(Рис.1.Рис. из статьи M. Ishibashi and A.P. McMahon, 2002)  |  A failure in growth of diencephalic and midbrain primordia in Shh mutants. Morphology of wild-type (A,C) and Shh mutant (B,D) brains at 8.5 dpc (13 somite; A,B) and 9.5 dpc (26 somite; C,D). At 8.5 dpc, the presumptive diencephalon is recognized as a narrow region between two constrictions (Region I). Region II corresponds to the midbrain and Region III to the anterior hindbrain between the isthmus and otic vesicle (ot). A sharp ventral constriction was observed in Shh mutants (arrows in B,D). At 9.5 dpc, regions I and II of Shh mutant were smaller than those of wild type, but Region III of the mutants was still comparable with that of wild type (see text, Table1). (E-J) Expression patterns of Emx2, En1 and Pax6. A gap between the Emx2 and En1 expression domains represents the anterior midbrain and P1/2 (brackets in E-H). No difference was observed in this region at the 14-somite stage (E,F) but by the 21-somite stage, the gap was greatly reduced in Shh mutants (G H). The anterior midbrain, a gap between the Pax6 and En1 expression domains, was also reduced in Shh mutants (I,J). Arrowheads in I,J indicate the forebrain-midbrain boundary. Scale bars: 200 µm.


(Рис.2.)  |  Expression of region-specific markers in the forebrain and midbrain at 9.5 dpc. Bf1 (A,B), Emx2 (C,D), Pax6 (E,F), Wnt3a (G,H), Wnt7b (I,J) and Dbx1 (K,L) were examined in wild-type (A,C,E,G,I,K) and Shh mutants (B,D,F,H,J,L). Expression of Bf1 was weaker in Shh mutants than in wild type. Emx2 expression was essentially the same between wild-type and Shh mutants, although the telencephalon of Shh mutants was smaller than that of wild-type embryos at this stage. Pax6 expression in the forebrain terminates at the forebrain-midbrain boundary (arrowhead) in both wild type and Shh mutants. Wnt3a expression undergoes a wedge-shaped lateral expansion in P2 of wild-type embryos at this stage (G, arrow). This expansion was detected in the mutant, although expression was reduced (H, arrow). Wnt7b was expressed in the anterior diencephalon (I, arrow) as well as the telencephalon of wild type. Wnt7b expression in the anterior diencephalon was also detectable in Shh mutants (J, arrow). Dbx1 was expressed in the basal plate of P3 (K, arrow) and alar plates of P1/2 and midbrain (K). Dbx1 expression was almost at background levels in Shh mutants (L). All arrowheads indicate the boundary between the diencephalon and midbrain. hs, hemispheric sulcus (the boundary between the telencephalon and diencephalon). Scale bars: 200 µm.


(Рис.3.)  |  Cell proliferation defects in Shh mutants. (A-G) BrdU incorporation analysis at the 15- to 16-somite stages. (A,B) The plane of sections examined. BrdU was detected by immunostaining with Alexa 568-conjugated secondary antibody [yellow because of overlap with YoPro1 (green) labeled nuclei]. In wild type, the telencephalon (C), diencephalon (D) and midbrain (E) showed similar incorporation rates (G, black square). In Shh mutants (F), only the telencephalon showed a comparable rate with that of wild-type embryos, while the diencephalon and midbrain showed significantly decreased rates of BrdU incorporation (G, circles). (H,I) Ccnd1 (cyclin D1) expression at the 17-somite stage. In wild type (H), Ccnd1 expression was detected in all three brain regions. The anterior midbrain showed a higher level of expression than others. In Shh mutants (I), its expression was absent from the diencephalon and weaker in the anterior midbrain. Note that the strong expression in the tail was maintained in Shh mutants (I, asterisk). Arrowhead in H and I indicates the diencephalon-midbrain boundary. t, telencephalon; d, diencephalon; m, midbrain.


