, но не в срезах от PDPN-дефицитных мышей mice. Т.о., поскольку тромбоциты мигрируют вместе с лимфоцитами поперек стенки HEVs, они активируются с помощью PDPN на окружающих фибробластических ретикулярных клетках и секретируют S1P, который стимулирует HEVs к поддержанию адгезии.
Все позвоночные нуждаются в механизме распределения кислорода и питательных веществ по тканям и для удаления двуокиси углерода и др. отходов метаболизма, которые передаются экскреторным органам. Система кровообращения выполняет эти витальные функции посредством двух своих главных компонентов кровеносно-сосудистой и лимфатической систем (Рис. 1). Кровь, которая является переносчиком кислорода, двуокиси углерода и метаболических продуктов, качается из сердца через артериальную систему в тканевые капилляры, где происходит обмен. Кровь затем отводится посредством венозной системы обратно в сердце. Кровеносно-сосудистая система затрагивается многочисленными патологиями, включая атеросклероз и рак, две основные причины смертности в развитых странах (Carmeliet and Jain, 2000; Cines et al., 1998; Ferrara and Alitalo, 1999; Folkman, 1995, for reviews). Лимфатическая система дренирует вышедшую из сосудов жидкость, лимфу, из внеклеточных пространств и возвращает в венозное кровообращение. Лимфатические сосуды также существенны для иммунной защиты, т.к. лимфа и любой чужеродный материал, присутствующий в ней, такой как микробные антигены, фильтруется через цепочки лимфатических сосудов (Рис. 1). Дефекты развития лимфатической системы или повреждения провоцируют lymphedema, нетрудоспособные, бесформенно опухшие конечности. Кроме того, многочисленные типы опухолевых клеток используют лимфатические сосуды для своего метастазирования (Alitalo and Carmeliet, 2002).
Гистологически структура кровеносных сосудов довольно проста. Капиллярное ложе, которое представляет собой самую большую поверхность сосудистой системы, состоит лишь из endothelial cells (EC), случайным образом ассоциированных с внешними перицитами (pericytes). Эти простейшие капиллярные трубочка окружены базальной мембраной. Более крупные сосуды имеют дополнительные слои, образующие сосудистую стенку, которая состоит из мышечного слоя, tunica media и наружного соединительно-тканного слоя, называемого tunica adventitia, содержащая vasa vasorum и нервы (Wheater et al., 1978). Размеры сосудистой стенки варьируют в зависимости от размера и типа сосуда.

Рис. 1. Schematic representation of the circulatory system. (Modified from Karkkainen et al., 2002). Blood is pumped from the heart through arteries, arterioles and capillaries to the tissues, where exchanges occur. Blood is returned to the heart via the venous circulation. The lymphatic system, composed of lymphatic capillaries and vessels, drains excess fluid, the lymph, containing proteins, lipids and immune cells, from the extracellular space and returns it to the venous circulation.

