Посещений:
Гематопоэтическая Система

в Эмбриогенезе Человека

Embryonic development of the human hematopoietic system
MANUELA TAVIAN and BRUNO PEAULT
Int. J. Dev. Biol. 49: 243-250 (2005) doi: 10.1387/ijdb.041957mt

Human hematopoiesis is initiated in the yolk sac during the third week of development. At the same time the capacity to produce blood cells also arises in the embryo, within the splanchnopleura, but this potential is not expressed before day 27, when clustered hematopoietic stem cells emerge from the ventral wall of the aorta and vitelline artery. Budding of hematopoietic cells from vessel walls reflects the re-differentiation of local endothelial cells, which are likely derived from angio-hematopoietic mesodermal ancestors emigrated from the splanchnopleura. Yolk sac-derived stem cells are limited to myelo-erythroid development, whereas those born in the embryo are, in addition, lymphopoietic and therefore represent the first multi-potent, adulttype blood progenitors that appear in human ontogeny, preceding shortly the onset of liver hematopoiesis. These results allowed the establishment of a novel hierarchy of blood-forming tissues in human development and induced an in depth reconsideration of the very origin of definitive human hematopoiesis. These results also fully corroborate the outcome of experiments performed in parallel in avian and mouse embryos and point to the conservation in all higher vertebrates of an ancestral route of blood cell production via embryonic vessel walls.
(
У взрослых млекопитающих гематопоэз обычно происходит в костном мозге, который поддерживает одновременно внутри самостоятельных клеточных условий в течение всей жизни стволовые клетки и регулирует продукцию конечных стадий lymphoid, myeloid и erythroid клеток. Hematopoietic stem cells (HSC) во взрослом костном мозге поддерживаются благодаря репликации и амплификации линий HSC, которые появились в раннем онтогенезе, когда костный мозг ещё не сформировался.
В самом деле, происходит последовательная смена органов, предназначенных для продукции кровяных клеток во время эмбриогенеза позвоночных. У позвоночных самая ранняя гематопоэтическая активность проявляется в виде появления кровяных островков в мезодерме вне-эмбрионального желточного мешка. Желточный мешок, предназначен принципиально для примитивного эритропоэза, позднее заменяется печенью и селезенкой, роль которых в продукции кровяных клеток варьирует филогенетически, и в конечном итоге тимус и костный мозг становятся местом постнатального гематопоэза. Кровяные клетки прослежены в ходе эмбрионального развития на parabiotic sex-mismatched эмбрионах кур (Moore and Owen, 1967) и позднее с помощью системы химер перепел-курица (rev. Le Douarin et al., 1984). Эти эксперименты показали, что развитие внутри-эмбриональной кровь-формирующей ткани зависит от колонизации этих рудиментов кровь-продуцирующими гематопоэтическими клетками предшественниками. Это наблюдение послужило первой основой для превалирующей идеи, что YS является уникальным поставщиком HSC (Moore and Owen, 1967). Согласно этой теории развитие кровяной системы у позвоночных описывается как монофилетический процесс с уникальным органом, продуцирующих гематопоэтические клетки - желточным мешком - колонизирующие др. органы: сначала печень, затем тимус, селезенку и наконец костный мозг (Moore and Metcalf, 1970).
Скудость доступных тканей человека на ранних стадиях эмбриогенеза, а также очень узкий набор подходов, с помощью которых клетки человека могут быть проанализированы, затрудняет изучение возникновение гематопоэтической системы у человека (Rosenberg, 1969). Эта ситуация изменилась в конце 1980-ых с появлением быстро увеличивающихся наборов маркеров для гематопоэтических клеток человека, с разработкой длительных культур HSC человека и с успешными прививками гематопоэтических клеток человека иммунодефицитным мышам (rev. Peault et al., 1992; Peault, 1995; Peault et al., 1992; Vormoor et al., 1995). Такие технические улучшения пролили новый свет на онтогенетическую гематологию, включая идентификацию HSCs человека на пре- и постнатальных стадиях (Baum et al., 1992, Charbord et al., 1996a, Kyoizumi et al., 1993, Peault et al., 1991, Uchida et al., 1997). В тот же период, доступ к более ранним стадиям беременности человека стал легче благодаря противозачаточному соединению RU486, которое стало рутинно использоваться для избирательного прерывания ранней беременности во Франции. Наша лаб. в Institut d'Embryologie запустила программу с целью изучения зарождающегося гематопоза в первые два месяца развития человека. Institut d'Embryologie du CNRS et du College de France внёс существенный вклад в развитие гематологии и иммунологии. Путем создания множественных комбинаций тканей перепел/курица N. Le Douarin и его группа расшифровала принципы и хронологию заселения HSC в эмбриональный тимус, сумку Fabricius и костный мозг и выяснила роль эпителия тимуса в индукции толерантности к собственной ткани (rev. Le Douarin et al.,1984). Один из нас участвовал в этих исследованиях по выявлению молекулярных маркеров гематопоэтических клеток птиц, которые были использованы для характеристики онтогенеза клонов кровяных клеток у нормальных эмбрионов и химер перепел/курица (Guillemot et al., 1986, Peault, 1987, Peault et al., 1983). С др. стороны, группа руководимая Franзoise Dieterlen в том же институте бросила вызов монофилетической теории возникновения кровяных клеток, открыв, что стволовые клетки, возникающие внутри собственно эмбриона, а не в желточном мешке, являются источником дефинитивного гематопоэза у птиц (Dieterlen-Lievre, 1975). Сходные выводы были сделаны в той же группе и относительно происхождения HSC у эмбрионов мышей (Cumano et al., 1996). Обе группы Institut d'Embryologie стали также пионерами в изучении сосудистого развития у эмбрионов кур, используя оригинальные маркеры клона hemangioblastic клеток (Pardanaud et al., 1987, Peault, 1987).
Наши наблюдения подчеркивали существование законсервированной схемы возникновения HSC у эмбрионов позвоночных (Tavian et al., 1996). Было идентифицировано внутри-эмбриональное место генерации HSC, была представлена оригинальная модель, согласно которой индукция и регуляция гематопоэза могут быть сближены.

