Спаривание Несосответствующих друг другу (mismatch) Оснований ДНК
The multifaceted mismatch-repair system
Josef Jiricny Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, No 5, P. 335-346 (May 2006) | doi:10.1038/nrm1907
Резюме.
By removing biosynthetic errors from newly synthesized DNA, mismatch repair (MMR) improves the fidelity of DNA replication by several orders of magnitude. Loss of MMR brings about a mutator phenotype, which causes a predisposition to cancer. But MMR status also affects meiotic and mitotic recombination, DNA-damage signalling, apoptosis and cell-type-specific processes such as class-switch recombination, somatic hypermutation and triplet-repeat expansion. This article reviews our current understanding of this multifaceted DNA-repair system in human cells.
B последнюю декаду существенная пропорция рака толстого кишечника, эндометрия и др. органов обнаруживала фенотип, известный как (MSI; see Refs 1,2 for rev.). Микросателлиты являются мотивами из повторяющихся последовательностей, таких как [A]n или [CA]n, которые присутствуют в нашем геноме в большом количестве. Во время синтеза ДНК праймерная и матричная нити в микросателлитах могут случайно диссоциировать и повторно отжигаться (re-anneal) некорректно3. Это ведет к образованию молекул ДНК, в которых количество единиц микросателлитных повторов в матричной и вновь синтезированной нити будут отличаться. Такие гетерогенности, при которых нуклеотиды, лишенные партнеров, частично вне спирали (extrahelical), известны как insertion/deletion loops (IDLs). Вместе с несоответствием основание-основание, которые вызываются ошибками ДНК полимераз, которые не выполняют своей функции по корректуре, IDLs попадают под действие mismatch repair (MMR) системы, которая деградирует содержащую ошибку секцию вновь синтезированной нити и тем самым предоставляет ДНК полимеразе ещё один шанс создать копию без ошибок с матричной последовательности. В отсутствие MMR, IDLs и несоответствия оснований остаются нескорректированными, это приводит к мутантному фенотипу, который сопровождается MSI и в конечном итоге, раком.
Благодаря эволюционной консервации этого сложного пути, большая часть нашего понимания MMR у млекопитающих получена в исследованиях Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae (rev. Ref. 4). Однако, важность нарушений MMR для болезней человека может быть проверена только на системах млекопитающих. Эти исследования выявили, что MMR белки участвуют также в др. ДНК-метаболических путях от передачи сигналов поврежденной ДНК до рекомбиногенных и мутагенных процессов, которые ограничены многоклеточными организмами. Основное внимание будет уделено успехам в нашем понимании MMR у человека (rev. Refs 2,4-9).
Criteria for successful MMR
Система MMR удовлетворяет двум критериям: во-первых, она д. эффективно распознавать несоответствия основание-основание и IDLs; во-вторых она д. управлять кухней репарации вновь синтезированной нити ДНК, которая несет ошибочную генетическую информацию. Как эти цели выполняются впервые было выяснено на E. coli, где исследования mutator линий , , and завершились воссозданием этой прототипической MMR системы из индивидуальных очищенных компонентов10.
У E. coli, распознавание биосинтетических ошибок обеспечивается с помощью MutS гомодимеров, которые затем рекрутируют гомодимеры MutL (Fig. 1a). ATФ-зависимое образование этого тройного комплекса активирует эндонуклеазную активность MutH, который связан с полу-метилированным GATC сайтом. Эти сайты обычно метилированные аденины, но из-за модифицирующего энзима, deoxyadenine methylase, происходит отставание репликационной вилки ~2 мин. так что вновь синтезированная нить временно не метилирована. MutS-MutL-активированный MutH использует это временное окно, чтобы вырезать неметилированную нить. UvrD helicase разматывает концы щербатой содержащей ошибку нити с матрицы. Это дает возможность одной из нескольких exonucleases переваривать размотавшуюся ДНК или в 5'→3' направлении, если ближайший полу-метилированный GATC сайт лежит 5' от несоответствия, или в 3'→5' направлении если он расположен 3' от несоответствия. Экзонуклеолитическая деградация останавливается, как только удаляется mismatch. Возникающий в результате пробел затем заполняется с помощью ДНК полиеразы III и репарация заканчивается, когда ДНК ligase герметически закрывает оставшуюся щель.
Хотя MutS и MutL белки высоко консервативны, MutH обнаружен только у Gram-отрицательных бактерий и не выявлено функционального гомолога у др. организмов. Это привело к предположению, что процессинг несоответствий, который происходит во время репликации, может управляться разрывами нити11, т.е. 5' или 3' окончаниями в запаздывающей (lagging) нити или 3' концом ведущей нити (Fig. 1b). Сходным образом, репарация несоответствий, которые возникают во время рекомбинации, может управляться, чтобы нарастить нить с помощью её 3' конца. Эта гипотеза была подтверждена экспериментально; E. coli линии, лишенные MutH, как было установлено, осуществляют процессинг mismatches in vivo12,13 и in vitro10, указывая тем самым, что субстрат содержит разрывы нити вблизи mispair. То же самое верно и для in vitro MMR подходов у человека14-16 (Fig. 1c).