Emergence of EC during embryonic development


Т.к. расстояние диффузии молекул ограничено (100-200 µm для O2 напр.), то сосудистая система в любое органе и ткани устанавливается очень рано во время развития. Сердечно-сосудистая система действительно является первой системой органов, формируемой во время раннего эмбрионального развития. Дифференцировка EC впервые обнаруживается во время гаструляции, когда клетки инвагинируют через первичную полоску, чтобы сформировать мезодерму. Вновь сформированные мезодермальные клетки вскоре организуются в осевую мезодерму (хорду), параксиальную мезодерму (сомиты) и промежуточную мезодерму (почки и гонады) (Рис. 2A). Латеральная пластинка мезодермы располагается по обеим сторонам промежуточной мезодермы и д. расщепляться на два слоя после образования целома: дорсальный слой, соматоплевральная мезодерма, и вентральный слой, спланхноплевральная мезодерма. Дорсальный листок контактирует с эктодермой и д. формировать стенку тела и конечности, тогда как вентральный листок находится в контакте с энтодермой и д. формировать висцеральные органы. Задняя часть мезодермы, которая занимает примерно половину эмбриона во время стадии гаструляции, д. давать вне-эмбриональную мезодерму. Первые эндотелиальные клетки, которые образуются в гаструлирующем эмбрионе, возникают из латеральной и задней частей мезодермы (Murray, 1932). Murray рассекал 24-часовые эмбрионы кур на мелкие кусочки, которые культивировались in vitro, чтобы получить клетки крови, обнаруживаемые по содержанию в них гемоглобина. Задние 2/3 эмбриона, соответствовавшие презумптивным территориям латеральных и задней частей мезодермы (Рис. 2A), давали клетки крови, а также EC. Позднее было установлено, что эти территории экспрессируют vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR2) (Рис. 2B) (Eichmann et al., 1993).
Vascular endothelial growth factor (VEGF) и его рецептор VEGFR2 являются наиболее критическими драйверами образования эмбриональных сосудов (Yancopoulos et al., 2000). VEGF экспрессируется в пространственной и во временной ассоциации с почти всеми физиологическими событиями образования сосудов in vivo (Jakeman et al., 1993; Shweiki et al., 1993). Экспрессия VEGFR2 обнаруживается уже на очень ранних стадиях развития (Рис. 2B) и постепенно становится ограниченной в основном EC всех типов кровеносных сосудов, а также лимфатических сосудов (Eichmann et al., 1993; Wilting et al., 1997; Yamaguchi et al., 1993). Мыши, дефицитные по VEGFR2 (VEGFR2-/-) погибают in utero между 8.5 и 9.5 днями post-coitum в результате ранних дефектов в развитии HC и EC. Кровяные островки желточного мешка отсутствовали уже на 7.5 день, не обнаруживалось организованных кровеносных сосудов ни в эмбрионе, ни в желточном мешке, отсутствовали также и гематопоэтические предшественники (Shalaby et al., 1995). VEGF дефицитные эмбрионы мышей также погибали на ст. E8.5 - E9.5, имея тяжелые фкнотипы, сходные с таковыми у VEGFR2-/- мышей; этот фенотип наблюдался также и у VEGF+/- эмбрионов (Carmeliet et al., 1996; Ferrara et al., 1996). Гибель, возникающая в результате потери одиночного аллеля указывает на тесную, зависимую от дозы регуляцию эмбриональных сосудов с помощью VEGF. Всё это подтверждает главную позицию системы VEGF/VEGFR2 в формировании сосудов.
Вновь сформированные клетки латеральной и задней частей мезодермы мигрируют в направлении желточного мешка, где они дифференцируются в EC и в HC кровяных островков. Во время своей миграции предшественники агрегируют в кластеры, наз. hemangioblastic агрегатами. Они впервые были описаны F. Sabin (Sabin, 1920), которая изучала их миграцию с помощью светового микроскопа. Она смогла отличить гемангиобластные агрегаты от остальных мезодермальных клеток по их повышенной рефракции. Периферические клетки таких агрегатов постепенно уплощались и дифференцировались в

Рис. 2. Origin of endothelial cells in the gastrulating chick embryo. (A) Map of presumptive embryonic territories (from Vakaet, 1985). (B) Labeling of a chick embryo at stage 4 of Hamburger and Hamilton (Hamburger and Hamilton, 1951), corresponding to the stage shown in A, with an antisense riboprobe specific for VEGFR2. The presumptive extraembryonic and lateral mesoderm expresses this receptor.