Extra-embryonic generation of hematopoietic cells


Как и в случае др. высших позвоночных гематопоэз у человека начинается вне эмбриона, в желточном мешке, затем временно осуществляется в печени до тех пор пока не будет стабилизирован у костном мозге в течение всей взрослой жизни. Только T клетки продуцируются в одной и той же ткани у эмбрионов, плодов и на постнатальных стадиях.

The yolk sac
У высших позвоночных сеть из агрегатов мезодермальных клеток в источнике как сосудистой, так и гематопоэтической системы развивается вскоре после гаструляции во вне-эмбриональной области. В этих первоначально гомогенных плотных кластерах, периферические клетки приобретают морфологию и маркёры эндотелиальных клеток, тогда как внутренние клетки одновременно исчезают, чтобы открыть первые сосудистые просветы. Глыбки примитивных мезодермальных клеток остаются прилипшими к вновь сформированному сосудистому эндотелию - они называются кровяными островками - и являются источником вне-эмбрионального гематопоэза (Maximov, 1909, Sabin, 1920). Т.к. и эндотелиальные и гематопоэтические клетки развиваются из одних и тех же кластеров мезодермы, то нами было постулировано существование общего родоначального предшественика для обоих клонов: ангиобластов (Sabin, 1920), позднее переименованных в гемангиобласты (Murray, 1932, Sabin, 1920). Этот термин (который первоначально использовался для обозначения групп кровь- и сосуды-формирующих мезодермальных клеток, а не для обозначения одиночных клеток) пал в забвение до тех пор пока существование таких ангиогематопоэтических стволовых клеток не было подтверждено экспериментально (Choi et al., 1998, Eichmann et al., 1997, Peault, 1987). Мезодерма желточного мешка человека обладает локальными утолщениями, которые вероятно представляют собой примордиальные кровяные островки примерно на 16-й день развития (Luckett, 1978). Это слишком ранняя стадия, чтобы избирательно вызвать прерывание беременности. Пока лишь случайные гистологические исследования указывали на то, что желточный мешок человека продуцирует в основном эритроидные клетки (Bloom and Bartelmez, 1940). Иногда отмечалось присутствие макрофагов и примитивных мегакариоцитов (Fukuda, 1973). Хотя исследования появления гематопоэтических клеток на эти х ранних стадиях всё ещё бедны, наши собственные наблюдения с 19-го дня развития указывают на то, что последовательность, описанная для эмбрионов животных, приложима и к желточному мешку человека (Cortes et al., 1999, Tavian et al., 1999). Кластеры примитивных гематопоэтических клеток, происходящие из мезодермы - или кровяных островков - развиваются в тесной ассоциации с эндотелием появляющихся в желточном мешке кровеносных сосудов. Ко-экспрессия CD34 поверхностной молекулы гематопоэтическими клетками внутри плотных кровяных островков и соседними развивающимися эндотелиальными клетками согласуется с существованием общего гемангиобластного предшественника кровяных и эндотелиальных клеточных линий (Tavian et al., 1999). Остается определить, однако, маркирует ли CD34 такие предполагаемые гемангиобласты в недифференцированной мезодерме желточного мешка человека до начала васкулогенеза. В этом отношении экспрессия CD34 в очень раннем желточном мешке человека напоминает таковую MB1 (aka QH1) в желточном мешке перепела. Как и CD34 у