(Рис.4.)  |  Expression analysis of Wnt signaling components. Tcf4 expression was examined at the 12- (A), 14- (B,C) and 16-somite (D,E) stages. At the 12-somite stage, Tcf4 expression was not detectable in the diencephalon (A). Expression here was first observed at the 14-somite stage in wild type (B), but not in Shh mutants (C). r5 expression of Tcf4 was observed in both wild-type and Shh mutants at this stage (B,C, arrow). At the 16-somite stage, Tcf4 expression became stronger in the wild-type diencephalon (D), but was still not detectable in the diencephalon of Shh mutants (E). Wnt1 (F,G) and Wnt3a (H,I) were also examined at the 14- and 16-somite stages, respectively. Their expression in the dorsal midline of the diencephalon (*) was maintained in Shh mutants (G,I). Arrowhead indicates the diencephalon-midbrain boundary. Scale bars: 100 µm.


(Рис.5.)  |  Increased cell death in Shh mutant brains. TUNEL assay was performed on wild-type (A) and Shh mutant (B) sections at the 15-somite stage. The plane of sections is shown in Fig. 4A,B. Few cells were positive for TUNEL (orange dot) in wild-type embryos, while Shh mutants exhibited increased cell death especially in the diencephalon and anterior midbrain. Bmp4 expression was examined at the 15-somite (C,D) and 19-somite (E,F) stages. At the 15-somite stage, there was no Bmp4 expression in the dorsal midline of the diencephalon and midbrain. At the 19-somite stage, robust expression of Bmp4 was observed in this region in Shh mutants (F). Arrowhead indicates the diencephalon-midbrain boundary. t, telencephalon; d, diencephalon; m, midbrain.


(Рис.6.)  |  Shh signaling is confined to ventral brain regions. Shh (A,C) and Ptch (B,D) expression were examined at the 14- (A, B), 24- (C) and 21-somite (D) stages. Ptch was not detectable in any dorsal parts of the brain. Note that lateral expansion of Shh expression in the ZLI initiates at the 24-somite stage (C, arrow). Arrowhead indicates the diencephalon-midbrain boundary.


(Рис.7.)  |  Fgf15 and Fgf receptor expression in the diencephalon and midbrain of wild-type (A,B,D,F,H,J,L,N) and Shh (C,E,G,I,K,M,O) mutant embryos. (A) Fgf15 and Shh expression. (B-G) Fgf15, (H-K) Fgfr2 and (L-O) Fgfr3 expression. (A) At the 12-somite stage, Fgf15 (purple) was strongly expressed in the ventral regions of the diencephalon (white arrow), dorsal to the Shh expression domain (white arrowhead, brown). Black arrows indicate the ventral Shh expression domain in the midbrain. (B) A lateral view reveals the extent of ventral expression of Fgf15 in the brain. Note that Fgf15 expression was undetectable in dorsal regions of the diencephalon and midbrain at this stage. (D,F), Fgf15 shows a ventral to dorsal expansion from the 12- to 16-somite stage in diencephalic and midbrain primordia of wild-type embryos. (C,E,G), Shh mutants showed no expression of Fgf15 in the caudal diencephalon and anterior midbrain at all stages examined, whereas expression at the midbrain/hindbrain isthmus (arrow) remains in Shh mutants. Expression of Fgfr2 in the diencephalon and anterior midbrain in wild type (H,J) extends ventrally in Shh mutants (I,K). Downregulation in the expression of Fgfr3 (compare L,N with M,O) correlates with the growth defect in these regions of Shh mutants. Arrowhead indicates the diencephalon-midbrain boundary. Scale bars: 100 µm.


(Рис.8.)  |  Fgf15 induces an expansion of Tcf4 expression in brain explants. (A) GFP activity in the right side of the brain explant shown in B after electroporation with pCIG-F15. The broken line in both panels indicates the ventral midline. Explants were cultured for 40 hours after electroporation and examined for Tcf4 expression. In the case of the control vector expressing only GFP (C), there was no significant difference in Tcf4 expression on the electroporated (right, indicated by arrow) and non-electroporated sides (left). By contrast, explants electroporated with the Fgf15-expressing vector (pCIG-F15) showed an expansion of the Tcf4 expression domain on the electroporated side (D, arrow). Rostral is towards the top in all panels.