Mismatch recognition in mammalian cells
Ситуация у эукариот более сложная, чем у E. coli. Из пяти MutS homologues (MSH), которые были идентифицированы в клетках человека, , и участвуют в MMR в форме гетеродимеров (Ref. 4 for rev.). Наиболее многочисленный mismatch-связывающий фактор состоит из MSH2 и MSH6. Этот фактор, который часто обозначается как MutSalpha, инициирует репарацию основание-основание несоответствий и IDLs из одного или двух extrahelical нуклеотидов17-19, тогда как репарация крупных IDLs инициируется с помощью MutSbeta, которая является гетеродимером из MSH2 и MSH3 (Table 1).
Частичное перекрывание между MutSalpha и MutSbeta помогает объяснить разные опухолевые фенотипы Msh2-, Msh3- и Msh6-нулевых мышей. Т.к. Msh2-/- животные лишены всех функций распознавания mismatch, то они имеют наиболее тяжелый фенотип20. Фенотип Msh6-/- мышей менее тяжелый по сравнению с Msh2-нулевыми животными21, т.к. MutSbeta может репарировать большинство IDLs. Msh3-/- животные не склонны к опухолям22, преимущественно из-за того, что MutSalpha может инициировать репарацию большинства репликационных ошибок.
The MutSalpha sliding clamp. Какров же молекулярный механизм распознавания mismatch? Белки MSH являются ATPases, которые обладают 23, который высоко законсервирован среди полипептидов, которые участвуют в репарации ДНК24. Однако, нуклеотиды безразличны к инициальному соединению MutSalpha и MutSbeta с их соотв. субстратами17-19,25, и связывание mismatch в основном не затрагивается аминокислотными заменами, которые меняют свойства ATФ-гидролиза или ATP-связывания одной или обеих субъединиц26,27.
Отсутствие эффекта мутаций ATФ-связывающего сайта на инициальное распознавание mismatch было объяснено, когда MutS гомологичный белок от Thermus aquaticus , как было установлено, контактирует с mismatched ДНК посредством Phe остатка внутри высоко законсервированного Phe-X-Glu мотива28 - этот мотив находтся на N конце и , следовательно, удаляется с C-терминального ATФ-связывающего сайта MutS гомологов. Интересно, что у эукариот мотив Phe-X-Glu законсервирован только в MSH6, это указывает на то, что только MSH6 может быть вовлечен в инициальное распознавание mismatch. В самом деле, когда законсервированный остаток Phe в MSH6 человека был мутирован в Ala, то MutSalpha терял свою ДНК-связывающую активность29 (как MutSbeta распознает IDLs пока неизвестно).
Хотя связывание нуклеотидов может быть не нужно для инициального распознавания mismatched субстрата, но АТФ контролирует функцию MutSalpha, что происходит немедленно после его инициального контакта с ДНК. Итак, в ответ на добавление АТФ, MutSalpha быстро диссоциирует из комплексов как с homoduplex, так и heteroduplex олигонуклеотидами. Интересно, что если концы олигонуклеотидов блокированы с помощью streptavidin26,30,31 или с помощью lac репрессора32, то гетеродимер остается избирательно отловленным на субстратах, содержащих mismatch, т.к. он диссоциирует от гомодуплексов. Эти находки указывают на то, что связывание mismatch в присутствии АТФ и magnesium вызывает быстрое конформационное изменение в MutSalpha, это позволяет ему покинуть mismatch и двигаться вдоль контура ДНК в виде .
Управляется ли движение MutSalpha по ДНК с помощью гидролиза АТФ31 или оно независимо от гидролиза33 спорный вопрос, в основном из-за трудностей организовать эксперименты, которые бы могли разделить разные функции гетеродимера. Итак, хотя ATPase активность MutSalpha определенно существенна для её функции в MMR, нелегко изучить её множественные функции - связывание mismatch, формирование манжетки, трансляция ДНК и диссоциация от ДНК (или непосредственно или путем соскальзывания с конца) - изолированно и определить, какая из них нуждается в связывании АТФ и в гидролизе нуклеотида. Более того, т.к. MutSalpha обладает двумя высоко гомологичными АТФ-связывающими сайтами, которые функционально независимы, то он может существовать в 9 разных nucleotide-occupancy состояниях34. Даже выянение кристаллической структуры белков MutS от E. coli35 и T. aquaticus36 не помогло выяснить роль нуклеотидов в функции MutSalpha.
Однако, структуры MutS четко подтвердили находки более ранних биохимических исследований. Так, в отсутствии ДНК, АТФ-связывающие домены двух субъединиц MutS были блокированы и четко структуированы, тогда как остальная часть белка была неупорядочена (Fig. 2a). В ко-кристалах с mismatched олигонуклеотидом, гомодимер MutS становится сильно упорядоченным и образует манжетку вокруг ДНК подобно паре молящихся рук37. Белок 'ставит на якорь' самого себя на субстрате путем инсерции Phe остатка из Phe-X-Glu мотива одной из субъединиц (большой палец одной из рук) в минорную борозду спирали в месте mismatch. Это приводит к искривлению ДНК примерно на 60° (Fig. 2b).
