Nodal Flow and the Generation of Left-Right Asymmetry
N. Hirokawa, Yosuke Tanaka, Yasushi Okada, and Sen Takeda Cell. V. 125, No 1. P. 33-45. 2006 (DOI 10.1016/j.cell.2006.03.002)
The establishment of left-right asymmetry in mammals is a good example of how multiple cell biological processes coordinate in the formation of a basic body plan. The leftward movement of fluid at the ventral node, called nodal flow, is the central process in symmetry breaking on the left-right axis. Nodal flow is autonomously generated by the rotation of cilia that are tilted toward the posterior on cells of the ventral node. These cilia are built by transport via the KIF3 motor complex. How nodal flow is interpreted to create left-right asymmetry has been a matter of debate. Recent evidence suggests that the leftward movement of membrane-sheathed particles, called nodal vesicular parcels (NVPs), may result in the activation of the noncanonical Hedgehog signaling pathway, an asymmetric elevation in intracellular Ca2+ and changes in gene expression.
chiral (chirality) - Having nonsuperimposable mirror images. For example, a shoe or a glove is chiral.
Lack of a laterality phenotype in Pkd1 knock-out embryos correlates with absence of polycystin-1 in nodal cilia
C.Karcher, A.Fischer, A.Schweickert, E.Bitzer, S. Horie, R.Witzgall, M.Blum
Differentiation. - 2005.- V.73, No 8. P.425
У эмбрионов мышей асимметричная индукция экспрессии гена nodal зависит от функции моноцилий клеток вентрального узелка и от гена Pkd2, который кодирует кальциевый канал polycyctin-2 (PC2). У людей мутации в генах PKD2 и PKD1 приводят к поликистозу почек. Белки PKD2 и PKD1, как полагают, действуют как часть мультифакторного комплекса. Локализация обоих белков в первичных почечных ресничках подтверждает функцию ресничек в вентральном узелке. Исследование нокаутных эмбрионов Pkd1 показало, что у них происходит нормальный морфогенез органов и нормальна экспрессия nodal и Pitx2. В то время как у эмбрионов мышей PC2 локализуется в ресничках узелка, РС1 в них не обнаруживается. Это было подтвержено и на архетипическом бластодиске эмбрионов кроликов. Таким образом, отсутствие локализации РС1 в ресничках соответствует отсутствию дефектов латеральности у нокаутных Pkd1 эмбрионов. Следовательно, РС2 действует независимо от функции РС1 в формировании лево-правосторонней асимметрии и косвенно подтверждаетcz роль РС2 ресничек в этом процессе.
Наше тело имеет left-right (LR) асимметрию. Сердце, селезёнка и поджелудочная железа располагаются на левой стороне, тогда как желчный пузырь и большая часть печени на правой, Анатомически LR асимметрия впервые становится очевидной с ориентацией сердечной трубки (Kaufman, 1992), но LR асимметрия уже обнаружима на стадии сомитогенеза по асимметричной экспрессии некоторых генов, таких как Lefty-1 (Leftb), Lefty-2 (Ebaf), Nodal и Pitx2. В большинстве случаев асимметричная экспрессия генов на этой стадии наблюдается на левой стороне (Harvey, 1998; Yost, 1999; Levin, 2005; Hamada, 2002; Capdevilla et al., 2000). Однако, работа нашей лаб. и др. показали, что LR асимметрия возникает даже на более ранних стадиях развития.
Примерно половина пациентов с генетическим дефектом. наз. Kartagener's syndrome, имеет свои органы обратно ориентированными. Затронутые индивиды имеют также неподвижные спермии и дефектные реснички в своих воздушных путях. Т.о., фенотип указывает, что реснички контролируют LR асимметрию (Afzelius, 1976). Сегодня нам неизвестно, какие реснички имеют отношение и на какой стадии. Результаты многих исследований подтвердили, что т.наз "узелок", временная структура на срединной линии, которая формируется во время гаструляции (Figures 1A and 2), важна для детерминации LR (Harvey, 1998). Этот узелок возникает после предопределения дорсо-вентальной (DV) и передне-задней (AP) осей. На вентральной поверхности узелка имеется ямка, окруженная ресничками (Figure 1A). Моноцилии клеток вентральной части узелка являются первичными ресничками, которые лишены центральной пары микротрубочек и поэтому содержат арранжемент из 9 + 0 микротрубочек (Рис.1C), что отличает их от подвижных ресничес с 9 + 2 микротрубочками в нормальных ресничатых клетках (Figure 1С). Т.о., исходя из их ультраструктуры и видео-микроскопических наблюдений, считается, что узелковые моноцилии (monocilia) лишены подвижности (Bellomo et al., 1996). Однако, наше открытие, что моноцилии узелка быстро движутся, чтобы создать направленный влево ток вне-эмбриональной жидкости, открывает новые возможности.
The Discovery of Nodal Flow
Информация о роли узелковых ресничек в детерминации LR получена в исследованиях молекулярных моторов из kinesin superfamily (KIFs). Микротрубочки регулярно расположены в большинстве типов клеток и действуют как рельсы, по которым транспортируются мембранные органеллы и белковые комплексы на большие расстояния. KIFs перемещают различные грузы, не только в поляризованных клетках, таких как нейроны и эпителиальные клетки, но и также в большинства др. клеток (Hirokawa, 1998; Guzik and Goldstein, 2004; Hirokawa and Takemura, 2005). Комплекс KIF3 состоит из гетеродимеров из моторных белков KIF3A и KIF3B и ассоциированного белка, KAP3, который соединяется с хвостовыми концами KIF3A и KIF3B. Исследования Kif3a и Kif3b нокаутных мышей показали, что примерно 50% как Kif3a-дефицитных и Kif3b-дефицитных мышей обнаруживают обратно расположенную петлю сердца, тогда как остальные нормальны. Чтобы определить положение KIF3A и KIF3B в сигнальном каскаде детерминации LR, исследовали экспрессию Lefty-2, одного из самых ранних left-defining генов. Хотя Lefty-2 экспрессировался исключительно на левой стороне у эмбрионов дикого типа, Lefty-2 экспрессия или в основном билатеральна или отсутствует у Kif3a-дефицитных and Kif3b-дефицитных эмбрионов (Nonaka et al., 1998; Takeda et al., 1999; Marszateket at, 1999). Эти данные указывают на то, что оба KIF3A и KF3B действуют на более ранней ступени, чем Lefty-2 на пути детерминации LR.