Sonic hedgehog (Shh) является секреторной молекулой, которая, как предполагали, регулирует тканевой рост и паттернирование у эмбрионов позвоночных. Хотя сообщалось о том, что Gli транскрипционные факторы опосредуют передачу Shh сигналов в ядра, было немного известно о генах-мишенях Gli во время развития. Ранее авторами было показано, что Shh необходим для экспрессии Fgf15 в промежуточном и среднем мозге. В этой работе авторы поставили перед собой задачу выяснить, является ли Fgf15* прямой мишенью Shh сигналов через Gli. Shh экспрессировался в клетках срединной линии, а Fgf15 в медиальной области промежуточного/среднего мозга на стадии 7 сомитов. На этой стадии развития область Fgf15 экспрессии совпадала с областью экспрессии Gli1 и перекрывалась с областью экспрессии Gli2 . На стадии 7 сомитов у Shh мутантных эмбрионов экспрессия Fgf15 в промежуточном/среднем мозге была значительно снижена. Трансгенный анализ показал, что 3.6-kb 5’-фланкирующей области Fgf15 гена достаточно для индукции Fgf15 в медиально/вентральном промежуточном/среднем мозге. Люциферазный анализ показал, что 3.6-kb Fgf15 энхансер/промотер активировался Gli2. Gli-связывающий сайт был локализован на 1kb выше стартового сайта транскрипции и был необходим для экспрессии в медиально/вентральном промежуточном/среднем мозге у трансгенных эмбрионов и для активации при люциферазном анализе. Эти данные указывают на то, что Fgf15 регулируется непосредственно Shh сигналами через Gli белки.

В развивающейся нервной системе нейральные предшественники и/или стволовые клетки активно пролиферируют, чтобы подготовить клеточную основу для более поздней паттернализации. Размер и форма ткани также зависят от клеточной выживаемости и спецификации. Предполагали также, что скорость локального роста и клеточная спецификация регулируется экспрессией некоторых секреторных молекул. Некоторые разновидности этих регуляторных групп могут координировать клеточную пролиферацию, выживаемость и спецификацию между соседними участками для поддержания целостности ткани. Поняв молекулярные механизмы такой регуляторной сети можно было бы лучше понять процессы морфогенеза

. Sonic hedgehog (Shh) относится к членам семейства сигнальных молекул Hedgehog (Hh) у позвоночных. Сообщалось, что Shh участвует в паттернировании разных тканей. Имеются также доказательства, подтверждающие, что Shh играет ключевую роль в клеточной пролиферации и выживаемости. Hh сигналы трансдуцируются в цитоплазму с помощью двух трансмембранных белков – Patched (Ptch) и Smoothened. Затем Ci/GLI, транскрипционные факторы «цинковые пальцы» участвуют в передаче сигналов в ядро. Ci у дрозофилы является главным триггером для Hh сигнализирования. В присутствии Hh Ci активирует транскрипцию генов-мишеней. И, напротив, processed форма Ci репрессирует экспрессию генов в отсутствие лиганда. У позвоночных Hh сигнальная трансдукция опосредуется, по меньшей мере, тремя Gli транскрипционными факторами – Gli1, Gli2, Gli3. Gli1 является сам транскрипционной мишенью Shh сигналов и предполагают, что он функционирует только как трансактиватор Gli2 и Gli3 . которые оба имеют домены трансактивации и репрессии и активируют гены-мишени в присутствии Shh сигналов, так же как и Gli у дрозофилы. Генетические исследования показали, что Gli2 является основным медиатором для начальной реакции на Shh сигналы, а Gli3 играет критическую роль в клеточной спецификации вдоль дорсовентральной оси нервной трубки, тогда как Gli1 не столь важен во время развития

. Несмотря на то, что сигнальный путь Shh хорошо изучен во время процесса развития и при заболеваниях человека, было идентифицировано крайне мало регуляторных генов (в развитии), являющихся непосредственными мишенями Shh сигналов. У мышиных эмбрионов HNF-3β является регулятором раннего развития нотохорды и формирования пластинки дна, а его экспрессия при формировании пластинки дна контролируется Shh и Gli2.