MutSalpha человека, который очищен из клеточных экстрактов, несет АДФ38, но его связывание с ДНК, как было показано, приводит к АДФ→ATФ замене30. Этот обмен сопровождается конверсией факторов в скользящей манжетке, которая, по-видимому, необходима для связывания АТФ, но не для гидролиза для его транслокации. В структуре бактериального MutS, АТФ-связывающий сайт субъединицы, которая контактирует с mismatch, занят молекулой АДФ, а АТФ-связывающий сайт др. субъединицы свободен. Вместе с тем фактом, что остаток Phe вставляется в спираль в месте mismatch, это указывает на то, что структура, которая выявляется в кристалле, представляет собой раннюю стадию связывания. С помощью диффузии различных нуклеотидов в MutS-ДНК-АДФ ко-кристаллы39,40, комбинированные MutS АТФ-связывающие сайты становятся более компактными. Эта компактизация, как было постулировано40, необходима для высвобождения MutS-ATФ комплекса от mismatch путем форсирования Phe-содержащего 'большого пальца' из ДНК посредством стерических взаимодействий, тогда как удерживающие 'пальцы' охватывают её (Fig. 2c).
В этой 'thumb-out, fingers-closed' структуре АТФ связана с обеими субъединицами, но не гидролизована. Это отличает его от MutSalpha человека, который обладает одним сайтом связывания с высоким сродством АДФ и одним сайтом связывания с высоким сродством АТФ; белок очевидно не может связывать две молекулы АТФ конкурентно41. Необходимо показать, вовлекаются ли действительно АДФ-MutSalpha-АТФ виды в распознавание mismatch и какие структурные изменения и/или изменения в оккупировании сайта связывания нуклеотида происходят, чтобы помочь дифференцировать между heteroduplex и homoduplex субстратами, действительно ли MutSalpha формирует скользящую манжетку на гетеродуплексном субстрате и диссоциирует непосредственно с гомодуплексного субстрата.
MutL homologues: molecular matchmakers?
MutL белки являются ATPases из семейства GHKL (gyrase/Hsp90/histidine-kinase/MutL)42, с ATPase, располагающейся в N-терминальном домене, и доменом димеризации на С конце. Клетки человека экспрессируют 4 MutL гомолога: MLH1, MLH3, PMS1 (post-meiotic segregation protein-1) и PMS2, которые функционируют как три самостоятельных гетеродимера (Table 1). Комплекс, который состоит из MLH1 и PMS2 - MutLalpha - играет наиболее важную роль в MMR, т.к. клетки, которые лишены любого из белков обладают mutator фенотипом и MSI, которая сравнима с клетками, которые мутантны по MSH2 (rev. Ref. 2). Однако, т.к. Mlh1-/- и Pms2-/- имеют не идентичные фенотипы (Pms2-/- мыши, хотя и склонны к раку, не обнаруживают опухолей ЖКТ43), то было предположено, что д.быть 'дубль' для PMS2 в метаболизме ДНК. MutLbeta, который состоит из MLH1 и PMS1, предположительно может выполнять эту функцию. Хотя не было установлено, что этот гетеродимер участвует в MMR in vitro44, Pms1-нокаутные мыши обладают MSI в мононуклеотидных участках43, значит MutLbeta может быть вовлечен в MMR в определенной степени. Сходным образом, MutLgamma, который состоит из MLH1 и MLH3,и который, как до сих пор верили, преимущественно вовлекается в мейотическую рекомбинацию, может также играть роль дубля в MMR млекопитающих. Mlh3-нокаутные мыши обнаруживают слабую нестабильность в мононуклеотидных микросателлитах и обнаруживают склонность к опухолям45, a рекомбинантный MutLgamma участвует, хотя и неэффективно в репарации основание-основание несоответствий и IDLs из одиночных нуклеотидов46. Роль этого фактора, следовательно, по-видимому, отличается от таковой у дрожжевой MutLgamma, которая участвует в репарации субнабора IDLs47.
Как MutL гомологи функционируют в MMR? У E. coli, активированная АТФ mismatch-связывающая MutS скользящая манжетка, как было показано, первой взаимодействует с гомодимером MutL. Это взаимодействие, как полагают, модулирует зависимый от гидролиза АТФ оборот комплекса и/или его взаимодействие с MMR факторами, связанными с сайтом инициации эксцизии, такими как MutH и UvrD (rev. Ref. 4). Как это взаимодействие может осуществляться является предметом дискуссии. Первые три предпочтительные модели показывают, что MutS-MutL комплекс формируется на mismatch и затем транслоцируется в любом направлении и помогает инициировать эксцизионный процесс на столкнувшихся MutH и UvrD48; вторая модель указывает, что MutS взаимодействует с MutL с месте инициации репарации; и третья модель указывает на то, что комплекс MutS-MutL остается связанным на mismatch и взаимодействует с MutH и UvrD белками путем образования петли из расположенной между ними ДНК49. Доказательства в пользу этих моделей в основном косвенные; комплекс MutS-MutL, однако, как было показано, мигрирует во время E. coli MMR in vivo50, что говорит против третьего сценария.