EC, тогда как центрально расположенные клетки дифференцировались в HC (Рис. 3A). Одновременное появление EC и HC в кровяных островках привело к гипотезе, что они возникают из общих предшественников hemangioblast (Sabin, 1920). Экспрессия VEGFR2 во время последовательных стадий дифференцировки гемангиобластов показывает, что предшественники в гаструле, а также гемангиобластные агрегаты, являются позитивными, т.к. в дифференцирующихся островках только ЕС экспрессируют этот ген и его экспрессия не выявляется в HC (Рис. 3B). Эти наблюдения согласуются с гипотезой, что VEGFR2 метит бипотентных предшественников и что после клональной деверсификации только одна из двух дочерних клеток сохраняет экспрессию этого гена.
Чтобы проверить эту идею были приготовлены моноклональные антитела против внеклеточного домена VEGFR2 перепела (Eichmann et al., 1997). Используя эти антитела мы выделили клетки из задних территорий эмбрионов на стадии гаструлы (Рис. 2A), которые затем культивировали на полу-твердой среде in vitro. В отсутствие добавления VEGF, VEGFR2+, но не VEGFR2- предшественники, дифференцировались в HC разных ростков. В присутствии VEGF, индуцировалась EC дифференцировка VEGFR2+ предшественников. Эти эксперименты показали, что VEGFR2+ предшественники могут и в самом деле давать EC, а также HC, в соответствии с гипотезой, что эти рецепторы экспрессируются общим предшественником. Однако, на уровне одиночной клетки, индивидуальные VEGFR2+ клетки могут дифференцироваться или в EC или в HC, но не в обе, что является прямой демонстрацией существования 'гемангиобластов'. В культурах, происходящих из ES клеток мышей, отдельные VEGFR2+ клетки были способны давать и EC и HC (Choi et al., 1998; Nishikawa et al., 1998). Эти клетки сегодня обозначаются как 'гемангиобласты'. Однако, дополнительные исследования показали, что производные ES клеток VEGFR2+ клетки могут также давать гладкомышечные клетки в присутствии platelet-derived growth factor (PDGF)(Yamashita et al., 2000), указывая тем самым, что они вряд ли узко предетерминированы давать только клоны EC и HC, эти клетки могут быть pluri- или multipotent предшественниками.

Formation of the primary capillary plexus


Вследствие дифференцировки кровяных островков желточного мешка EC, окружающие эти островки вскоре анастомозируют образуя капиллярную сеть, которая служит в качестве поддержки начинающегося кровообращения (Рис. 3, 4A). Эмбрионы, таким образом, закладывают рудименты своей вне-эмбриональной сосудистой системы до начала сердцебиений примерно на ст.12 сомитов у эмбрионов кур. Внутри собственно эмбриона дифференцируются один крупный сосуд дорсальная аорта, а также многочисленные капилляры (Рис. 4A). Дифференцировка EC в собственно эмбрионе во время этого промежутка происходит в отсутствие сопровождения гематопоэза. После начала сердцебиений и тока крови капиллярное сплетение желточного мешка быстро ремоделируется в артерии и вены и устанавливается функциональная циркуляторная петля, существенная для выживания (Рис. 4B). Вновь формируемые кровяные островки HC канализируются посредством этого примитивного кровообращения. Эти гематопоэтические предшественники желточного мешка дифференцируются в основном в примитивные эритроциты, которые замещаются по ходу развития с помощью дефинитивных гематопоэтических предшественников, генерируемых собственно эмбрионом (Cumano et al., 2001; Dieterlen-Lievre, 1975). Эти дефинитивные предшественники опять же обнаруживают тесную ассоциацию с эндотелием дорсальной аорты (Jaffredo et al., 1998; Pardanaud et al., 1996). В целом, дифференцировка in situ EC из мезодермы и их слияние в трубки первичного сплетения капилляров называется vasculogenesis (Risau, 1997). Васкулогенез приводит к образованию крупных эмбриональных сосудов, дорсальной аорты и первичного сосудистого сплетения в желточном мешке. У эмбрионов кур оба формируются до 14ss, т.е. до начала перфузии. Рис. 4A показывает структуру первичного капиллярного сплетения на этой стадии, выявляемую иммуногистохимически с помощью QH1 антител, специфичных к EC перепела (Pardanaud et al., 1987).

Remodeling of the capillary plexus into arteries and veins


В течение следующих нескольких часов первичное сосудистое сплетение ремоделируется в систему артерий и вен, чтобы приспособиться к выбросам из сердца и установить первичное кровообращение. Эта ступень является критической для выживания эмбриона и многие мутантны мышей по генам, участвующим в развитии сосудов, погибают во время этой фазы 'remodeling' (Roman and Weinstein, 2000, for review). Мы детально проанализировали ремоделирование первичного сосудистого сплетения в артерии и вены в желточном мешке эмбрионов кур iс помощью time-lapse video-microscopy (LeNoble et al., 2004). Рис. 4B показывает эмбрион курицы на 24 ч старше по сравнению с тем, что на Рис. 4A, очевидно, что первичные капилляры сплетения перестроились в более крупные и мелкие сосуды.