Ранее этими же авторами было показано, что Shh сигналы нужны для нормального развития дорсальной и вентральной областей промежуточного мозга и передней части среднего мозга. В других областях нервной трубки Shh важен только для развития вентральной половины. Анализ экспрессии Ptch1 подтвердил, что Shh не передает сигнал прямо в дорсальные области. Последующие данные показали, что Fgf15 передает Shh «вентральный» сигнал в дорсальные области. И хотя сообщалось, что Fgf15 экспрессируется во время развития центральной нервной системы, его роль в нервной трубке еще требует исследования. Детальный анализ показал, что Fgf15 изначально экспрессируется в вентральной части промежуточного мозга и в среднем мозге, а зона экспрессии распространяется дорсально на более поздних стадиях. У Shh мутантных эмбрионов экспрессия Fgf15 не определялась в промежуточном мозге и среднем мозге между стадиями 12 и 16-сомитов. Однако это исследование не позволило ответить на вопрос, является ли Fgf15 прямой мишенью Shh сигналов или, напротив, есть другие сигналы между Fgf15 и Shh. В данном исследовании авторы изучали участие белков Gli в активации экспрессии Fgf15 в среднем и промежуточном мозге. Области экспрессии Gli1 и Gli2 перекрывались с областями Fgf15 экспрессии во время такой индукции. Люциферазное (luciferase ) тестирование показало что Gli2 активирует Fgf15 энхансер/промотер через Gli-связывающий сайт. Этот сайт необходим для экспрессии в медиальном/вентральном промежуточном и в среднем мозге у трансгенных эмбрионов. Данные авторов подтвердили, что Fgf15 является непосредственной мишенью Shh сигнализирования, осуществляемого через Gli транскрипционный фактор.

Индукция экспрессии Fgf15 в медиальном/вентральном промежуточном и среднем мозге. Редукция среднего мозга у Shh мутантов

Ранее авторы сообщали о том, что Fgf15 экспрессировался в вентральной части промежуточного и среднего мозга у эмбрионов «дикого типа» примерно к стадии 12 сомитов. Такая экспрессия не определялась у Shh мутантов, что свидетельствует о необходимости присутствия Shh сигнализирования для экспрессии Fgf15 на этой и более поздних стадиях развития. Для детального анализа паттерна экспрессии Fgf15 (по отношению к Shh сигналам) авторы провели in situ гибридизацию на более ранних стадиях развития. Поскольку ранее сообщалось, что Shh экспрессия определяется в в головной складке эмбриона на стадии 8 сомито, авторы исследовали экспрессию Fgf15 и Shh на 3-х и 7-и сомитной стадии. Никакой экспрессии этих генов не было найдено на стадии 3 сомитов, однако на стадии 7 сомитов Shh экспрессировался в клетках срединной линии промежуточного/среднего мозга (РИС.1С). С другой стороны Fgf15 экспрессровался в медиальной (вентральной на более поздних стадиях) области, но не в срединной линии (РИС.1А). Интересно то, что Fgf15 экспрессия имела медиальный high ? латеральный low градиент паттерна (РИС,1А). На той же стадии развития у Shh мутантов экспрессия этих генов в промежуточном/ среднем мозге была значительно снижена – почти до нуля, тогда как в заднем мозге она сохранялась (РИС.1В). Эти данные подтверждают, что Fgf15 индуцируется SHH из клеток срединной линии и в промежуточном/среднем мозге и такая индукция зависит от «дозы». Т.к. экспрессия Fgf15 исключается из клеток срединной линии, то вполне вероятно, что репрессоры против экспрессии Fgf15 индуцируются при более высоких уровнях Shh сигнализирования.