Одинаково с бактериальными MutS и MutL белками, человеческие MutSalpha и MutLalpha могут формировать относительно стабильные АТФ-зависимые тройные комплексы на олигонуклеотидных субстратах, которые имеют свободные концы51-53. Эти доказательства согласуются с находками in vitro, что mismatch-провоцированная деградация разрезанной нити может быть инициирована на субстратах, содержащих физические барьеры между mismatch и местом инициации эксцизии54,55, и ведут к предположению, что комплекс MutSalpha-MutLalpha остается связанным на mismatch и инициирует реакцию репарации с помощью петлеобразования находящейся между ними ДНК. Однако, surface-plasmon-resonance исследования, которые были проведены на MutSalpha-MutLalpha комплексах у людей51 и дрожжей32, предоставили доказательства того, что комплекс MutSalpha-MutLalpha может путешествовать вдоль контура ДНК точно также как MutSalpha скользящая манжетка.
К сожалению, ни одна из экспериментальных систем не установила, где собираются тройные комплексы. Склонность белков ассоциировать также с концами ДНК53,56 осложняет интерпретацию результатов этих исследований. В некоторых экспериментах, образование тройных комплексов оказывалось независимым от mismatch и было очень чувствительным к изменениям в экспериментальных условиях. Т от факт, что тройные комплексы обладают 4 АТФ-связывающими сайтами на MutL и MutS гомологах ещё больше осложнили интерпретацию данных. Более важно то, что, неясно, отражают ли эти исследования функцию этих полипептидов во время MMR, учитывая, что репаративный процесс использует несколько добавочных белков, которые не учтены в выше представленных подходах.
PCNA and MMR
Помимо MutS и MutL гомологов, MMR нуждается в некоторых др. факторах, большинство из которых участвуют в репликации ДНК. Один из таких факторов является гомотримерный proliferating cell nuclear antigen (PCNA). Во время репликации ДНК скользящая манжетка PCNA sliding загружается на 3' конец фрагмента Okazaki fragment или на 3' конец ведущей нити с помощью of replication factor C (RFC). Будучи загруженным он ассоциирует с реплицирующей ДНК полимеразой и функционирует как её processivity фактор. Благодаря этой функции ожидается участие PCNA в MMR синтезе.
Неожиданно эксперименты в лаб. Kunkel выявили участие PCNA в ступени MMR процесса, который предшествует репаративному синтезу57. Эта находка была подтверждена, когда было показано, что MSH6 и MSH3 взаимодействуют с PCNA in vitro и in vivo посредством высоко законсервированных PCNA-взаимодействующих мотивов вблизи их N концов58. Это указывает на то, что MutSalpha и/или MutSbeta могут присутствовать в комплексах репликации ДНК, где они могут контролировать прогресс синтеза ДНК, напр., взаимодействуя с PCNA-DNA polymerase комплексом на соединении с mismatch.
В сравнительно недавних исследованиях соединение MutSalpha с mismatched субстратами, как было показано, ведет к диссоциации факторов от PCNA59, это указывает на то, что processivity фактор может связывать MutSalpha во время репликации ДНК, но передает его кухне MMR, когда выявляется mismatch.
Exonucleases in MMR
Учитывая, что mismatch-зависимая деградация гетеродуплексных субстратов может инициироваться на нити с разрывом или пробелом, который результат или 5' или 3' mispair (Fig. 1b), было предположено, что процесс MMR д. использовать эндонуклеазы как 3'→5' , так и 5'→3' полярности. В соответствии с этим ожиданием, генетические исследования на дрожжах выявили 3'→5' корректирующие активности ДНК полимеразы delta и/или ДНК полимеразы epsilon в MMR60,61, a недавние находки показали, что 3'→5' экзонуклеазная активность MRE11 (Ref. 62) также может быть необходима in vivo. Поскольку 5'→3' экзонуклеазы задействованы, то единственным энзимом с такой направленностью и участием в MMR in vivo и in vitro является exonuclease-1 (, rev. Ref. 63). В отличие от мышей, которые лишены MSH2 или MLH1, Exo1-/-мыши склонны к лимфомам, но не к опухолям ЖКТ. Они стерильны подобно Mlh1-/- животным, но мейотические дефекты, по-видимому, возникают позднее. Экстракты из embryonic stem (ES) клеток были дефицитны по репарации base-base mismatches и однонуклеотидных IDLs, но не по отношению к крупным IDLs. Соответственно, mutator фенотип клеток был слабее, чем тот, что наблюдался у MSH2- и MLH1-дефицитных клеток, а MSI ограничивалась мононуклеотидными повторами. Всё это указывает на то, что EXO1 участвует в некоторых, но не во всех, MMR-зависимых событиях in vivo64. Поэтому было удивительным узнать, что восстановленная MMR система нуждается только в EXO1 как для 5'→3', так и 3'→5' коррекции mismatch.