человека, гликопротеин MB1 экспрессируется на поверхности эндотелиальных и гематопоэтических клеток перепела в течение всей эмбриональной и после вылупления жизни (Peault et al., 1983). Однако, MB1 впервые экспрессируется в желточном мешке с появлением эндотелиальных клеток скорее, чем раньше, в недифференцированной гемангиобластной мезодерме (Peault, 1987). Это может указывать на то, что эндотелиальные клетки желточного мешка возникают раньше вне-эмбриональных гематопоэтических клеток, как это происходит в случае внутри-эмбрионального гематопоэза (see below). Ранее авт. предполагали существование кровь-формирующих эндотелиальных клеток в желточном мешке птиц (Sabin, 1920). Первое функциональные исследование гематопоэза в желточном мешке человека показало присутствие нескольких генераций клоногенных предшественников на 4.5-неделе развития, включая предшественников плюрипотентных (CFU GEMM), ранних (BFU E), или поздних (CFU E), эритроидных и granulo-macrophage (CFU-GM) (Migliaccio et al., 1986). Частота этих предшественников после этого драматически снижалась, определенно они исчезали после 6 недель беременности. Эти наблюдения были подтверждены др. группой, которая задокументировала присутствие и эритроидных и гранулопоэтических предшественников в желточном мешке на 25 день развития (Dommergues et al., 1992, Huyhn et al., 1995). Однако, эти авт. сообщили, что частота этих предшественников оставалась почти постоянной между 35 и 50 днем. Так как все подходы были использованы на стадиях, когда кровь уже циркулировала между желточным мешком и эмбрионом, то эти расхождения могут отражать присутствие в желточном мешке клеток предшественников внешнего происхождения. Во всяком случае, все эти сообщения согласуются с общим исчезновением гематопоэза в желточном мешке после 60-го дня развития. Следовательно, относительная продолжительность гематопоэза в желточном мешке у человека значительно короче, чем у птиц и грызунов.

Onset of blood circulation


Описанные выше наблюдения указывают на гематопоэтический потенциал клеток предшественников, происходящих из желточного мешка, в культуре которая не обязательно отражает процесс дифференцировки, имеющий место во время нормального развития. Кровяные клетки, продуцируемые в желточном мешке преимущественно являются ядерными эритроцитами, которые синтезируют эмбриональный гемоглобин (ξε). Первая волна продукции эритроцитов в желточном мешке известна как примитивная, в противоположность продукции дефинитивных эритроцитов, которая происходит позднее в печени. Примитивные эритроциты, уже экспрессирующие поверхностную молекулу glycophorin A, обнаруживаются также в полости сердца уже на ст. 3-х сомитов (21 день) (Tavian et al., 1999). Это наблюдение указывает на то, что на этой стадии инициируется соединение между желточным мешком и эмбрионом, кровяные клетки не обнаруживаются внутри эмбриона на 19-й день развития (MT,unpublished observations).

Colonization of embryonic hematopoietic tissues


Начало циркуляции, которое происходит одновременно с началом сердцебиений, позволяет кровяным клеткам, происходящим из желточного мешка проникать в эмбриональные ткани. Первым колонизируемым органом является печень, которая остаётся главной кровь-формирующей тканью у эмбрионов вплоть до инициации гематопоэза в костном мозге.