Неожиданной и ценной находкой стало наблюдение узелка. Хотя клетки вентральной части узелка у эмбрионов дикого типа имеют моноцилии, состоящие из 9 + 0 микротрубочек на вентральной поверхности, реснички или полностью отсутствовали или были очень короткими и обнаруживались только спорадически на вентральной части узелка эмбрионов, лишенных KIF3A или KIF3B (Рис. 1). Кроме того, иммуноцитохимически было показано, что KIF3A и KIF3B локализуются в моноцилиях клеток вентральной части узелка у эмбрионов дикого типа (Nonaka et al., 1998; Takeda et al., 1999). Это указывает на то, что KIF3A и KIF3B важны для генеза ресничек в клетках вентральной части узелка из-за транспорта белковых комплексов в моноцилиях (Рис. 1В).
Однако, оставалось неясным, почему отсутствие моноцилий в вентральных клетках узелка связано со случайностью LR асимметрии. Поэтому за поведением моноцилий у эмбрионов дикого типа и мутантных наблюдали in vivo с помощью видео-световой микроскопии. Неожиданно, мы увидели, что моноцилии, которые считались неспособными к движению, на самом деле активно ротировали ( см. Movies S1 и S2 Suppl). Ротационные движения узелковых моноцилий являются уникальными - большинство подвижных ресничек или флагелл движутся только взад и вперед. Как внутренние, так и наружные плечи dynein наблюдали с помощью ЭМ и аксонемное наружное плечо dynein было локализовано в моноцилиях (Takeda et al., 1999). Хотя уникальная ротация моноцилий может быть генерирована аксонемным dynein, но отсутствовало объяснение, как ротационные движения связаны с LR асимметрией. В последствии было установлено, что флюоресцентные кусочки, если добавлялись во вне-эмбриональную жидкость в области желтка у эмбрионов дикого типа, то перемещались в одном направлении влево, феномен был назван "nodal flow" (Movie S1), тогда как у мутантных эмбрионов, лишенных KIF3A или KIF3B, флюоресцентные кусочки обнаруживали Броуновское движение (Nonaka et al., 1998; Takeda et al., 1999;). Это привело к заключению, что моноцилии существенны для лево-правосторонней детерминации, т.к. их ротационные движения продуцируют нодальный ток, необходимый для установления градиента предполагаемого морфогена во внеэмбриональной жидкости в вентральном узелке (Nonaka et al., 1998; Takeda et al., 1999).
Это заключение было подтверждено с помощью анализа моноцилий в клетках вентрального узелка у мутантных мышей inversus viscerum (iv) (Okada et al., 1999; Supp et al., 1999). Это спонтанно возникшая мутация у мышей приводит к рандомизации предопределения LR (Hummel, Charman,1959). Ген аксонемного dynein у мышей, Left-right dynein (Lrd) был идентифицирован как ген, ответственный за inversus viscerum и Legless (Lgl), который также приводил к рандомизации LR (supp et al., 1997). Lrd является членом сверхсемейства dynein, обозначенного Dlp11 (Tanaka et al., 1995) и экспрессирующегося исключительно у клетках узелка на 7.5 days postcoitum (dpc) (Supp et al., 1997). У эмбрионов, гетерозиготных по iv , узелковые реснички ротировали столь же быстр, как у у дикого типа (~600 rpm; Okada et al., 1999). Это быстрое движение продуцирует быстрый (20-50 µm/s) и сглаженный левонаправленный ток вне-эмбриональной жидкости в вентральной части узелка. Однако, у iv гомозиготных эмбрионов, узелковые реснички редко движутся и выглядят очень ригидными (Okada et al., 1999). Более того, кусочки, добавляемые к вне-эмбриональной жидкости обнаруживают только Броуновское движение. Следовательно, узелковые реснички у iv гомозиготных мышей не могут ротировать, т.к. мутация Lrd не может генерировать левонаправленный нодальный ток, необходимый для детерминации LR.
C этой точки зрения, некоторые важные вопросы остаются без ответа. Левонаправленный нодальный ток является инициальным для нарушения LR симметрии событием и у др. позвоночных? Как осуществляются ротационные движения ресничек, генерирующие линейный левонаправленный ток? Присутствуют ли секретируемые морфогены в вентральной части узелка и если да, то как нодальный ток приводит к накоплению предполагаемого морфогена на левой стороне?
The Ventral Node is Distinct from Hensens's Node
Как показано на Рис. 2, эмбрионы мышей формируют цилиндрическую структуру, чья внутренняя сторона является дорсальной стороной и выстлана с помощью эпибласта, а наружная сторона является вентральной стороной, которая превращается в гипобласт. Передняя миграция дистальных висцеральных клеток от наиболее дистального сайта от эктаплацентарного конуса предопределяет АР ось и срединную линию эмбриона. Первичная полоска локализуется в виде разреза эпибласта на задней половине срединной линии . От первичной полоски, клетки эпибласта осуществляют гаструляционные движения в глубокие слои в стенку яйцевого цилиндра, чтобы детерминировать их предназначение в качестве дефинитивной мезодермы или дефинитивной энтодермы. Наиболее передняя порция первичной полоски называется первичной (primitive) ямкой. Дорсальное выпячивание, окружающее первичную ямку у эмбрионов кроликов становится известным узелком Гензена (Hensen, 1876; Viebahn 2001). Гензен описал бугорок-подобную структуру или "Knoten", которая выступает как "node" или "knot" в центре диск-подобного эмбриона кролика. Структура выглядит подобно узелку каната наполовину внедренного в бластодиск на дорсальной стороне. Т.о., функционально и анатомически эквивалент д.б. локализован внутри мышиного яйцевого цилиндра. Хотя оригинальное определение "Knoten" очевидно описывает выпячивающуюся структур (на дорсальной стороне), мышиные эмбриологи, включая Rosa Beddington (Hogan et al., 1986) распространяют это определение на более широкую область, которая соответствует вентральным структурам, т.к. вентральная часть узелка мышей выглядит как впадина на наружной поверхности эмбрионов в средине беременности.