Reconstitution of the human MMR system
Восстановление двунаправленной MMR системы из её индивидуальных очищенных компонентоа представляет собой одну из главных задач в области репарации ДНК. Первоначальные исследования пытались фракционировать экстракты клеток HeLa и идентифицировать составные MMR в активных фракциях. Это привело не только к идентификации MutSalpha18 и MutLalpha65, но также выявило ДНК полимеразу delta66, однонитчатый фактор связывания replication protein A (RPA)67,68, EXO1 (Ref. 69) и негистоновый компонент хроматина high-mobility group box 1 (HMGB1)70 в качестве MMR факторов. Вместе с PCNA, этот спектр белков, по-видимому, достаточно представителен, чтобы попытаться реконструировать MMR. Первоначальные исследования сконцентрировались на mismatch-провоцируемой экзонуклеолитической деградации разорванной нити в гетеродуплексном субстрате (Fig. 1c.).
5'→3' strand degradation. На гетеродуплексном субстрате, который содержит одиночное несоответствие G-T и разрыв нити, который расположен на 125 нуклеотидов прочь в 5' направлении, EXO1 катализирует 5'→3' деградацию разорванной нити, так что mismatch удалялся в один шаг69. Однако, загрузка EXO1 на разрыв была очень неэффективной. В присутствии MutSalpha-ATP, EXO1 загружался на разрыв более эффективно и его processivity увеличивалась. Это отличалось от ситуации с клеточными экстрактами, в которых тракты деградации заканчивались примерно на 150 нуклеотиде от сайта mismatch.
В последующих исследованиях71,72 система была изучена детельно. В присутствии HMGB1, эффективность MutSalpha-зависимой EXO1-обеспечиваемой 5'→3' деградации оптимальна72. RPA также стимулирует активность EXO1 в присутствии MutSalpha, но только до тех пор, пока присутствует mismatch. Как только неправильные пары удалены, RPA ингибирует EXO1, преимущественно путем вытеснения его из гомодуплекса73. Реакция 5'→3' деградации не нуждается в MutLalpha, хотя, как полагают, присутствие этого фактора улучшает избирательность реакции на гетеродуплексные субстраты. Более того, ингибирование активности EXO1 после устранения mismatch более сильное, когда присутствуют MutSalpha, MutLalpha и RPA72,73.
3'→5' strand degradation. Когда четырехкомпонентная система (MutSalpha-MutLalpha-RPA-EXO1) наталкивается на разрыв нити, который с 3' стороны от mismatch, то она инициирует реакцию деградации 5'→3' нити, которая перемещается прочь от mismatch71. Т.к. экстракты клеток человека катализируют MMR реакции как вe 5'→3' так и в 3'→5' направлении16, поэтому Dzantiev с коллегами фракционировали экстракты клеток HeLa и анализировали активности, которые пригодны для реконструкции системы, чтобы катализировать также mismatch-активруемую деградацию 3'→5' нити. Фракции, которые обладали такой активностью, оказались содержащими RFC71.
Как RFC может изменять направленность реакции деградации in vitro? Когда PCNA загружается на циркулярную ДНК, которая содержит разрыв нити, то она ассоциирует преимущественно с 3' концом, в то время как RFC д. оставаться связанным с 5' phosphoryl концом. Было предположено, что формирование комплекса MutSalpha-MutLalpha-EXO1-PCNA-RFC может запускать скрытую 3'→' экзонуклеазную активность EXO1, которая д. катализировать деградацию нити, содержащей ошибку в направлении mismatch. Сегодня неясно, как это происходит. Однако, процесс нуждается в каталитически активной EXO1, которая д. по-видимому, использовать жту ферментативную активность в реакции деградации 3'→5'нити.
Bidirectional MMR in vitro. В приведенных выше in vitro экспериментах отслеживалась реакция деградации только mismatch-активированной нити. Однако, полный MMR процесс был воссоздан в лаб. Gou-Min Li72 и Paul Modrich74 из очищенных рекомбинантных составляющих путем добавления MutSalpha-MutLalpha-RPA-EXO1-PCNA-RFC-(HMGB1) системы с ДНК полимеразой delta и ДНК ligase I. Восстановленные системы, использованные в обеих группах катализировали репарацию гетеродуплексного субстрата, который содержал G-T mismatch и 5' разрыв нити. Кроме того, система Zhang et al. эффективно репарировала IDL из трех внеспиральных нуклеотидов, демонстрируя тем самым, что MutSalpha была замещена на MutSbeta. Не выявлено 3'→5' MMR в системе Zhang et al.72. Напротив система Constantin et al. поддерживает двунаправленную MMR74. Причины, которые лежат в основе этих различий неясны, но это может быть связано с варьирующей чистотой препаратов RFC.
Molecular mechanisms of mismatch repair
На базе доступных биохимических доказательств предложены три рабочие гипотезы MMR у млекопитающих. Модель молекулярного переключения33 отдает предпочтение стохастической двунаправленной диффузии множественных скользящих манжеток MutSalpha (возможно с MutLalpha) от mismatch. Манжетки, которые наталкиваются на разрыв нити, который нагружен др. MMR факторами, и возможно включает PCNA, д. затем запускать процесс репарации. Модель активной транслокации31,41 полагает, что MutSalpha (возможно с MutLalpha), однажды освободившись от mismatch, д. транслоцироваться вдоль ДНК контролируемым способом, который зависит от гидролиза АТФ. Модель ДНК bending/verification предполагает, что MSH белки остаются вблизи mismatch и что общение между mismatch и нить-дискриминирующим сигналом затрагивает скорее изгибание ДНК, чем перемещение белка вдоль ДНК54,55. Эта последняя модель базируется на исследованиях E. coli, где было показано, что MutH может быть активирована с помощью mismatch-связанных MutS-MutL в транс-положении75. Этого не было продемонстрировано в системах млекопитающих. Более того, т.к. MMR эксцизионные треки инициируются strand-discrimination сигналом и распространяются приблизительно на 150 нуклеотидов от места, то позиция mismatch д. становиться свободной во время ступени эксцизии. Это требует, чтобы комплекс распознавания mismatch покидал место mismatch в некоем направлении. В самом деле, хотя mismatch-зависимая эксцизия активируется в экспериментальных системах, которые разработаны Wang и Hays, репаративный процесс не способен достичь завершения54,55.