Эмбрионы кур

Рис. 3. Differentiation of yolk sac blood islands. (A) Schematic representation: see text for details. (B) Transverse section through the extraembryonic area of a 15-somite stage embryo, labeled with an antisense riboprobe specific for VEGFR2. Hemangioblastic aggregates are positive. In the blood islands and capillaries, expression of the receptor decreases in the hematopoietic cells (asterisks), but is maintained in the endothelial cells (arrowheads). Bar, 75 мm.



Рис. 4. Arterial-venous differentiation in the yolk sac. (A) Primary capillary plexus stage. Labeling of a 10-somite stage quail embryo with the QH1 antibody. Note labeling of the endocardium (asterisk) and the paired dorsal aorta (DA, arrows). At this stage, only these two major vessels are formed, the remainder of the vascular system is seen as a capillary plexus. (B) Photo-micrograph of a living chick embryo 24 hours older than the embryo in A. The heart is indicated (asterisk). Note that in the yolk sac, two main arteries, the vitelline arteries (VA) have formed. Arterial blood (red arrows) is pumped from the heart through the dorsal aorta (DA) and the vitelline arteries into the yolk sac and is returned to the heart via the venous circulation (blue arrows) either directly or through the sinus vein (SV). (C) Onset of formation of the posterior vitelline vein. Embryo at the same stage as in B. Intracardiac injection of DiI-Ac-LDL, which specifically recognizes endothelial cells. Note the dorsal aorta and vitelline artery. As more flow passes through these vessels, they enlarge. Smaller vessels of the initial arterial capillary plexus (black arrow) carry progressively less flow and are disconnected from the main branch of the dorsal aorta. As shown by the intracardiac injection, these vessels are still perfused through more distal parts of the capillary plexus. They will be used to form the posterior vitelline vein. (D) Arterial marker expression. In situ hybridization with an antisense riboprobe specific for NRP-1. Note strong expression in the vitelline artery (VA), but reduced expression in the disconnected capillaries that will form the vitelline vein (black arrow). Bars 250 мm.

позволяют непосредственно наблюдать кровоток и направлении циркуляции у живых эмбрионов. Как видно на Рис. 4B, артериальная кровь качается из сердца через дорсальную аорту и поступает в желточный мешок через vitelline артерию и её веточки. Чтобы возвратиться обратно в сердце кровь или достигает периферической sinus vein и возвращается через переднее венозное сплетение (Рис. 4B), или кровь может течь непосредственно обратно в направлении сердца. В самом деле тщательная визуальная проверка циркуляторной системы на этой стадии показала, что артериальная и венозная кровь действительно текут через и те же самые сосудистые каналы. Артериальная и венозная кровь определяются по направлению кровотока от (артериальная) или к (венозная) сердцу. Эта конфигурация эмбриональных сосудов находится в контрасте с ситуацией у взрослых, у которых кровь течет во всё более уменьшающиеся артериолы, капиллярное ложе и через во всё более увеличивающиеся венулы и чрез вены обратно в сердце. Фактически, если бы сохранилась конфигурация артериально-венозных сосудов, то формировались бы крупные артериально-венозные шунты, а дистальные части желточного мешка не снабжались бы кровью, что могло приводить к гибели эмбриона. Эмбрионы решают эту 'plumbing' проблему простым способом: во время образования крупной vitelline артерии из первичного капиллярного сплетения не все капилляры интегрируются в эту трубку: некоторые мелкие боковые бранши оказываются не соединенными (Рис. 4C, D). Отсутствие связи боковых веточек регулируется с помощью перфузии: усиленный кровоток в основных ветвях ведет к уменьшению диаметра и последующей обструкции просвета боковых веточек (LeNoble, F., Eichmann, A., Nguyen, T.H., Fleury, V., submitted). Эти не соединенные сосуды в последствие используются для образования эмбриональных вен второго круга кровообращения, которые оказываются лежащими дорсально и параллельно артериям (LeNoble et al., 2004). Чтобы соединиться с венозным кровообращением отсоединенные боковые веточки распространяются дорсально и перпендикулярно артериям. Молекулярная основа этого направленного распространения (sprouting) пока не известна, но она может использовать некоторые рецепторы наведения аксонов, экспрессируемые развивающимися артериальными и венозными EC (see below).