Fgf15 область экспрессии совпадает с областью экспрессии Gli1 и перекрывает область экспрессии Gli2 в промежуточном и среднем мозге

Хотя механизмы внутриклеточной трансдукции Shh сигнализирования поняты еще недостаточно, имеется достаточно данных в поддержку того, что Gli транскрипционный фактор (гомолог Ci у дрозофилы) у позвоночных играет главную роль в передаче Shh сигналов в ядра. Для идентификации участия Gli транскрипционных факторов в индукции Fgf15 в промежуточном и среднем мозге, был изучен паттерн экспрессии Gli 1 2 и 3 по отношению к паттерну экспрессии Fgf15. Устойчивая экспрессия всех трех Gli генов наблюдалась в промежуточном и среднем мозге на стадии 7 сомитов. Их паттерн экспрессии очень напоминал паттерн, наблюдаемый ранее (Hui 1994, Lee, 1997, Sasaki, 1997) (РИС,1 D-F). Экспрессия Gli1 показала сходный паттерн с паттерном Fgf15 в медиальной области (РИС.1 D), подтверждая тем самым, что Gli1 опосредует индукцию Fgf15 через ген Shh. Область экспрессии Gli2 распространялась на промежуточный/средний мозг и, таким образом, покрывала область экспрессии Fgf15 (РИС.1Е) Т.к. Gli2 активирует гены только в присутствии Shh сигналов, это согласуется с тем, что Gli2 опосредует индукцию Fgf15 осуществляемую через Shh. Gli3 обнаружил комплементарный паттерн с Gli1 (РИС.1 F). Т.о. эти данные согласуются с возможностью того, что Gli1 и / или Gli2 могут участвовать в индукции Fgf15 в промежуточном и среднем мозге.

3.6-kb фланкирующие области Fgf15 гена содержат достаточно позитивных регуляторных элементов для экспрессии Fgf15 в промежуточном и среднем мозге.

Для идентификации регуляторных элементов для Fgf15 экспрессии в промежуточном и среднем мозге на эмбриональной стадии Е8.5 авторы впервые изолировали 12 и 3,6-kb фрагменты upstream (расположенные выше) сайта инициации транскрипции. После этого 12 и 3,6-kb фрагменты были протестированы на cis-активность путем получения трансгенных эмбрионов мышей, несущих репортерный lacZ ген. Анализ трансгенной экспрессии проводили на Е8.5. С 12 и 3,6-kb фрагментами 2 и 3 эмбрионов обнаружили экспрессию lacZ соответственно (Рис.3, 6D). У всех трансгенных эмбрионов lacZ показал сходный паттерн экспрессии к эндогенному Fgf15 в промежуточном и среднем мозге во время Fgf15 индукции, за исключением того, что он также экпрессировался в клетках вентральной средней линии (Рис.3. Экспрессия lacZ в клетках вентральной средней линии предполагает отсутствие отрицательных регуляторных элементов, т.к. экспрессии эндогенного Fgf15 в этой области не наблюдали. Предполагается также, что позитивные регуляторные элементы активировались в ответ на Shh сигналы из нотохорды и/или пластинки дна в отсутствии негативных элементов. На стадии 12 сомитов lacZ экспрессировался в дорсальных областях и промежуточного и среднего мозга (Рис.3С). Такой паттерн экспрессии был почти идентичен паттерну эндогенного Fgf15 (Рис.3D). Эти находки указывают на то, что 3.6 kb фрагмент имеет достаточно позитивных регуляторных элементов для Fgf15 экспрессии в промежуточном и среднем мозге. Если учесть и паттерн экспрессии Gli, то эти данные увеличивают вероятность того, что 3,6-kb энхансер/промотер Fgf15 гена может содержать Gli-связывающие сайты.

Gli2 прямым образом активирует экспрессию Fgf15 в клетках C3H10T1/2 через Gli-связывающий сайт в 3.6-kb энхансер/промотер области