The liver


Печень развивается из энтодермального дивертикула передней кишки на уровне двенадцатиперстной кишки, который мигрирует рострально и проникает в мезодерму поперечной перегородки (septum transversum). Эти две ткани вносят вклад в печеночные паренхимные тяжи (гепатоциты) и сосудистые синусы, соотв. У эмбрионов человека печеночная пластинка идентифицируется как утолщение энтодермы на ростральном кишечном конце, каудальнее сердца примерно на 22 день беременности (ст. 10-сомитов) (Severn, 1971). Предполагается, что эмбриональный печеночный рудимент человека не способен продуцировать предшественников кровяных клеток, как это ранее было продемонстрировано на мышах (Moore and Metcalf, 1970), он скорее воспринимает гематопоэтические клетки, происходящие из желточного мешка, которые затем пролиферируют и дифференцируются, что впервые было подтверждено Kelemen с коллегами в 1979.

Yolk sac → liver transition


Переход от yolk sac к печеночному гематопоэзу изучали, анализируя программу синтеза гемоглобина и in vitro с помощью clonogenic подхода. Переключение с эмбрионального на фетальный гемоглобин (т.e. ξ→α и ε→γ) происходит в печени, что отражает переход от примитивных ядерных (megaloblasts ) к дифинитивным энуклеированным (macrocytes) эритроцитам (Peschle et al., 1984). Примитивные megaloblasts присутствуют в раннем печеночном рудименте с 4.5 по 5 неделю, затем быстро уменьшаются в числе, замещаясь одновременно дефинитивными macrocytes. Этот феномен согласуется с моноклональной моделью, согласно которой пул из одиночных стволовых клеток впервые даёт начало примитивному эритропоэзу в желточном мешке, затем мигрирует в печень, чтобы дать клон дефинитивных эритробластов (Peschle et al., 1985). Это заключение подтверждается также анализом in vitro colony-forming cells (CFCs) , идентифицированных в желточном мешке, печени и циркулирующей крови. На 5-й неделе пул BFU-E желточного мешка подвергается драматическому уменьшению, в то же время эти предшественники быстро начинают выявляться в кровотоке и паренхиме печени (Migliaccio et al., 1986). Следовательно, стволовые клетки и уже предетерминированные предшественники могут мигрировать из YS в печень примерно на 5-й неделе беременности. В конце первого триместра и далее определяется всё больше примитивных предшественников, CFU-GEMM и high-proliferative potential colony-forming cells (HPP-CFC) , в печени (Hann et al., 1983). Однако наши недавние исследования установили появление гематопоэтических клеток внутри печеночного рудимента на более ранних стадиях развития. На ст. 12 сомитов (23 дня), мы выявили редкие, разбросанные CD34-негативные эритро-миэлоидные клетки внутри развивающихся печеночных синусоидов, это указывает на то, что первая печеночная колонизация происходит на этой стадии. Первые CD34+ гематопоэтические предшественники могут быть распознаны в зачатке печени только с 30-го дня, т.е. со стадии, на которой, как м ы полагаем, происходит вторичная печеночная колонизация. Этот факт говорит о том, что новая волна поступления гематопоэтических клеток в печень на третьей неделе развития человека состоит исключительно из предшественников поздних стадий, что



Fig. 1. Hematopoietic stem cell clusters inside human embryonic arteries. Transverse sections of a 32-day human embryo stained with the anti-CD34 (A) and anti CD45 (B) antibodies. Arrows indicate the clusters of hematopoietic stem cells adhering to the ventral aspect of the aorta (a). Cardinal vein (cv).



Fig. 2. Sequence of hematopoietic stem cell cluster emergence within the human embryo. (A) Starting from 27 days of development, scattered groups of a few hematopoietic stem cells appear, adhering to the aortic endothelium in the pre-umbilical region. Groups of 2-3 cells are also often detected in a more rostral region, where the aorta is still bifurcated. (B) From day 30 of development the hematopoietic cell clusters increase in size and groups of cells are also encountered at the bifurcation of the vitelline artery, always associated with the ventral aspect of the vascular endothelium. The size of hematopoietic progenitor clusters attains several hundreds of cells at 36 days of development (C). At subsequent stages stem cell clusters undergo gradual decrease till day 40, the latest at which they could be detected.

подтверждено экспериментами на клеточных культурах. В самом деле, только после 32 дня развития печень содержит примитивные предшественники способные установить долговременных гематопоэз in vitro (Tavian et al., 1999).