Molecular markers specific for arteries and veins


Считается, что EC первичного капиллярного сплетения представляют собой довольно гомогенную группу клеток и что дифференцировка в артерии и вены происходит под действием гемодинамических сил (Thoma, 1893). В последние годы, однако, открыто несколько сигнальных молекул, которые метят артериальные и веночные EC начиная с ранних стадий развития, до сборки сосудистых стенок. Интересно, что большинство таких молекул экспрессируется также в нервной системе, где они регулируют предопределение клеточных судеб и ведение миграции нейрональных предшественников, а также развивающихся аксонов (Artavanis-Tsakonas et al., 1999; Flanagan and Vanderhaeghen, 1998; Kullander and Klein, 2002; Neufeld et al., 2002; Raper, 2000). Можно предполагать, что такие молекулы регулируют сходное клеточное поведение в развивающейся нервной и сосудистой системах. Артериальные EC у эмбрионов кур, мышей и рыбок данио избирательно экспрессируют ephrin-B2, neuropilin-1 (NRP-1) и членов пути передачи сигналов Notch, включая notch3, DLL4 и gridlock (Herzog et al., 2001; Lawson et al., 2001; Moyon et al., 2001a; Moyon et al., 2001b; Shutter et al., 2000; Villa et al., 2001; Wang et al., 1998; Zhong et al., 2000). Др. молекулы специфически экспрессируются в венозной системе, наиболее заметен EphB4, рецептор для артериального ephrin-B2 (Gerety et al., 1999). Рецептор neuropilin-2 (NRP-2) экспрессируется венами и на поздних стадиях развития, он становится ограниченным лимфатическими сосудами у цыплят и мышей (Herzog et al., 2001; Yuan et al., 2002). Базируясь на этих специфических паттернах экспрессии и исследовании мутантов у рыбок данио и мышей было предположено, что эмбриональная артериально-венозная дифференцировка действительно предетерминирована генетически (Wang et al., 1998). В подтверждение этой идеи отслеживали индивидуальные флюоресцентно меченные ангиобласты у эмбрионов рыбок данио и установили, что одиночный EC предшественник может давать артерию или вену, но не смешанный клон (Zhong et al., 2001). Возможная роль этих сигнальных молекул в артериально-венозной дифференцировке приоткрывается фенотипами ephrinB2 и EphB4 нокаутных мышей: эмбрионы обладают симметричными фенотипами, ремоделирование первичного сосудистого сплетения в артерии и вены арестовано на ранних этапах развития, что ведет к гибели примерно на ст. E9.5 (Adams et al., 1999; Gerety et al., 1999; Wang et al., 1998). Инактивация др. сигнальных молекул, специфически экспрессирующихся артериями, таких как NRP-1 и членов семейства Notch также ведет к эмбриональной летальности из-за неспособности сосудистой системы ремоделироваться (Kawasaki et al., 1999; Swiatek et al., 1994; Xue et al., 1999). У этих последних мутантов специфический эффект на артерии не был описан, скорее отмечается общая неспособность формировать крупные и малые сосуды в желточном мешке. Мутанты рыбок данио обнаруживают потребность в передаче сигналов Notch, чтобы репрессировать венозную судьбу в артериях: ингибирование передачи сигналов Notch при использовании доминантно негативной формы suppressor of hairless (SuH), нижестоящего эффектора Notch, ведет к эктопической экспрессии венозных маркеров в артериях и к сосудистым уродствам (Lawson et al., 2001). Эти наблюдения привели к гипотезе, что эмбриональная сосудистая система действительно может быть предетерминирована в отношении артериальной или венозной судьбы с ранних стадий развития.