Имеющиеся доказательства, следовательно, говорят в пользу первой и второй моделей. Т.к. различия между ними заключаются в основном в способе трансляции MutSalpha от mismatch, который не затрагивает принципиального механизма процесса, то они будут обсуждаться как один (Fig. 3). ATФ- и mismatch-активированная манжетка MutSalpha (с или без MutLalpha) может двигаться прочь в любом направлении. Манжетка, которая наталкивается на пробел, который в 5' положении от mismatch, д. первой контактировать с молекулой RFC, которая связана с 5' стороной пробела. EXO1 д.быть загружен здесь, преимущественно вследствие смещения RFC, и д. начаться деградация нити в 5'→3' направлении, перед и по ту сторону mismatch (Fig. 3a).
Диффузия активированной манжетки в противоположном направлении д. привести к встрече с молекулой PCNA, связанной с 3' концом разрыва нити. Молекула RFC, которая связана с 5' стороной разрыва не д. смещаться с помощью MutSalpha, и поэтому не д. быть деградации, обусловленной EXO1, в направлении прочь от mismatch. Вместо этого комплекс, который содержит MutSalpha, MutLalpha, EXO1, PCNA и RFC (и возможно HMGB1) д. собираться на 3' конце пробела и обусловливать деградацию в направлении mismatch (Fig. 3b). Однонитчатая ДНК д. быть в обоих случаях покрыта RPA, которая также д. ингибировать дальнейшую деградацию, как только будет удалено mismatch. ДНК полимераза delta д. быть затем загружена и заполнить пробел. Наконец ДНК лигаза I д. закрыть оставшуюся щель и тем самым завершить процесс репарации.
MMR deficiency and drug resistance
Выше мы обсудили механизм MMR-катализируемой репарации биосинтетических ошибок. Однако, система MMR используется также для передачи сигналов и/или несоответствующего процессинга разного типа повреждений ДНК, т.к. MMR-дефицитные клеточные линии являются более резистентными к гибели, которая скорее индуцируется несколькими разными типами химических веществ, чем пригнанные, способные к MMR клетки (Table 2 and Ref. 76).
MMR and DNA-damage tolerance. MMR-дефицитные клетки более чем в 100 раз более резистентны, чем пригнанные, способные к MMR клетки, к гибели, которая индуцируется метилирующими агентами типа (SN1). Первичное цитотоксическое повреждение, которое генерируется этими субстанциями - это O6-methylguanine (MeG), который спаривается с C или T во время репликации. В клетках дикого типа MeG-C и MeG-T несоответствующие пары могут быть распознаны MutSalpha77, который и буде активировать MMR. Т.к. модифицированное основание находится в матричной нити и т.к. репарирующая полимераза д. регенерировать MeG-C и MeG-T несоответствующие пары во время репаративного синтеза, то было предположено, что MMR процесс запускается повторно до тех пор, пока не будет арестована репликационная вилка (Fig. 4, top). Т.к. MMR-дефицитные клетки не пытаются осуществить процессинг MeG-C и MeG-T неправильных пар, то они выживают за счет обширного мутагенеза. Они поэтому оказываются толератными к повреждениям ДНК скорее, чем резистентны к повреждениям ДНК78.
Арест клеточного цикла, который активируется с помощью клинически переносимых доз метилирующих агентов, как было показано, нуждается в ataxia telangiectasia и Rad3 related (ATR) киназе, которые фосфорилируют его эффекторную checkpoint kinase CHK1 (Ref. 79). Т.к. этот киназный каскад активируется в ответ на блокирование репликации, то делается вывод, что арест клеточного цикла запускается с помощью безуспешного процессинга MeG-C и MeG-T mispairs во время S фазы. Неожиданным и необъяснимым наблюдением является то, что КПП (checkpoint) активируется только во время второго клеточного цикла после воздействия80-82. Наши данные показывают, что рекомбинация ДНК может помочь восстановлению клеток во время первой S фазы, но что это ведет к возникновению структур, которые являются цитотоксическими в последующем клеточном цикле83.