Bone marrow


Костный мозг, главная кровь-формирующая ткань у взрослых млекопитающих, является также последней, которая развивается в онтогенезе, когда гематопоэз уже иссяк в желточном мешке, временно осуществляется в печени и активно развивается в тимусе. Исследования раннего онтогенеза костного мозга бедны. С помощью иммуно-гистохимического подхода мы ранее отследили установление гематопоэза внутри медуллярных полостей человека (Charbord et al., 1996b). Гематопоэз в костном мозге

Fig. 3. Scheme of in vitro assays used to detect myeloid-, NK-, B- and T-cell potentialities in the early human embryo.

начинается с 11-й недели развития человека в специализированных мезодермальных структурах - или первичных logettes - состоящих из рыхлой сети мезенхимных клеток, поддерживаемых с помощью плотного фибриллярного материала, и окружающих центральную артерию. Самые ранние кровяные клетки, которые дифференцируются в костном мозге, являются CD15+ миелоидными клетками, тесно сопровождаемыми glycophorin A+ эритроцитами. Неожиданно этому процессу не предшествует приток CD34+ клеток гематопоэтических предшественников (Charbord et al., 1996b). Следует также отметить, что первичные logettes, где зарождающийся костномозговой гематопоэз, проникающий внутрь медуллярных синусов, располагается на максимально возможном удалении от оссифицирующегося хряща трабекул, на поверхности которых расположены остеобласты костного мозга. Это неожиданно в виду того, что остеобласты, как недавно было показано, представляют собой ключевой компонент гематопоэз-поддерживающей стромы костного мозга и по-видимому, участвует в niche, которая питает гематопоэтические стволовые клетки (Zhang et al., 2003). Мы могли бы помирить эти расходящиеся наблюдения в свете параллельного исследования на костном мозге плодовы мышей (Blazsek et al., 2000). Хотя гематопоэтические клетки колонизируют рудимент мышиного костного мозга примерно на 15-й день развития, эти клетки, по-видимому, являются только предетерминированными предшественниками поздних стадий. Напротив, только спустя 4-5 дней после рождения истинные HSCs, способны засеять долговременные гематопоэтические культуры, возникающие внутри костного мозга мышей.
Возникает ситуация, что в костном мозге плодов (и возможно, до некоторой степени, в эмбриональной печени), первая линия быстро развивающегося гематопоэза устанавливается рано в развитии с помощью предопределенных клеток предшественников для ускоренного сбыта жизнеспособных миэло-эритроидных кровяных клеток. Настоящие HSC, также как и поддерживающее их стромальное окружение, оседают лишь позднее и поддерживают гематопоэз до конца (Blazsek et al., 2000).

Hematopoietic cells also emerge inside the human embryo


Как уже указывалось все наблюдения, описанные выше отражают классическую схему развития гематопоэтической системы человека, согласно которой все кровяные клетки происходят из предшественников, которые образуются в желточном мешке, но персистируют вплоть до взрослого периода. Однако, это мнение о монофилетическом развитии системы крови человека было поставлено под вопрос нашими наблюдениями, что дополнительная волна генерации HSC происходит внутри эмбриона человека между дифференцировкой кровяных островков в желточном мешке и колонизацией печени.

Embryonic arterial cell clusters


Первоначально мы обнаружили присутствие плотно упакованных гематопоэтических клеток, прилипших первоначально к вентральному эндотелию эмбриональных артерий человека (Tavian et al., 1996) (Fig. 1). Эти элементы, начинают обнаруживаться с 27 дня развития в виде небольших групп из 2-3 клеток в наиболее ростральной, удвоенной части аорты, быстро пролиферируют, чтобы образовать к 35 дню кластеры из нескольких тысяч клеток, которые распространяются в направлении пупочной (umbilical) области аорты, а также в вителиновую артерию, чтобы исчезнуть без следа к 40-му дню беременности (Tavian et al., 1999) (Рис. 2).

Morphologic and phenotypic analyses


Установлена примитивная природа этих внутри-эмбриональных гематопоэтических клеток. В самом деле, эти прилипшие к эндотелию клетки обладают поверхностным фенотипом, который характерен для ранних кровяных предшесте6нников, имеющих CD45+, CD34++, CD31+, CD43+, CD44+, CD164+, но CD38- и негативных по клон-специфичному маркеру (Lin-). Они также экспрессируют прото-онкогены и транскрипционные факторы (GATA-2, GATA-3, c-myb, SCL/Tal, c-kit) , которые регулируют инициальные стадии развития кровяных клеток (Labastie et al., 1998, Tavian et al., 1996, Watt et al., 2000).
Functional studies in vitro