Arterial-venous differentiation involves EC plasticity


Наши исследования показали, что значительная степень пластичности EC наблюдается во время артериально-венозной дифференцировки. В первой серии экспериментов мы выделяли артериальные или венозные фрагменты их эмбрионов перепела на разных стадиях развития вместе с их сосудистой стенкой. Эти фрагменты трансплантировали в целом или на место сомита в E2 хозяев кур (Moyon et al., 2001a). Потомство трансплантированных EC отслеживали у эмбрионов хозяев, используя антитела QH1, специфичные для EC перепела, но не распознающие хозяйские EC (Pardanaud et al., 1987). Мы использовали гибридизацию in situ с ephrinB2 или NRP-1 зондами, которые распознавали артериальные, но не венозные EC у обоих видов. Затем задались вопросом, будут ли ЕС, трансплантированные из артерий перепела колонизировать только артерии кур или также и вены. Эксперименты показали, что вплоть до поздних стадий развития (E11), перепелиные EC из артерий или вен колонизировали с одинаковой эффективностью и артерии и вены хозяев. Более того, экспрессия артериальных маркеров менялась в соответствии с новым окружением: когда перепелиные клетки колонизировали артерии, то они экспрессировали артериальные маркеры, если же они колонизировали вены, то нет независимо от своего происхождения. Т.о., EC являются пластичными в отношении артериально-венозной дифференцировки вплоть до ст. E11. После E11, EC, происходящие из трансплантированных артерий колонизировали только артерии хозяев, тогда как из вен колонизировали только вены хозяев. Количественная оценка трансплантированных EC показала, что эта потеря пластичности затрагивает огромное большинство (98%) от всех пересаженных EC. Эти эксперименты указывают на некоторые внутренне присущие изменения трансплантированных артерий и вен после E11, которые ограничивают их способность колонизировать соответственно артерии и вены хозяев. Чтобы определить источник сигнала, ограничивающего пластичность, мы удаляли сосудистую стенку от E14 фрагментов аорты перепела, тогда они полностью восстанавливали свою способность

Рис. 5. Flow manipulations transform arteries into veins and veins into arteries. Ligation of the right vitelline artery of a chick embryo (Stephan, 1952). The schematic drawing shows the experimental manipulation: two small incisions are made on each side of the vitelline artery, a metal clip is then inserted underneath this artery. The clip is devised such that it lifts the right vitelline artery and blocks blood flowing through it. The photomicrograph shows such an embryo 24 hours after ligation: note that the right vitelline artery has been transformed into a vein. The normally present anterior and posterior vitelline veins are absent: they have been incorporated into the unligated left vitelline artery, which crosses the midline of the embryo/yolk sac axis.

колонизировать вены: примерно 50% трансплантированных клеток обнаруживалось в артериях и 50% в венах. Точная природа сигнала, ограничивающего пластичность и исходящего из стенки сосуда неизвестна.