Ресничатые клетки на вентральной стороне узелка являются наиболее задней частью хордальной пластинки, которая является зачатком хорды (Kinder et al., 2001). При развитии от поздней полоски до стадии ранних сомитов эти аксиальные мезоэнтодермальные клетки формируют эпителиальный слой, который обращен к поверхности вентральной срединной линии и окружен листками энтодермы с обеих сторон. Хотя дорсальная поверхность ресничатых клеток непосредственно ассоциирует с эпибластом или эктодермальными клетками, имеется гладкая граница между этими зародышевыми слоями и вентральной частью узелка так, что мало вероятно, что вентральная часть узелка является частью первичной полоски (Рис. 2В). Напротив, мы может идентифицировать группу мезодермальных клеток на парасагитальных срезах 7.5 dpc эмбрионов (Рис. 2В), которая может представлять собой инвагинирующие клетки, которые происходят из Гензеновского узелка, расположенного в областях эмбриона более передних по отношению к заднему и дорсальному концу. Интересно, что ресничатые примордиальные клетки в вентральной части узелка очень плотно упакованы и выглядят подобно продольному срезу через луковицу лука, подтверждая модель "toothpaste" генеза узелка (Sausedo, Schoenwolf, 1994), согласно которой примордиальные клетки для хорды устремляются в вентральный узел с задней стороны и остаются до выхода из передней стороны по направлению хордальной пластинке. Т.о., хотя клетки вентрального узелка первоначально происходят из Гензеновского узелка, вентральный узелок в целом является самостоятельной структурой. Это различие значительно яснее у др. позвоночных, таких как кролик, к которых Гензеновский узелок и был открыт. У эмбрионов кроликов вентральная структура, которая соответствует "ventral node" мышей обнаруживается на задней части хорды, которая удалена от исходного Гензеновского узелка на дорсальной стороне (Okada et al., 2005). Однако, чтобы схранить согласие с уже устоявшимися терминами, такими как "nodal flow" и "nodal cilia", мы будем использовать термин "ventral node" для этой вентральной окруженной ресничками ямки.
Nodal Flow Breaks LR Symmetry in Mouse Embryos
Мы сфокусируемся на инициальных событиях, которые дают LR асимметрию у мышей. Хотя нодальный ток законсервирован у мышей, кроликов и рыб, мы начнем обсуждение случая(ев) нарушения альтернативной симметрии на ранних стадиях развития. Теоретически оси DV и АР и chirality системы необходимы для нарушения LR симметрии стереотипическим способом. Или предположим др. способ, латеральность может быть установлена только когда АР и DV оси уже детерминированы, учитывая chirality системы. Т.о., ключевой вопрос в инициальном нарушении LR симметрии, как спецификация АР и DV осей и chirality системы связаны со спецификацией LR оси. Чтобы ответить на этот вопрос мы сначала обсудим, когда эти оси детерминируются во время развития.
У большинства низших позвоночных и беспозвоночных яица асимметричны даже перед оплодотворением (Gilbert, 2003)/ У некоторых организмов, таких как рыбы и лягушки, DV и АР оси детерминируются при оплодотворении путем распределения желтка и положения вхождения спермия. Хотя это остается спорным у млекопитающих (Gardner, 1997; Hiiragi, Solter, 2004), экспериментальные манипуляции с эмбрионами млекопитающих до имплантации оказывают мало эффекта на формирование оси после имплантации (Alarcon, Marikawa, 2003).
Детерминация АР оси у эмбрионов млекопитающих д.б. реорганизована после имплантации, т .к. передняя спецификация использует проксимо-дистальную информацию со стороны имплантации (эктоплацентарный конус), который может быть детерминирован независимо от полярности во внутренней клеточной массе (ICM) бластоциста перед имплантацией. После имплантации, мышиные эмбрионов, как полагают, первоначально цилиндрически симметричны. Постепенно АР ось детерминируется с помощью вновь появляющихся сигнальных центров вдоль будущей срединной линии эмбриона, которые индуцируют головную складку (спереди) и первичную полоску (сзади, Beddington, Robertson 1999). Т.к. детерминация LR происходит относительно срединной линии, то она д. строго следовать за формированием срединной линии. Это объясняет, почему латеральность мышиных эмбрионов, которая может существовать до имплантации, не может сохраняться после имплантации. Исходя из предположения, что передняя сторона выбирается случайно, как это предполагается гипотезой из 360о яйцевого цилиндра (Alacron, Marikawa, 2003), любая предсуществующая асимметрия LR детерминант д.б. уничтожена на этой стадии. Если же это не так, и передняя позиция специфицируется 0о в противоположность 180о, то латеральность д.б. инвертирована.
Это согласуется с находками, что экспрессия генов с LR асимметрией впервые детерминируется на ранней сомитной стадии. P.Tam и др. описали маркеры, которые временно экспрессируются на любой стороне эмбриона мыши до этой стадии (Tsang et al., 1999), следовательно, не выявляется достоверной тенденции к латеральности экспрессии, что подтверждает гипотезу, что латеральность у мышей впервые детерминируется, когда появляется нодальный ток.
Наши наблюдения над живыми дикого типа и мутантными эмбрионами мышей (такими как Kif3b-/-, Kif3a-/-, iv, inv (inversion of embryonic turning)) с помощью видеомикроскопии выявило событие (нодальный ток) для детерминации LR асимметрии до экспрессии асимметричных генов у 7.5 dpc эмбрионов на ранней сомитной стадии. Движение по часовой стрелке моноцилий продуцирует локальную сеть справа налево тока жидкости на поверхности вентрального узелка (Movie S1; Nonaka et al., 1998; Okada et al., 1999; Takeda et al., 1999). Аномальный нодальный ток у мутантных мышей предшествует нарушению возникновения LR асимметрии, это указывает на то, что направление тока вне-эмбриональной жидкости детерминирует последующую LR асимметрию эмбрионов мыши. Эта идея позднее была подтверждена с помощью культивируемых мышиных эмбрионов в условиях искусственного тока (Nonaka et al., 2002).