Появление этих клеток внутри артерий туловища также коррелирует с появлением на этой территории функциональных гематопоэтических предшественников. В самом деле, preumbilical ткани туловища, выделенные от 5-недельных эмбрионов человека и культивируемые в присутствии MS-5 стромальных клеток, давали долговременные культуры гематопоэтических клеток и продуцировали почти в 8 раз больше клоногенных предшественников, чем печеночный рудимент на той же стадии развития (Tavian et al., 1996). Эти результаты подтвердили существование жизнеспособного, пока недифференцированного пула стволовых гематопоэтических клеток, ассоциированного с сосудистым эндотелием артерий туловища у эмбрионов человека. Они, следовательно, являются гомологами HSCs, ассоциированными со стенками сосудов у эмбрионов человека, подобно тем, что присутствуют вблизи эмбриональной аорты птиц (rev. Dieterlen-Lievre, 1994) и внутри области aorta/gonads/mesonephros у эмбрионов мышей (Garcia-Porrero et al., 1995). Однако, возможная миграция мышиных внутри-эмбриональных HSCs из кровяных островков желточного мешка как более вероятная, чем локальное происхождение внутри эмбриона, стала предметом споров, т.к. все исследования осуществлялись на стади развития, когда устанавливалось уже кровообращение между желточным мешком и эмбрионом (Tavian et al., 1996). Поэтому было важно определить действительно ли ткань эмбриональной аорты обладает кровь-формирующим потенциалом.

Hematopoietic potential is present in trunk mesoderm before the aorta develops


Демонстрация независимой генерации клеток гематопоэтических предшественников внутри эмбриона человека и сравнение их потенциала с клетками, происходящими из желточного мешка, было достигнуто благодаря новому экспериментальному подходу (детали см. Tavian and Peault, 2005) (Рис.3). Трехмерная органная культура изолированных эмбриональных эксплантов делала возможным развитие органа в отсутствие остального эмбриона. В этих условиях исследовали кровь-формирующий потенциал эмбриона и желточного мешка человека до и после 21-дневной стадии развития человека, маркирующей начало циркуляции крови. Последовательно splanchnopleura (Sp) - презумптивная область гематогенной аорты -, paraaortic splanchnopleura (P-Sp) и сама аорта были выделены и поддерживались в органной культуре в течение 2-4 дней параллельно с анализом гематопоэтического потенциала. Соответственно желточный мешок анализировался в тех же условиях во всех экспериментах. С 27 по 40 беременности (т.e. стадии, когда присутствуют внутрисосудистые кластеры HSC), аорта, как и ожидалось, давала долговременные культуры гематопоэтических клеток. Однако, тот же самый потенциал обнаруживался и в культурах, содержащих 19-дневную splanchnopleura, т.е. на самой ранней из проанализированных стадий, когда аорта ещё не возникла. Это указывает на то, что ещё за 3 дня до начала циркуляции и за неделю до обнаружения

Fig. 4. Chronology of appearance of hematopoietic stem cells in the developing human embryo.

узнаваемых HSC кластеров в аорте, splanchnopleura уже содержит клетки, проинструктированные в направлении гематопоэза. Следовательно, во время развития человека гематопоэтические предшественники возникают не только в желточном мешке, но и внутренне присущи самому эмбриону, мезодерме из (Tavian et al., 2001).

Comparing the potential of intra-embryonic hematopoietic progenitors with that of yolk sac-derived cells


Продемонстрировав, что внутри-эмбриональная спланхноплевра, которая включает презумптивную аорту, является истинным рудиментом гематопоэтической ткани, мы попытались сравнить, в смыслк клонального потенциала, гематопоэтические клетки, возникающие из этого сайта с теми, что возникают в желточном мешке. Клетки, происходящие из этих двух независимых мест генерации, культивировали на MS-5 стромальной клеточной линии. Эта линия поддерживает мульти-клональный, миэло-лимфоидный гематопоэз у людей и поддерживает Т-клеточный потенциал, который может быть достигнут при колонизации рудиментов тимуса у плодов NOD-SCID мышей in vitro (Robin et al., 1999a, Robin et al., 1999b). В этих экспериментах радикальные различия в потенциалах дифференцировки обнаруживались между предшественниками, происходящими их вне- и внутри-эмбриональных компартментов (Tavian et al., 2001). Предшественники, происходящие из желточного мешка и эмбриона, давали миэлоидные и NK клетки. Напротив, только HSCs внутри-эмбрионального происхождения давали Т и В клетки, Эти результаты приводят к выводу, что две волны возникновения гематопоэтических клеток имеют место в раннем онтогенезе человека. Сначала генерируются мультипотентные, миэло-лимфоидные стволовые клетки в splanchnopleura, внутри собственно эмбриона, наблюдение недавно подтвержденное на модельных мышах. экспрессирующих GFP флюоресцентный белок под контролем промотора гена RAG-1 (Yokota et al., publication in preparation). Мы продемонстрировали, что HSCs, встречающиеся внутри артерий туловища возникают в эмбрионе, а не происходят из вне-эмбрионального желточного мешка. Эти клетки ответственны за вторую печеночную колонизацию (Fig. 4) , а, следовательно, за установление дефинитивного гематопоэза у людей (Tavian et al., 2001).