Yolk sac arterial-venous differentiation is flow-regulated


Чтобы определить, может ли EC пластичность в отношении артериальрно-венозной дифференцировки происходит также и в отношении нормального эмбрионального развития, мы изучали желточные мушки эмбрионов разных стадий, используя комбинацию time-lapse видео-микроскопии живых эмбрионов и гибридизацию in situ с маркерами, специфичными для артерий и вен (LeNoble et al., 2004). Мы наблюдали, что до начала циркуляции артериальные маркеры экспрессируются в артериальном капиллярном сплетении и заднего полюса эмбрионов, территории, где формируется vitelline артерия. Многие мелкие капиллярные веточки этого артериального сплетения оказываются отсоединенными от основной ветви вителлиновой артерии во время её образования. Экспрессия артериальных маркеров в этих несоединенных веточках быстро подавляется (Рис. 4D). Напротив, экспрессия артериальных маркёров поддерживается во вновь формируемой вителлиновой артерии (Рис. 4D). Не соединившиеся капилляры, в которых подавлены артериальные маркеры теперь служат для образования вителлиновой вены. Эти наблюдения показывают, что задняя вителлиновая вена формируется благодаря инкорпорации ранее артериальных капиллярных сегментов, демонстрируя, что EC пластичность необходима и во время нормальной артерио-венозной дифференцировки. Более того, эти эксперименты подтвердили, что гемодинамические силы играют главную роль во время артериально-венозной дифференцировки и формирования паттерна.
Чтобы проверить эту идею непосредственно мы вызывали некоторые альтерации в кровотоке развивающихся эмбрионов кур (LeNoble et al., 2004). Сначала мы получали эмбрионов, лишенных циркуляторной системы, нарушая эмбриональное сердце. У таких эмбрионов желточный мешок продолжает расти, по крайней мере в течение 7 дней, несмотря на дегенерацию эмбриона и отсутствие перфузии. Однако, желточный мешок не мог формировать артерии и вены и сохранял конфигурацию первичного сосудистого сплетения. При гибридизации In situ с артериальными маркерами было установлено, что некоторые области этого желточного мешка экспрессируют артериальный маркер ephrinB2, тогда как др. нет. Т.о., инициация экспрессии артериальных маркеров происходит независимо от тока. Затем мы производили перевязку вителлиновой артерии на одной из сторон желточного мешка (Рис. 5) (Stephan, 1952). У таких эмбрионов вся перевязанная сторона становилась venularized в течение более 24 ч, на это в первую очередь указывало направление кровотока, которое становилось направленным в обратную сторону в перевязанном сосуде и, во-вторых, по экспрессии артериальных маркеров, которые быстро исчезали после перевязки (LeNoble et al., 2004). Т.о., манипуляции с паттерном кровотока могут морфологически и генетически трансформировать артерии в вены. Те же самые манипуляции с кровотоком могут также трансформировать вены в артерии. В самом деле вителлиновая артерия на противоположной стороне значительно увеличивалась после перевязки, т.к. она получала больше крови. Постепенно эти артерии пересекали срединную линию оси эмбрион-желточный мешок как на переднем, так и заднем полюсе эмбриона (Рис.5). Time-lapse видио-микроскопия показала, что веточки передней вителлиновой вены интегрируются в вителлиновую артерию, когда она пересекает срединную линию. Следовательно, кровоток служит как мастер-регулятор артериально-венозной дифференцировки в желточном мешке. Скорее это, чем предетерминированность, ЕС сосуды желточного мешка, по-видимому, служат 'кирпичиками', которые могут быть использованы развивающейся сосудистой системой для формирования артерий или вен.

Formation of the lymphatic vascular system


Лимфатическая система является последним сосудистым компартментом, который формируется во время развития. Florence Sabin впервые предложила теорию образования лимфатических сосудов. Она пришла к заключению, что самые ранние примитивные лимфатические сосуды являются результатом отделения EC от кардинальных вен. Затем эти клетки пролиферируют и мигрируют в направлении органов эмбриона и формируют лимфатическую систему (Sabin,1902). Др. исследования показали, что соединение лимфатической и венозной систем вторично. Было предположено, что лимфатические стволовые клетки, наз. lymphangioblasts, пронизывают мезенхиму чтобы сформировать примитивные лимфатические мешки (Huntington and McClure, 1908; Kampmeier, 1912). Недавние исследования с использование зачатков конечностей эмбрионов кур показали, что лимфатические сосуды могут происходить благодаря как отделению сосудов от кардинальной вены, так и благодаря мезодермальным lymphangioblasts (Schneider et al., 1999; Wilting et al., 2001; Wilting et al., 2000).
Специфические маркеры для лимфатических EC, идентифицированные недавно, стали новым инструментом для изучения лимфангиогенеза. Кроме того были идентифицированы различные молекулы, участвующие в последовательных ступенях развития лимфатической системы (Рис. 6). Самым ранним маркером лимфатических EC является гомеобоксный транскрипционный фактор Prox-1 (prospero-related homeobox protein-1) (Wigle and Oliver, 1999). Prox-1 впервые обнаруживает свою экспрессию в сосудистой системе в латеральном аспекте задней кардинальной вены на ст. E9, незадолго перед началом отделения (sprouting)



Рис. 6. Formation of the lymphatic vascular system. Schematic drawing representing the initial steps of lymphatic vessel formation. Mouse mutants implicated in these steps are indicated. See text for details.