MMR-дефицитные клетки также более толерантны к воздействию 6-thioguanine, чем способные к MMR клетки, хотя примерно в 10 раз. Это лекарство инкорпорируется в ДНК, где оно может метилироваться с помощью S-adenosylmethionine в 6-methylthioguanine (Me6-thioguanine), который обладает сходными свойствами неправильного кодирования, что и MeG (Refs 84,85). Me6-thioguanine может быть генерирован только после первой S фазы, так что Me6-thioguanine-T неправильные пары могут возникать только во время второй S фазы. Соотв., арест клеточного цикла, который индуцируется 6-thioguanine существенно задержан. Более того, воздействие 6-thioguanine активирует ATR/CHK1-зависимый checkpoint76,86,87, это указывает на то, что этот арест клеточного цикла запускается также с помощью процессинга повреждений ДНК на репликационной вилке88.
Дефект MMR ассоциирует с примерно двухкратной резистентностью к гибели, которая индуцируется с помощью cis-diammine-dichloroplatinum (II) (CDDP; известным также как cisplatin)89-91. Повреждение, которое, как полагают, ответственно за большую часть биологической активности CDDP - это 1,2-внутринитчатые поперечные сшивки между N7 атомами соседних пуринов. Интересно, что 1,2-G-G соединение может, как было показано, связывать очищенный MutSalpha77, особенно когда один из пуринов неправильно спарен с T (Ref. 92). Однако, в отличие от MeG или Me6-thioguanine, CDDP аддукты в ДНК образуют физический барьер для репликативной ДНК полимеразы. Соотв., обработка клеток млекопитающих CDDP вызывает быстрый арест в S-фазе клеточного цикла, который, по-видимому, активируется с помощью остановившейся репликационной вилки (Fig. 4, top). Напротив, повреждение может быть обойдено с помощью одной из нескольких специализированных полимераз и арест клеточного цикла может быть активирован с помощью процесса репарации, который происходит позади репликационной вилки (Fig. 4, bottom). Возможно также, что более одного механизма оперирует в этом случае, т.к. CDDP-обработанные клетки млекопитающих активируют многие реагирующие на стрессы пути (Refs 76,93 for rev.), по крайней мере, один из которых использует MMR94.
Некторы CDDP adducts структурно сходны с пиримидиновыми фотодимерами, которые вносятся в ДНК с помощью УФЛ. В самом деле, CDDP повреждения прежде всего адресованы (NER) пути. Недавние доказательства на системах мышиных моделей показали, что MMR дефект усиливает резистентность ES клеток и фибробластов к УФЛ95, особенно в комбинации с инактивацией глобальной NER96. Имеются указания на то, что MMR участвует в активации ареста в S-фазе клеточного цикла, которая может быть запущена с помощью аберантного спаривания нуклеотидов, которые генерируются во время синтеза, обходящего повреждение.
В противположность описанным выше реагентам, MMR-дефицитные клетки являются более чувствительными к гибели, которая индуцируется с помощью interstrand crosslinking (ICL) агентов, таких как 1-(2-chloroethyl)-3-cyclohexyl-nitrosourea (CCNU), по сравнению со способными к MMR клетками (Ref. 97). Это различие было не столь большим и не наблюдалось во всех экспериментальных системах91, но это заслуживает тщательной проверки, учитывая, что ICL-индуцирующие химические соединения являются единственными реагентами, к которым MMR-дефицитные клетки более чувствительны, чем способные к MMR-клетки.
MMR proteins in apoptosis. В приведенных выше примерах детекция повреждений ДНК с помощью системы MMR, как полагают, запускает процесс ДНК метаболизма, который активирует checkpoint клеточного цикла. Однако, белки MMR, как было предположено, выполняют также роль в управлении апоптической передачи сигналов98. В этом сценарии распознавание повреждений ДНК с помощью MMR факторов д.быть достаточным для запуска ареста клеточного цикла и апоптоза без необходимости в процессе повреждения (Fig. 4, middle).
Вполне возможно, что такой сигнальный каскад может активироваться путем непосредственного взаимодействия связанных с повреждением MMR белков с сигнальными киназами, такими как ATR, CHK1 и CHK2, каждая из которых, как известно, формирует комплексы с MSH2 (Refs. 98,99). Вполне возможно также, что сигнальный каскад вовлекает и ATM/ATR-substrate CHK2-interacting zinc-finger (ASCIZ) фосфопротеин, который формирует MMR-зависимые ядерные фокусы в клетках, которые были обработаны метилирующими агентами, что открывает принципиальную возникновения N-модифицированных пуринов и/или abasic (лишенных оснований) сайтов100. Однако, эта гипотеза нуждается в подтверждении.
Концепция прямой передачи сигналов, по-видимому, подтверждается также сообщениями о доминантно-негативных аллелях у мышей Msh2 (Ref. 101) и Msh6 (Ref. 102), которые несут мутации в сайтах связывания АТФ MSH2 или MSH6, соотв. Белки, которые кодируются этими аллелями сохраняют способность соединяться с mismatches, но неспособны активировать нижестоящую ступень MMR. Неожиданно, клетки, которые экспрессируют эти аллели, обнаруживают чувствительность к метилирующим агентам, 6-thioguanine и CDDP, это сравнимо с тем, что наблюдается в клеточных линиях дикого типа, и это указывает, что сигнальные пути активируются непосредственно в отсутсвие процессинга ДНК.