The Direction of Nodal Flow is Determined by Hydrodynamics
Мы тщательно наблюдали за движением ресничек и детерминацией оси ротации в трех измерениях. В отличие от обычных бьющих ресничек, моноцилии в узелке совершают ротационные движения по часовой стрелке (Рис. 3А; фильм S2)/ Ось ротаций не обнаруживает латеральрных отклонений от срединой линии, но наклонена на 40о +/- 10о кзади от вертикального угла (Рис. 3А и 3С). Как следствие реснички совершают левонаправленный поворот прочь от поверхности и правонаправленный поворот вблизи поверхности. В соответствии с гидродинамикой, cтационарная поверхность препятствует движению жидкости благодаря shear resistance. Т.о., правонаправленный ток оказывается менее эффективным, чем левонаправленный ток генерируемого перемещения жидкости (Рис. 3С).
Наклон кзади для оси вращения был смоделирован в работе Cartwright et al. (2004). Согласно их модели правостронний ток вдоль поверхности вентрального узла д. происходить с той же самой скоростью, что и левонаправленнй ток. Однако, эта модель не учитывает shear резистентность и не согласуется с экспериментальными наблюдениями. Нодальный ток обладает Reynolds числом (значение обычно используемое в гидродинамике для характеристики тока жидкости) порядка 10-3, указывает на то, что внутреннее трение (viscosity) доминирует над инерцией. Т.о., вязкое медленное перемещение или shear резистентность из-за клеточной поверхности не являются нулевыми. Наши последние теоретические исследования недвусмысленно учитывают этот фактор в рассуждениях и количественно подтверждают идею, что shear резистентность клеточной поверхности существенна для генерации левонаправленного тока (Buceta et al., 2005). Эта новая гидродинамическая модель согласуется с экспериментальными результатами с inv мутантными мышами (Okada et al., 2005) и с искусственными экспериментальными модельными системами )Nonaka et al., 2005).
Brown и Wolpert (1990) предположили, что chiral структура, ориентированная в соответствии с АР и DV осями, необходима для генерации LR латеральности. Реснички вентрального узелка, которые наклонены кзади представляют собой в точности такого типа структуру. Структурные свойства ресничек узелка предопределяют направление тока, без намерения (relying) достижения какой-либо a priori LR асимметрии (Рис. 3С). Вращение по часовой стрелке ресничек д. отражать chiral архитектуру моноцилий узелка, при которой dynein плечи располагаются по часовой стрелке на стороне каждого дублета микротрубочек (Рис. 1с; Brokaw, 2005).Интересно, что базальное тельце или корень каждой моноцилии расположен на клетке позади, что возможно отражает planar cell polarity (PCP) клеток вентрального узелка по отношению АР оси (Okada et al., 2005). Выпуклый изгиб клеток вентрального узелка может объяснить, как эта задняя локализация вносит вклад в наклон оси вращения (Рис. 3В).
Этот механизм генерации латеральности законсервирован у кроликов и рыб. Кролики, подобно людям и курам, формируют плоский диско-образный эмбрион, который отличается от мышиного, который более подобен бокало-образному цилиндру. Левонаправленный ток жидкости образуется на вентральной поверхности задней части хордальной пластинки. Экспрессия Nodal демонстрирует, что эта область у эмбрионов кроликов соответствует вентральному узелку мышиных эмбрионов, хотя она находится кпереди от Гензеновского узелка (Okada et al., 2005). Одна или две первичных ресничек проецируются с задней стороны вентральной поверхности каждой клетки хордальной пластинки. Как и у эмбрионов мышей эти реснички вращаются вокруг оси, наклоненной кзади.
Сходные события наблюдаются в Kupffer's vesicles (KV) у рыбок данио и медак, которые также соответствуют вентральному узелку мышей (Essner et al., 2005; Kawakami et al., 2005; Okada et al., 2005). Оптическая прозрачность медак позволяет прямое наблюдение первичных ресничек (вращение вокруг оси, склоненной кзади) на вентральной поверхности KV (Okada et al., 2005). Ось тела низших позвоночных, включая амфибий и рыб, детерминируется намного раньше, чем у млекопитающих, это может отражать различия между oviparity (развитие в яйце) и viviparity (живорождение). Т.о., у рыб, LR асимметрия детерминируется до периода гаструляции и нарушается при ингибировании Р+/K+-ATPase при использовании таких в-в как omeprazole (Levin et al., 2002). Однако, левосторонний ток нормален в KVs даже после того, как предсуществующая LR асимметрия нарушена (Kawakami et al., 2005). Это строго подтверждает мнение, что направленность нодального тока в KV автономно детерминируется без необходимости в какой-либо предсуществующей LR асимметрии.
Generating Asymmetric Gene Expression by Nodal Flow
Две альтернативные модели, которые не полностью исключат др. др., предложены для объяснения, как информация, генерируемая левонаправленным током жидкости, интерпретируется: первая модель базируется на формировании химических градиентов, тогда как др. модель связана с физической стимуляцией нодальным током. Модель химического градиента была выдвинута первой. Она предполагает, что направленный ток д. продуцировать концентрационный градиент секретируемого морфогена в полости вентрального узелка (Nonaka et al., 1998; Okada et al., 2005). Модель физической стимуляции была предложена в качестве противовеса модели химического градиента, она предполагает физическую стимуляцию самим током чувствительных к механическим воздействиям клеток в вентральном узелке (McGrath et al., 2003). Некоторые реснички узелка , особенно те, что на периферической области вентрального узелка, неподвижны. Т.о., было предположено, что эти неподвижные реснички д. действовать как сенсоры направленного тока. Эта модель физической стимуляции часто обозначается как "two-cilia hypothesis", согласно которой один тип ресничек генерирует ток, а др. воспринимает его (Tabin,Vogan, 2003)/
Гипотеза двух типов ресничек, как полагают, объясняет различия между фенотипами, наблюдаемыми у мутантных эмбрионов, которые лишены ресничек от тех мутантов, что с неподвижными ресничками. Мутантные мыши с неподвижными ресничками обладают сложным паттерном экспрессии генов, которые обычно специфичны для левой стороны (Supp et al., 1999). Напротив, мыши без узелковых ресничек обнаруживают более значительную тенденцию к возникновению билатеральных паттернов экспрессии генов в латеральной пластинке мезодермы (Nonaka et al., 1998; Marszalek et al., 1999; Takeda et al., 1999; Murcia et al., 2000). Ключевой основой для гипотезы двуз ресничек является идея, что некоторые реснички узелка выполняют сенсорную функцию. Это не обязательно означает, реснички узелка ощущают механические стимулы от тока, но что они могут служить в качестве сенсоров химических молекул, подобно ресничкам носового эпителия. Строгим подтверждением модели механических ощущений является находка, что ранняя LR передача сигналов нарушается мутациями генов polysystic kidney disease (ЗЛВ), которые участвуют в механорецепции с помощью моноцилий клеток почечного эпителия (Murcia et al., 2000; Pennekamp et al., 2002).