Origin of intra-embryonic hematopoietic progenitors


AGM является областью эмбриона, которая представляет аорту, генитальный гребень и мезонефросы. Аорта происходит из спланхноплевры, тогда как два последних рудимента возникают из параксиальной мезодермы, между сомитами и полостью целома. Т.к. AGM мышей обычно рассматривается как территория, где возникают внутри-эмбриональные HSCs originate, поэтому мы подразделили AGM человека на три главных компартмента, которые в отдельности изучали в культуре. Бесспорно было показано, что внутри эмбриона человека, только аорта обладает гемангопоэтической способностью. Рудименты гонад и почек во всех случаях были лишены какого-либо обнаружимого кровь-формирующего потенциала (Tavian et al., 2001). Затем мы исследовали локальное происхождение внутри вентральной части стенки туловищных артерий возникающие гематопоэтические стволовые клетки.

Lineage relationship between hematopoietic and endothelial cells


Мезодерма желточного мешка, по-видимому, дифференцируется одновременно в сосудистые и гематопоэтические структуры. Так, первые распознаваемые кровяные клетки - или морфологически или по молекулярным маркерам - в желточном мешке всегда организованы в кластеры (или кровяные островки), которые тесно прилипают к возникшим или вновь образующимся эндотелиальным клеткам (Murray, 1932, Sabin, 1920). Ещё более наглядны, чем в желточном мешке, внутри-эмбриональные кластеры HSCs, всегда появляющиеся в тесной физической ассоциации с дифференцированным вентральным эндотелием кровеносных сосудов туловища. Эти наблюдения послужили основой для гипотезы, что эндотелиальные клетки сами по себе являются источником эмбриональных кровяных клеток, что предполагалось уже довольно давно в отношении гематопоэза в желточном мешке (Sabin, 1920). Предполагалась ре-дифференцировка уже организованного слоя эндотелиальных клеток, событие, которое и в самом деле было недавно подтверждено в месте внутри-эмбрионального гематопоэза у эмбрионов мышей и птиц (Jaffredo et al., 1998; Nishikawa et al., 1998; de Bruijn et al., 2002 and for review see Dzierzak, 2003).



Fig. 5. Models of hematopoietic stem cell emergence within the human embryo. (A) Re-differentiation model. Beginning at 27 days of development, pre-existing endothelial cells (green) in the ventral aspect of human intra-embryonic arteries differentiate locally into blood cell progenitors (blue). (B) Migration model. From 27 days of gestation, scattered mesodermal CD34-CD45- cell precursors (red) colonize the ventral vascular wall and give rise to (blood-forming?) endothelial cells (green) and hematopoietic cell clusters (blue).