MMR and other pathways of DNA metabolism
Давно известно, что MMR затрагивает эффективность и точность как митотической103,104, так и мейотической105 рекомбинации ДНК. Во время митотической рекомбинации MMR белки, ка было предположено, предупреждают обмен нитями между сходными, но не идентичными () последовательностями, возможно путем блокирования ветви миграции в направлении mismatch. Соответственно, MMR инактивация ведет к повышению частоты homeologous рекомбинации, у E. coli106 и в клетках млекопитающих20. Находки, что участки генной конверсии являются более длинными в отсутствие MMR указывает на то, что детекция mismatches с помощью системы MMR устраняет процесс обмена нитями или до или после процессинга mismatch. Когда обмен нитями абортирован до процессинга mismatch, то это может давать др. шанс отыскать в точности гомологичный фрагмент, но не позволяет, чтобы разрыв двойной нити был бы репарирован с помощью альтернативного механизма, такого как (NHEJ). Когда обмен нитями абортирован после процессинга mismatch, то последний будет внесен в репарированный дуплекс (Fig. 5).
Хотя митотическая рекомбинация использует тот же самый набор MMR белков, что используются в репарации ошибок репликации, данные исследований на дрожжах и нокаутных мышиных моделях показали, что мейотическая рекомбинация обеспечивается с помощью др. комбинации MMR факторов. Процесс нуждается в MSH4-MSH5 гетеродимере скорее, чем в MutSalpha или MutSbeta107-109. Соответственно, Msh2-/- или Msh6-/- животные не обнаруживают заметных мейотических дефектов. MLH1, по-видимому, преимущественно функционирует в комплексе с MLH3, как у самцов, так и у самок мышей, которые лишены этих белков и стерильны43,110. PMS2 также, по-видимому, необходим, но т.к. только самцы являются стерильными, то MLH1-PMS2 гетеродимер может участвовать только в субнаборе событий, таких как формирование во время мейоза I111.
и (SHM) вариабельных регионов иммуноглобиновых генов, которые имеют место во время специфическийх стадий стимулированной антигенами дифференцировки B клеток, функционируют по другому в отсутствие MMR112-115, как это наблюдалось у нокаутных мышей. SHM затрагивает специфические транскрибируемые области генов, где энзим activation-induced deaminase (AID) превращает C остатки в U. Процессинг U остатков, возможно в контексте AID-индуцированных G-U mismatches, как полагают, запускает мутагенный процесс, который использует склонную к ошибкам ДНК полимеразу, такую как DNA polymerase eta116,117. Мутации G-C пар оснований возникают преимущестенно внутри консенсусных последовательностей RGYA/T (R = purine, Y = pyrimidine), тогда как консенсусные последовательности T/AA мутаируют в A-T парах оснований. Интересно, что дефекты MMR снижают показатель только мутаций A-T пар оснований. Более того, SHM фенотипы животных, которые лишены разных MMR генов, отличаются - Msh2-, Msh6- и Exo1-нокаутные мыши обладают более заметными фенотипами, чем мыши с инактивированными генами Mlh1 и Pms2. Итак, присутствие MutSalpha, по-видимому, способствует мутагенезу скорее, чем предупреждает от него.
MMR белки также, по-видимому, затрагивают процесс аберрантной экспансии повторов триплетов, наблюдаемой при нейродегенаративных нарушениях, таких как болезнь Гентингтона, миотоническая дистрофия и синдром ломкой Х. Экспансия, которая затрагивает такие [CTG]n, [CGG]n или [GAA]n последовательности варьирует очень сильно и маловероятно, что образующая петлю ДНК будет подвергнута процессингу с помощью MMR. Однако, эти структуры, ка было показано, стабилизируют линии E. coli118 и мышей119, которые дефицитны по MMR. Хотя механизм этого процесса неизвестен, доступные доказательства показвают, что MutSbeta может соединяться с такими петлями и мешать скорее, чем помогать процессингу коррекции этих структур120.
Conclusions
The MMR system has received a considerable amount of attention during the past decade, primarily thanks to its link with hereditary non-polyposis colon cancer (HNPCC), one of the most common inherited cancer-predisposition syndromes. Understandably, the initial investigations into MMR focused primarily on its role in mutation avoidance. Although the MMR system could be reconstituted from eight recombinant proteins, there are undoubtedly other redundant or non-essential factors that participate in the process in vivo, and these remain to be identified.
It is now clear that the MMR system is multifaceted and that it participates in several different pathways of DNA metabolism, namely those that involve recombination. Given the importance of these processes in the maintenance of genomic stability, it would be of substantial interest to learn how MMR proteins affect the outcome of meiotic and mitotic recombination events. Most of our insights come from yeast studies, and it is desirable to understand these processes in mammalian cells.
The study of MutL homologues deserves particular attention, as the biological roles of these proteins remain enigmatic and as the malfunction of different heterodimeric combinations of MLH proteins gives rise to very diverse phenotypes, which range from genomic instability to sterility.
The involvement of MMR proteins in DNA-damage signalling also requires further study, as this process could have an important role in spontaneous cell transformation and cancer. Moreover, the MMR status affects, in some cases by several orders of magnitude, the response of cells to certain classes of therapeutics. In my view, one of the greatest challenges of modern molecular-cancer research is to understand how one and the same system guards genomic stability on the one hand, while contributing to cell death on the other.