Согласно модели двух типов ресничек каждая клетка с ресничкой д. определять направленность тока, используя первичный monocilium в качестве сенсора. Однако, направленность тока является локальной и и не содержит глобальной информации о латеральности. Др. словами, т.к. форма вентрального узелка симметрична, но нодальные клетки на обеих сторонах д. обладать сходной чувствительностью к току справа. Дальнейшая информация, такая как коммуникации с окружающими клетками, д. б. необходима, чтобы узнать, на левой ли они стороне узелка или на правой. Этот концептуальный вопрос остается без ответа для гипотезы двух типов ресничек.
Напротив, модель химического градиента проста и прямолинейна. Химический морфоген(ы) секретируются в полость вентрального узелка и транспортируются на левую сторону нодальным током. Т.о., химический морфоген(ы) накапливается только на левой стороне. Согласно этой модели клетки могут знать на левой они стороне или на правой просто ощущая этот морфоген. Фенотипические различия между мутантами, которые лишены ресничек и мутантами с неподвижными ресничками могут быть объяснены если некоторые (или ве) нодальные реснички служат сенсорами этого химического морфогена. Т.о., самая значительная трудность модели химического градиента заключается в том. способен ли концентрационный градиент секретируемого химического морфогена действительно генерироваться нодальным током. Т.к. вентральный узелок является закрытой или полузакрытой полостью, то может предположить, что левонаправленный ток жидкости по нижней поверхности д.б. сбалансирован с правонаправленным противотоком где-то ещё. Потенциальным следствием противотока может быть то, что секретируемые молекулы в конечном итоге будут распределены униформно. Как и ожидалось, левонаправленный нодальный ток у мышей компенсирутеся правонаправленным противотоком, хотя противоток значительно медленнее и намного выше поверхности вентрального узелка (Okada et al., 2005). Запертый флюоресцентно меченный белок вносился в полость, чтобы установить, генерируется ли концентрационный градиент. Меченный белок был локально активирован с помощью УФЛ, чтобы стимулировать непрерывную или перемежающуюся секрецию. Интересно, что только белки с размерами 20-40 rLf генерировали стационарный концентрационный градиент. Эти размеры соответствуют кандидатам на белок-подобные морфогены, таким как FGF8 и Nodal. Теоретический анализ может объяснить эту зависимость от размеров. Скорость диффузии белков этого размера находится между быстрым нодальным током на лево и значительно более медленным контратоком направо. Этот баланс также законсервирован у кроликов, несмотря на различия в размерах вентральных узелков. Эти результаты указывают на возможность, что эти молекулы могут спонтанно генерировать химический градиент в вентральном узелке. Напротив, как будет рассмотрено позднее, наша группа открыла значительно более крупные внеклеточные частицы, который секретируются и транспортируются на лево. В этом случае уникальные клеточные биологические механизмы гарантируют однонаправленность движения.
Важен сигнал, связывающий нодальный ток с передачей сигналов, специфичных для левых клеток. M.Brueckner и др. идентифицировали повышение внутриклеточной концентрации Ca2+ на левой периферии вентрального узелка (McGrath et al., 2003). Мы также наблюдали этот феномен и установили. что повышение Ca2+ стабильное и длительное (Tanaka et al., 2005; Рис. 4). Нодальный ток сначала ведет к повышению Ca2+ на левой периферии вентрального узелка, которое затем распространяется латерально, чтобы фиксировать качественные особенности левой стороны. Это событие может затрагивать баланс Lefty/Nodal TGFβ передачи сигналов, чтобы установить "leftness" латеральной пластинки мезодермы путем индукции каскадов генов, специфичных для левой стороны. Однако, детальный молекулярный механизм этих событий сигнальной трансдукции всё ещё не исследован. Из недавних исследований на рыбках данио латеральное распространение повышенного Ca2+ может быть достигнуто с помощью диффузии IP6 через щелевые соединения (Sarmah et al., 2005), хотя неизвестно, верно ли это и для мышей. Дискуссионно также, является ли эволюционным дупликатом (counterpart) специфическому для левой стороны подъему Ca2+, описанное у кур течение вниз Notch (Raya et al., 2004).