Чтобы проверить эту возможность. мы сначала сортировали с помощью жидкостной цитометрии сосудистые эндотелиальные клетки от эмбриональных и плодных кровь-формирующих тканей человека. За исключением CD45, большинство поверхностных маркеров, экспрессируемых гематопоэтическими клетками (CD31, CD34 и KDR/flk-1), присутствовало также и в эндотелиальных клетках на этих ранних стадиях. Надежной комбинацией маркеров при типировании эндотелиальных клеток оказалась экспрессия на поверхности CD34 или CD31 и отсутствие CD45, это указывало на предетерминацию в отношении гематопоэза. CD34+CD45- отсортированные клетки были лишены CD45+ загрязняющих гематопоэтических клеток и не давали колоний кровнях клеток при посеве в methyl-cellulose подходе. Затем, эндотелиальные клетки, происходящие из желчтоного мешка и области AGM (27-40 день) дифференцировались в гематопоэтические клетки, если культивировались в присутствие MS-5 стромальных клеток (Oberlin et al., 2002). Частота hematogenous эндотелиальных клеток в этих органах, на данной стадии онтогенеза, непосредственно коррелировала с гематопоэтической активностью ткани, из которой они были выделены. В желточном мешке, где гематопоэз начинается примерно на 16-й день развития, частота эндотелиальных кровь-формирующих клеток была наивысшей на 19-й день, самая ранняя стадия изученная в этом исследовании, затем снижалась быстро параллельно со снижением вителлинового гематопоэза. В целом туловище эмбриона частота способных к гематопоэзу эндотелиальных клеток составляла примерно 1/100 на 27-й день, затем HSCs возникали из дна аорты. Не выявлено гематопоэтической активности в культурах эндотелиальных клеток, отсортированных из области AGM после 40-го дня, когда HSCs больше не присутствуют в просвете аорты. Эти эксперименты указывают на то, что предсуществующие эндотелиальные клетки в желточном мешке и во внутри-эмбриональных артериях человека делятся и дифференцируются локально в предшественники кровяных клеток в месте возникновения примитивного и дефинитивного гематпоэза (Oberlin et al., 2002).

Conclusion: the ultimate human blood-forming cell


Главным выводом является то, что мультипотентные гематопоэтические стволовые клетки возникают в эмбриональных артериях человека автономно от первичного вителлиновго гематопоэза посредством промежуточных сосудистых эндотелиальных клеток. Способность к гематопоэзу, по-видимому, приобретается вторично энтодермальными клетками аорты. С 24 по 26 день развития, когда область AGM оказывается гемогенной in vitro, но до появления кластеров HSC в аорте, эксперименты по клеточной сортировке и культуре показали, что кровь-формирующий потенциал в AGM принадлежит CD34-негативной, т.e. фракции не-эндотелиальных клеток (MT et al., unpublished observations). Это указывает на то, что или эндотелиальные клетки вентральной части аорты внезапно переключаются на гематопоэз на 27-й день или что, более примитивные CD34- angio-hematopoietic предшественники мигрируют через пери-аортальную мезенхиму и колонизируют дно аорты на этой стадии. Некоторые наблюдения подтверждают, что последнее предполоежение верное. Так, экспрессия Flk-1 или VEGF-R2 в ранних эмбрионах человека, которая показывает, что популяция Flk-1+CD34- клеток мигрирует из спланхноплевры в субаортальную мезодерму в течение 4-й недели развития (Cortes et al., 1999). Более недавно поверхностный белок, названный BB9, экспрессируемый во взрослом костном мозге HSCs и субнабором стромальных клеток (Ramshaw et al., 2001), был обнаружен в родственной популяции клеток, колонизирующих аорту у 4-недельных эмбрионов человека. Важно, что экспрессия BB9 затем обнаруживалась на поверхности как эндотелиальных клеток, таки и ассоциированных с ними HSCs в вентральной части аорты (Jokubaitis et al., submitted). Следовательно, BB9 может представлять собой первый маркер ангиогематопоэтических клеток или гемангиобластов. Мы полагаем, что гемангиобласты или даже более примитивные мезодермальные стволовые клетки, мигрируя из пара-аортальной спланхноплевры, дают в дне эмбриональной аорты кровь-формирующие эндотелиальные клетки и те в свою очередь гематопоэтические стволовые клетки (Fig. 5B). Такие каскады дифференцировки, как полагают, ограничены эмбриональными и ранними плодными стадиями развития. Открываются интересные перспективы. В самом деле, мультипотентные стволовые клетки, функционирующие в том числе и для гематопоэза, как полагают, существуют во взрослых тканях, среди которых костный мозг. Получены предварительные указания, что небольшая фракция сосудистых эндотелиальных клеток , отсортированная из полости взрослого костного мозга, может давать гематопоэтические клетки в культуре (Souyri et al., unpublished results) а гемангиобласты были объявлены как существующие у взрослых людей (Pelosi et al., 2002). Было бы интересно посмотреть, применим ли родоначальный механизм, с помощью которого гематопоэтически клетки продуцируются из стенки эмбриональных кровяных сосудов к появлению их во взрослой жизни.
Сайт создан в системе uCoz