Для изучения вопроса о том, регулируется ли 3.6-kb энхансер/промотер Gli транскрипционными факторами, авторы провели люциферазный анализ используя C3H10T1/2 клетки. Известно, что эта клеточная линия хорошо реагирует на Shh сигналы. А это означает, что в этой линии присутствует набор молекулярных механизмов для Shh сигнализирования. Действительно, когда 8х3’Gli BS-Luc репортер, содержащий тандемно повторяемый Gli-связывающий сайт HNF-3β ген, был трансфицирован в эту клеточную линию с экспрессионными векторами Gli1 и Gli2 люциферазная активность увеличилась в 62 и 8 раз соответстенно (Рис.4А) Люциферазные репортеры, содержащие 430-bp Fgf15 промотер или 3.6-kb Fgf15 энхансер/промотер были трансфицированы в клетки с или без экспрессии векторов экспрессии Gli1, Gli2 и hGLI3. Было установлено, что все три Gli транскрипционных фактора не активировали 430-bp промотер (Рис.4В). В отличие от этого, Gli2 вызывал значительную трансактивацию 3.6-kb ‘y[fycthf|ghjvjnthf (Рис.4В). Неожиданным результатом явилось то, что Gli1 не усиливал люциферазной активности, подтверждая тем самым то, что Gli1 недостаточно для индукции Fgf15. Те же результаты были получены с 12-kb энхансером/промотером. Более того, hGLI3. не активировался 3.6-kb энхансером/промотером и не подавлял Gli2 опосредованную активацию 3.6-kb энхансера/промотера. Когда трансфицировали вектор Gli2 или Gli2δNδ которые кодируют конститутивную активаторную форму Gli2, то наблюдали повышение регуляции эндогенного Fgf15 гена в клетках C3H10T1/2. Это говорит о том, что Gli2 индуцирует экспрессию Fgf15 in vitro.

Для выяснения того, повышает ли Gli2 непосредственно Fgf15 авторы исследовали последовательность для GLI-связывающего consensus у человека. Вышестоящий на 1 kb от начала транскрипционного сайта имел сходну последовательность с GLI-связывающим consensus. Авторы провели также еще ряд исследований позволивших им придти к заключении, что Gli2 трансактивирует 3.6-kb Fgf15 энхансер/промотер путем прямого связывания с GliB-Swt in vitro.

Gli-связывающий сайт важен для Fgf15 индукции в медиальном/вентральном промежуточном мозге у трансгенных эмбрионов Значение Gli-связывающий сайта в Fgf15 регуляции in vivo был изучен с помощью транзиторного трансгенного анализа. В этом эксперименте GliBSwt был перемещен с GliBSMut в 3.6-kb Fgf15 энхансер/промотер трансгена. Эта мутация Gli-связывающего сайта полностью устраняла экспрессию lacZ в медиальном/вентральном промежуточном мозге и среднем мозге (Рис.6А-С). у всех изученных трансгенных эмбрионов. Следовательно, Gli-связывающий сайт в 3.6-kb Fgf15 энхансер/промотере имел важные позитивные регуляторные функции для экспрессии в медиальном/вентральном промежуточном мозге и среднем мозге. Напротив, экспрессия трансгена оставалась в заднем мозге с мутированным энхансер/промотером, что согласуется с доказательствами того, что Fgf15 еще экспрессировался в заднем мозге Shh мутантов. Также мутация Gli-связывающего сайта сохраняла дорсальную экспрессию Fgf15 в промежуточном/среднем мозге, подтверждая косвенную роль Shh в дорсальных областях. Эти данные свидетельствуют в пользу , что Fgf15 экспрессия инициируется непосредстенно Shh сигналами через Gli транскрипционные факторы в медиальном/вентральном промежуточном мозге и среднем мозге in vivo. Fgf15 экспрессия в медиальном/вентральном промежуточном мозге и среднем мозге не снижена у Gli2 мутантов. Для выявления того является ли Gli2 единственным медиатором Fgf15 индукции в медиальном/вентральном промежуточном мозге и среднем мозге in vivo, авторы изучали экспрессию Fgf15 у Gli2 мутантных эмбрионов. Fgf15 экспрессия в медиальном/вентральном промежуточном мозге и среднем мозге не была снижена у этих мутантов (Рис.7В), указывая на то, что Gli2 не является единственным активатором Fgf15 индукции. Область средней линии в промежуточном и среднем мозге, не экспрессирующая Fgf15 у эмбрионов дикого типа, имела тенденцию к редукции у у Gli2 мутантных эмбрионов , а это может иметь отношение к отсутствию у них дифференцировки пластинки дна.