Polycystins являются мембранными белками, которые также могут вовлекаться в это продолжительное повышение Ca2+ (Nauli, Zhou, 2004). Polycistin-1 (PC-1 или PKD1) и Polycystin-2 (PC2 или PKD2) взаимодействуют др. с др. и существенны для развития почек, благодаря своей роли в механорецепции tubular тока (Schwatrz et al., 1007; Delmas, 2004). Механосенсорная функция PC1, как полагают, связана с использованием внеклеточного PKD домена, который используется для гомофильного взаимодействия с др. РС1 молекулой, чтобы ощутить расстояние между ними. В ответ на механические стимулы С конец РС1 отщепляется и транслоцируется в ядро, где он трансактивирует АР-1 (Chauvet et al., 2004). PC2 является, как считают, Ca2+ каналом, который локализуется как в плазматической мембране, так и в ER. PC2 может стимулироваться с помощью Рс1 посредством взаимодействия между С концами каждой из молекул (Delmas, 2004). Эмбрионы РС2-дефицитных мышей лишены повышенного Ca2+ на левой периферии вентрального узелка ) McGrath et al., 2003), не способны экспрессировать Lefty-2 и Nodal в латеральной пластинке мезодермы и и обнаруживают случайное предопределение лево-правосторонней оси (Pennekamp et al., 2002). Напротив, РС-1-дефицитные мыши имеют нормальное предопределение лево-правосторонней оси, но формируют прогрессирующую поликистозную болезнь почек (Nauli, Zhou, 2004), указывая тем самым, что подъем Ca2+ на левой периферии вентрального узелка запускается др. механизмом, чем механорецепция, которая обеспечивается с помощью Рс1/Рс2 в почечных канальцах. Т.к. РС2 имеет множественные сайты действия (Delmas, 2004), то повышение Ca2+ около узелка не обязательно ассоциирует с механорецепцией, как это предсказывается моделью двух типов ресничек (Tabin, Vogan, 2003). Группа Brueckner's также обнаружила РС2 во всех ресничках узелка, включая и те, что подвижны; т.о., вряд ли возможно. что РС2 участвует только в подъеме Ca2+ на периферии вентрального узелка (McGrath et al., 2003). В подвижных ресничках РС2 может непосредственно регулировать координацию подвижности ресничек путем изменения локальных уровней Ca2+ во время каждого вращения (Sieigh, Barlow, 1982). Как показано ниже, мы также показали, что фармакологическая обработка может элиминировать и восстановить околонодальное увеличение Ca2+, не нарушая тока жидкости (Tanaka et al., 2005), указывая тем самым, что механический элемент тока жидкости недостаточен сам по себе, чтобы вызвать повышение Ca2+. Дальнейшая идентификация точной роли РС2 в вентральном узелке поможет понять молекулярные механизмы лежащие в основе повышения Ca2+.
Ca2+ Elevation Can Be Modulated by the FGF/SHH/RA System
Наша группа недавно установила, что специфические ингибиторы fibroblast growth-factor receptors (FGFRs) могут почти полностью разрушить увеличение Ca2+ на левой периферии вентрального узелка у эмбрионов мыши (Tanaka et al., 2005). FGFRs 1-3 экспрессируются на клеточной поверхности вентрального узелка и на его периферии, также как на ресничках клеток вентрального узелка. Ингибиторы FGFR не нарушают тока жидкости внутри узелка. Это указывает на то ток сам по себе не существенен для повышения Ca2+ на левой стороне в противоположность предыдущим сообщениям (McGrath et al., 2003). Интересно, что обработка или N концом sonic hedgehog (SHH-N), ретиноевой кислотой (RA) или IHH-N обращает ингибирование повышения Ca2+ посредством блокады передачи сигналов FGFR. Обработка SHH-N способствует повышению Ca2+ в небольших клетках на левой периферии узелка, тогда как RA повышает Ca2+ в более широкой области на левой половине узелка. IHH-N стимулирует подъем Ca2+ в более широкой области билатерально. Т.к. все три эти морфогена участвуют в сигнальных каскадах, ведущих к левосторонней спецификации (Levin, 2005), то вполне понятно, что эти молекулы могут непосредственно или косвенно влиять на путь подъема Ca2+. Более того, пространственные различия в эффектах этих морфогенов могут отражать разные роли каждого из морфогенов на этом пути. Напр., интересно, что SHH или RA восстанавливают подъем Ca2+ с достоверной асимметрией в левую сторону. Как экзогенные SHH-N или RA вызывают асимметричный подъем Ca2+ загадка, требующая разрешения.
NVPs Are Membrane-Sheated Particles Transported to the Left
Чтобы увидеть прямые следствия супрессии FGFR на клетки вентрального узелка, мы метили поверхностные липиды эмбрионов с помощью флюоресцентной липофильной окраски и наблюдали time lapse с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Помимо тонких движений микроворсинок и ресничек мы обнаружили материалы диаметром 0.3-5 µm , которые переносились налево нодальным током (Tanaka et al., 2005; Рис. 5; фильмs S3-S6). Случайно интенсивность мечения на левой стороне была шире, чем на правой стороне, что указывало на массивный перенос липидов налево. Мы назвали эти транспортируемые материалы nodal vesicular particles (NVPs) и охарактеризовали их с использованием фармакологических и морфологических методов. ЭМ выявила присутствие множество NVPs перед высвобождением, прикрпленных к поверхности вентрального узелка. Также диаметр NVPs составлял приблизительно 1-2 µm, что согласуется с наблюдениями, сделанными с помощью флюоресцентных меток. Каждая NVP содержит множественные небольшие электронно-прозрачные капельки, заключенные в наружную мембрану. Эти капельки выглядят подобно липопротеиновым частицам, хотя их точный химический состав в основном неизвестен. NVPs часто ассоциированы с длинными клеточными отростками, которые из-за очевидного отсутствия микротрубочек могут быть динамично выпячивающимися микроворсинками. Вскрытые NVPs (т.е. NVPs мембранные оболочки, лишенные внутреннего содержания) также наблюдались.
Как такие крупные частицы избегают циркулирования внутри вентрального узелка? Ответ скорее всего связан с механизмами, с помощью которых NVPs высвобождаются, а затем отлавливаются (Tanaka et al., 2005). Высвобождение NVPs, по-видимому, активный процесс, который длится примерно 10 сек. Инициальное направление NVPs, которые появляются во всех областях вентрального узелка, является случайным и иногда и против направлении нодального тока. NVPs выглядят, как если бы они отделялись от кончиков изогнутых палочек (вообще-то микроворсинок) очень похожих на кнут (фильм S4). Высвободившись NVPs попадают в середину ламинарного тока жидкости в нескольких микрометрах выше поверхности ресничек, где скорость тока наивысшая. Т.о., NVPs избегают закрепления с помощью вращающихся ресничек в начальной фазе. В течение следующих 10 сек. NVPs транспортируются на левую сторону нодальным током. NVPs затем ударяются о ресничатую поверхность, лопаются и фрагментируются (фильм S5). В финальной фазе (длящейся примерно 10 сек.) NVPs абсорбируются с помощью поверхностных узелковых crown клеток на левой стороне. Лопание может удерживать частицы из NVPs от тока обратно на правую сторону и может также способствовать высвобождению активного содержимого. Физическое взаимодействие между NVP и cilium, соответ. содержащих SHH и его рецептор Smoothebed (Smo), возможно существенно для лопания, т.к. оборот NVPs, по-видимому, задерживается у Kif3a мутантов, которые лишены ресничек по сравнению с iv/iv мутантами, имеющими неподвижные реснички (Tanaka et al., 2005). Т.к. увеличение объема NVPs, по-видимому, предшествует лопанью в наших наблюдения, то лопанье может запускаться увеличением внутреннего давления в NVPs через отверстия мембранных каналов на их поверхности. Точный молекулярный механизм разрыва NVPs пока неясен.