лимфатических EC от этой вены. Инактивация Prox-1 приводит к полному отсутствию образования лимфатических EC. Детальный анализ фенотипа Prox-1-/- мышей показал, что происходит отпочкование лимфатических ЕС от латерального аспекта кардинальных вен. Однако, отпочковавшиеся клетки неспособны приобретать экспрессию специфичных лимфатических маркеров и вместо этого продолжают экспрессировать маркеры кровеносных сосудов, которые обычно подавляются после отпочкования (Wigle et al., 2002). Спецификация лимфатических EC т.о. зависит от присутствия Prox-1.
После спецификации лимфатические EC эти клетки обычно мигрируют, чтобы сформировать первые эмбриональные лимфатические мешки. Миграция лимфатических EC в направлении лимфатических мешков сильно зависит от присутствия фактора роста VEGF-C: у мышей, дефицитных по этому фактору роста, экспрессирующие Prox-1 лимфатические EC образуются, но неспособны мигрировать в направлении лимфатических мешков и постепенно погибают (Karkkainen et al., 2004). VEGF-C-/- погибают примерно на ст. E17 из-за образования массивного отёка, т.к. kyb не образуют лимфатических сосудов. VEGF-C специфически связывается с высоким сродством со своими тирозин киназными рецепторами VEGFR3 (Alitalo and Carmeliet, 2002 for review). Во время эмбриогенеза, VEGFR3 впервые экспрессируется в субнаборе EC кровеносных клеток, а затем становится ограниченным лимфатическими EC (Kaipainen et al., 1995; Wilting et al., 1997). В соответствии с этой ранней экспрессией VEGFR3 подтвержено вовлечение его в эмбриональный ангиогенез (Dumont et al., 1998). Дефицитные по VEGFR3 мыши обнаруживают дефектное развитие кровеносных сосудов на ранних стадиях эмбриогенеза и эмбрионы погибают на ст. E9.5. Васкулогенез и ангиогенез происходят. но крупные сосуды становятся аномально организованными с дефектными просветами, что приводит к накоплению жидкости в перикардиальной полости и к сердечно-сосудистой недостаточности (Dumont et al., 1998). Т.о., VEGFR3 существенен для функции ремоделирования первичной капиллярной васкулатуры еще до образования лимфатических сосудов. VEGF-C также соединяется с NRP-2 рецептором, который специфически экспрессируется венами и постепенно становится ограниченным лимфатическими сосудами (Karkkainen et al., 2001; Yuan et al., 2002). В соответствии с этой специфической экспрессией мы показали, что мыши, дефицитные по NRP-2 обнаруживают избирательные дефекты в образовании лимфатических сосудов (Yuan et al., 2002). Интересно, однако, что фенотипы VEGF-C и NRP-2 дефицитных мышей, по-видимому, различны. У NRP-2-/- мышей формирование лимфатических мешков происходит нормально, тогда как отделение лимфатических сосудов от лимфатических мешков к периферии редуцировано (Рис. 6). Точные молекулярные механизмы, регулирующие различные ступени эмбрионального лимфангиогенеза еще предстоит выяснить.

Perspectives


Research carried out over the past decade has provided major insights into the mechanisms regulating the emergence of endothelial progenitors from the mesoderm, their coalescence into the primary vascular system, the remodeling of this system into arteries and veins as well as into the formation of lymphatic endothelium. The molecules implicated in these different developmental processes are also essential for the maintenance of the adult vascular system. For example, patients suffering from hereditary lymphedema have been found to carry a mutation in the tyrosine kinase domain of VEGFR3 (Karkkainen et al., 2000). Elucidation of the precise function and interaction of the different molecular players will thus certainly lead to the development of novel treatments for vascular disorders. A particularly interesting aspect of recent research carried out on the vascular system is the identification of neural guidance receptors such as ephrins and neuropilins, which are expressed on arteries, veins and lymphatic vessels. In the nervous system, these molecules are implicated in the establishment of cell boundaries and in the guidance of developing axons. It is thus tempting to speculate that these receptors may also play a role in vessel guidance during embryonic development. Indeed, recent studies have shown that specialized cells termed ‘tip cells’ are present at the ends of developing vessel sprouts, which extend filipodia that explore their environment in much the same way as the growth cone of a developing axon (Gerhardt et al., 2003; Ruhrberg et al., 2002). Moreover, the patterning of developing arteries in the limb skin of mouse embryos has been shown to depend on interactions with nerves (Mukouyama et al., 2002), emphasizing the close interaction between the two systems. Future studies will be directed at exploring the precise interactions between blood vessels and nerves during development as well as in pathologies.