Фармакология связывает высвобождение NVPs и подъем Ca2+.Обработка ингибитором FGFR полностью супрессирует и высвобождение NVPs и подъём Ca2+, не нарушая левонаправленный ток жидкости. Соотв. RA или SHH-N восстанавливают и высвобождение NVP и подъем Ca2+ (полностью или частично), тем самым сохраняется левое доминирование. Хотя IHH не может облегчать высвобождение NVPs, но билатеральное повышение Ca2+ указывает на то. что он действует иерархически ниже высвобождения NVP и может фактически транспортироваться вместе NVPs или может также секретироваться обеими сторонами вентрального узелка с помощью иного механизма. Эти находки подтверждают, что высвобождение NVPs регулируется морфогенами, такими как FGF,SHH-N и RA и что NVPs несут сигналы для подъема Ca2+. Хотя RA и SHH транспортируются с помощью NVPs, передача сигналов с помощью NVPs отличается от канонических сигнальных путей по следующим причинам: во-первых, будучи добавленным в избытке SHH обычно не оказывает эффекта на подъем Ca2+ билатерально. Во-вторых, нокаут или Shh или Raldh2 гена у мышей очевидно не нарушает инициальной LR детерминации (Tsukui et al., 1999). И, накоенец, и RA и SHH могут восстанавливать подъем Ca2+ на левой стороне.
Следовательно, открытие тока NVP предоставляет первые экспериментальные доказательства, что морфогены действительно транспортируются с помощью нодального тока, а существование NVPs расширяет наше понимание внеклеточного транспорта морфогенов. Доказательства. коррелирующие с левонаправленный транспорт NVPs с подъемом Ca2+ на левой стороне подтверждает, что передача сигналов NVP обязательна для инициального процесса детерминации лево-правосторонней оси в вентральном узелке мышей.
Noncanonical Hedgehog Signalling by NVPs
Является ли передача сигналов с помощью NVPs уникальной для LR детерминации в вентральном узелке мышей? SHH содержится в NVPs и может также активировать их высвобождение (Tanaka et al., 2005). Сегодня рассматриваются два hedghehog (Hh) сигнальных пути: канонический коротко-действующий путь, который зависит от Patched/Smo/Gli и неканонический дально-действующий путь (Ingham, McMahon, 2001; Torroja et al.m 2004).
Каноническая коротко-действующая передача сигналов может быть функциональной в вентральном узелке, т.к. Smo локализуется в ресничках узелка (Corbit et al., 2005). Однако, его действие, по-видимому, симметрично; поэтому вряд ли участвует в токе NVP. Компоненты нижестоящие в каноническом Shh пути, Ptch1, Gdf1 и Criptic, экспрессируются симметричным способом внутри или на периферии вентрального узелка. Этот путь в самом деле существенен для корректной LR детерминации (Tsukui et al., 1999; Yan et al., 1999; Rankin et al., 2000; Zhang et al., 2001), возможно посредством экспрессии Lefty-1 на срединной линии (Meno et al., 1998). Из-за симметричной природы передачи этого сигнала, он может обеспечиваться свободной диффундирующей формой, наз. SHH-Np (Zeng et al., 2001).
Недавно идентифицирован кандидат на роль эволюционного аналога передачи сигналов NVP в неканоническом Hh сигнальном пути у дрозофилы. Анализ имагинальных дисков личинок Drosophila выявил липид-зависимый дально-действующий путь для неканонической передачи сигналов Hh (Panakova et al., 2005). Имагинальный диск является примордиальной структурой, которая дает конечности или др. органы, и обладает четкой А-Р границей, чья задняя сторона имеет домен экспрессии Hh. Клетки внутри 10 µm границы отвечают на Hh активацией транскрипции collier и patched с помощью канонического пути, тогда как клетки дальше удаленные отвечают дифференциально активацией транскрипции decapentaplegic (dpp). Интересно, что последняя дально-действующая передача сигналов, как было установлено, передается с помощью внеклеточных липопротеиновых частиц, названных argosomes (Greco et al., 2001), содержащими apolipophorins I и II (ApoLI и ApoLII), Wingless (Wg), Hh и GPI-сцепленные белки. RNAi нокдаун lipophorin снижает ранг и силу дально-действующей передачи сигналов и напротив усиливает силу коротко-действующих сигналов, указывая тем самым, что эти два способа передачи сигналов Hh, действительно, взаимоисключающиеся. И NVPs и argosomes могут быть одного и того же типа покрытые мембранами липопротеиновые частицы, хотя ультраструктура аргосом еще не определена. Недавние доказательства подтверждают, что липопротеинами опосредованный механизм передачи сигналов может также действовать в регуляции иммунной системы (van der Elzen et al., 2005).
Т.о., передача сигналов с помощью NVPs скорее всего обеспечивает дально-действующий неканонический путь передачи сигналов Hh, который повышает Ca2+ на левой стороне с помощью ещё неизвестного механизма. Т.к. RA может синергично усиливать высвобождение NVPs с SHH-N, то эти два сигнальных пути конвергируют на NVPs. Недавно был обнаружен предполагаемый липид связывающий/переносящий белок Lplunc1, экспрессирующийся билатерально на crown клетках узелка у эмбрионов на ст. 1 сомита (Hou et al., 2004). Его экспрессия обнаруживает постепенное лево-стороннее доминирование как следствие нодального тока. Это может указывать на существование асимметричного механизма для оборота или рецепции (sensing) липидов, которые были перенесены на левую сторону с помощью тока NVPs.
The Ventral Node, an Evolutionary Showcase
Т.о., левонаправленный ток NVPs в вентральном узелке является прекрасным кандидатом на роль инициального механизма, который нарушает LR симметрию у эмбрионов мышей. Однако, этот механизм не очевиден у некоторых др. организмов (Levin, 2005). Хотя моноцилии в вентральном узелке или эквивалентные им структуры, по-видимому, эволюционно законсервированы (Essner et al., 2002), левонаправленный нодальный ток может не s,nm инициальным детерминантом LR асимметрии у некоторых др. позвоночных, таких как лягушки, птицы и рыбы. У лягушек LR ось устанавливается очень рано в развитии и связана с образованием DV оси (Yost, 1991). Материнская мРНК Н+/К+ ATPase уже локализована асимметрично во время инициальных двух делений дробления оплодтворенных яиц и эта локализация существенна для лево-правосторонней детерминации (Levin et al., 2002). Т.о., латеральность уже установлена спустя 2 ч после оплодотворения яиц лягушек. Гензеновский узелок кур морфологически асимметричен до ст. нейруляции (Kolliker, 1879). Очевидно, что эти LR асимметрии устанавливаются до формирования клеток с моноцилиями на вентральной срединной линии. Более того, хотя клетки с моноцилиями узелка у лягушек и кур и экспрессируют LR dynein, который является существенным мотором для подвижности моноцилий узелка (Essner et al., 2002), реснички не обращены лицом в полость, а вместо этого вмурованы в плотную массу клеток (Essner et al., 2002). Т.о., совсем маловероятно, что эти моноцилии продуцируют ламинарный ток жидкости у эмбрионов рыб или кур.
У рыбок данио ситуация ещё сложнее. Нодальный ток существует в Kupffer's vesicle (KV), как уже упоминалось выше и является важным для подъёма Ca2+ на левой стороне во время ст. нейруляции и последующего развития LR асимметрии (Kramer-Zucker et al., 2005; Essner et al., 2005). Однако, обработка яиц ингибитором Н+/К+ ATPase во время периода дробления приводит к дефектам формирования LR паттерна без нарушения левонаправленого тока в KV (Kawakami et al., 2005). Эти результаты указывают на существование, по крайней мере, двух разных и независимых процессов нарушения симметрии в ходе развития рыб, один из них зависит от дифференциальной активности Н+/К+ на ранних стадиях дробления, а др. нуждается в нодальном токе во время нейруляции. Направленный влево нодальный ток предопределяется автономно без учета LR асимметрии ранней стадии дробления, тогда как нодальный ток не достаточен для последующего развития LR асимметрии висцеральных органов, таких как сердце, печень и кишечник. Т.о., раннее нарушение симметрии может быть принципиальным детерминирующим событием. Вентральный узелок может быть необходим для нижестоящего сигнального пути, который может амплифицировать или перестраивать LR информацию, установленную во время стадии раннего дробления, чтобы собственно завершить процессы последующего развития в мезодерме (Raya et al., 2004).
Возможно, что реснички узелка также играют роль иную, чем генерация механического тока, особенно в передаче сигналов Hh. Кроме того, передача сигналов, обеспечиваемая NVPs может также вносить вклад в канонический сигнальный Hh путь/ Имеется множество белков, локализованных на точко-образных структурах в ресничках узелков, такие как FGFRs, Smo и РС2. Некоторые из них могут быть существенны для Smo-зависимого процессинга Gli3 в каноническом пути передачи сигналов Hh. Т.о., транспорт белковых комплексов в ресничках с помощью KIF3 моторов может быть необходим для передачи сигналов Рр (Huangfu et al., 2003; Huangfu,Anderson, 2005; Liu et al., 2005; Corbit et al., 2005). Нодальный ток может быть потерян во время эволюции птиц и амфибий ижз-за перекрывания процессов нарушения симметрии. Вместо этого реснички у этих видов могут распространять предсуществующую информацию, связанную с латеральностью, возможно посредством передачи сигналов Hh, которые также существенны для LR детерминации у этих животных (Levin et al., 1995; Sampath et al., 1997).
Однако, у млекопитающих детерминация осей тела происходит на значительно более поздней стадии. Информация о полярности до имплантации эмбриона может оказывать мало влияния на формирование осей тела после имплантации. Кстати, не выявляется асимметричных событий у эмбрионов мышей раньше стадии появления нодального тока (Nonaka et al., 2002)? это демонстрирует, что нарушение симметрии нодальным током доминирует над информацией о ранней полярности. Следовательно, может предположить, что нодальный ток м. стать принципиальным процессом детерминации с появлением viviparity, что может повлечь за собой необходимость в более мощной стратегии для ориентации LR асимметрии по сравнению с сигналами, присутствующими в время гаструляцию. J.Yost предложил гипотезу "zootype' для LR детерминации (Yost, 1999), согласно которой экспрессия генов, специфичных для левой стороны, эволюционно законсервирована только на phylotypic стадии и что паттерны экспрессии, регуляции и функционирования генов на ранних или поздних стадиях развития не обязательно законсервированы среди позвоночных (Palmer, 2004). Наша новая гипотеза предполагает, что вентральный узелок или "knot" обладают перекрывающимися процессами нарушения симметрии. Это создает интригующее объяснение кажущихся различий между ранними событиями в LR детерминации среди видов (Рис. 6).
Concluding Remarks
Итак, нодальный ток, генерируется ресничками, который обеспечивается молекулярными моторами KIF3.Нодальный ток является автономным процессом нарушения симметрии. Наклон кзади и вращение по часовой стрелке ресничек узелка в вязкой жидкости генерирует левонаправленный ток. Хотя имеются перекрывающие процессы нарушения симметрии у низших позвоночных, нодальный ток, по-видимому, существенен и достаточен для детерминации латеральности висцеральных органов у млекопитающих. Ток NVPs является вновь идентифицированным механизмом транспорта морфогенов с помощью нодального тока, который может активировать подъем Ca2+ особенно на левой стороне. Это может быть одним из первых примеров обеспечиваемого липопротеинами неканонического пути передачи сигналов Hh у млекопитающих.
Yosuke Tanaka, Yasushi Okada, and Sen Takeda