Посещений:
Передача Сигналов Notch

Механизмы и Роль
В.А. Мглинец
( по материалам сайта)
Существует три типа однонаправленных сигнальных взаимодействий между соседними клетками.
  • 1. Сигнал передаётся непосредственно из цитоплазмы одной клетки посредством небольшого канала (conduits) в цитоплазму соседней клетки.
  • 2. Рецепторы одной клетки соединяется со своим лигандом во внеклеточном матриксе, куда тот секретируется другими клетками.
  • 3. Белок на одной клеточной мембране соединяется с рецептором на мембране соседней клетки.


    • Последний тип взаимодействий осуществляетмя между рецепторами Notch и их лигандами (Рис. 1). В соответствии с этим передача сигналов может идти по короткой или длинной цепи. Примером короткого каскада может служить сигнальный путь Notch, ограничивающийся двумя соседними клетками. Примером дальнодействующего сигнального пути может служить белок Shh, который может осуществлять своё действие на значительном расстоянии от места секреции, формируя градиент конецентрации сквозь десятки клеточных диаметров, активируя или репрессируя разные группы регуляторов транскрипции. Функцию сигналов выполняют лиганды, к которым относятся гормоны, факторы роста или морфогены, которые специфически взаимодействуют с определенными рецепторами на поверхности клетки. Общим в деятельности сигнальных каскадов является передача сигнала от клеточной поверхности в ядро. Нарушения любого звена в сигнальной цепи должны приводить к сходным фенотипическим нарушениям.



    Механизм активности Notch. (А) До передачи сигналов Notch, CSL транскрипционный фактор (такой как Supressor of hairless или CBF1) находится на энхансере Notch-регулируемых генов. CSL связывает репрессор транскрипции. (В) Модель активации Notch. Лиганд (Delta, Jagged или Serrate белок) одной клетки соединяется с внеклеточным доменом Notch белка соседней клетки. Это связываение вызывает изменение формы внутриклеточного домена Notch, это активирует протеазу. Протеаза расщепляет Notch и делает возможным внутриклеточной области белка Notch вступать в ядро и соединяться с CSL транскрипционным фактором. Эта внутриклеточная область Notch смещает репрессорный белок и соединяется в активаторами транскрипции, включая histone acetyltransferase p300. Активированный CSL м. затем транскрибировать свои гены-мишени.

    Как видно на Рис. 1, дающем упрощенную сигнальную схему, клетки, экспрессирующие лиганды Delta, Jagged или Serrate на своих клеточных мембранах активируют соседние клетки, которые содержат Notch белок на своей клеточной мембране. Рецептор Notch пронизывает клеточную мембрану и его наружный конец контактирует с белками Delta, Jagged или Serrate, выступающими на поверхности соседеней клетки. Когда образуется соединение с одним из этих лигандов, то рецептор Notch подвергается конформационному изменению, которое приводит к тому, что часть его цитоплазматического домена отрезается. Отрезанная часть проникает в ядро и соединяется с дремлющими транскрипционным фактором из семейства CSL, которые в результате активируют свои гены-мишени (Рис. 1).
    Однако, в действительности картина более сложная. На Рис. 2 схематически представлена доменовая структура Notch, которая указывает, что белок может взаимодействовать со многими факторами.



    Рис. 2.  |  Доменный состав Notch. Внеклеточный домен Notch состоит преимущественно из EGF повторов (light blue), в пределах от 36 в Drosophila Notch и в Notch позвоночных до 10 у C. elegans GLP-1. Он включает также три Lin12/Notch повтора (LNRs; dark gray). EGF повторы 11 и 12 (dark blue) необходимы и достаточны для соединения с Dl и Ser. Показаны мутировавшие EGF повторы у split (yellow) и Ax (orange). Внутриклеточный домен включает 6 ankyrin повтора (green) и два сигнала ядерной локализации (black dots). Позиции расщепления S1-S4 (стрелки), предопределены O-fucosylated сайтами (o; эволюционно законсервировнаные сайты показана звёздочками), показаны С-конец NotchMcd белков (gray головки стрелок) и домены взаимодействий с избранными партнёрами.

    Рассмотрим детальнее отдельные звенья этой сигнальной системы.
    1. Появление Участников Взаимодействия Лиганд-Рецептор в Клеточной Мембране


    Каждый из Notch синтезируется как одиночный трансмембранный полипептид, но вновь синтезированные молекулы Notch подвергаются процессингу в trans-Goldgi сети, с помощью протеаз семейства Furin они разрезаются на два фрагмента Notch Extra-Cellular Domain (NECD) и пронизывающий мембрану внутриклеточный домен, наз. NTM (Notch transmembrane) (Рис. 2). NECD и NTM фрагменты взаимодействуют нековалентно Са2+ зависимым способом(Рис. 3). Пока неясно с помощью какого механизма уже готовый гетеродимер Notch переносятся в клеточную мембрану и как они закрепляются в плазматической мембране в виде гетеродимера, состоящего из эктодомена и трансмембранного домена, соединенными нековалентно.


    Рис. 3. Notch синтезируется в виде ~300-kDa предшественника, который испытывает 3 расщепления. В секреторном аппарате (trans-Golgi на Рис.), предшественник Notch расщепляется на сайте просвета с помощью furin-подобной конвертазы, чтобы образовать отдельный внеклеточный и трансмембранный/внутриклеточный домены. Эти сегменты объединяются с помощью нековалентного соединения, создавая гетеродимерную форму Notch, которая является основной формой, обнаруживаемой на клеточной поверхности. Соединение Notch с лигандами семейства Delta/Serrate/Jagged family приводит к удалению эктодеомена в результате внеклеточного расщепления обеспечиваемого с помощью TACE/ADAM (disintegrin и metalloproteinase/tumour necrosis factor-α-converting enzyme) metalloproteinases. Закрепленный в мембране С-терминальный фрагмент, который остаётся после этого события расщепления постепенно подвергается процессингу с помощью γ-secretase комплекса, который содержит presenilin, nicastrin и др. компоненты. Для простоты показаны только presenilin и nicastrin на третьей ступени расщепления. Имеющиеся доказательства указывают на то, что Notch первоначально ассоциирует с γ-secretase компонентами во время своегосинтеза и secretory транспорта на клеточную поверхность. Это внутримембранное расщепление высвобождает внутриклеточный домен Notch, который транслоцируется в ядро, чтобы регулировать экспрессию генов-мишеней, таких как Enhancer of split ( E(spl)), в ассоцииации с др. ядерными факторами. CSL, C promoter binding factor/Suppressor of Hairless/Lag-1 transcription-factor protein family.

    Теперь обратимся к Notch лигандам, которые подразделены на две структурно родственные группы: Delta-like лиганды (Dll1-1, -3 и -4) и Serrate-like лиганды (Jagged-1 и -2 у позвоночных) (Рис. 4).


    Рис. 4. Структура представителей Notch рецепторов и лигандов. | Члены семейства Notch показаны слева, а некоторые их лиганды справа. У Drosophila melanogaster и позвоночных Notch рецепторы обычно содержат 36 внеклеточных epidermal growth factor (EGF)-подобных повторов (хотя у некоторых млекопитающих существуют варианты с несколько меньшим числом повторов), трёх Notch/Lin-12 повторов (LN), 6 внутриклеточных ankyrin повторов (ANK) и С-терминального домена PEST. У Caenorhabditis elegans, Lin-12 и Glp-1 белки имеют общее структурное сходство с Notch у Drosophila и позвоночных, хотя они не содержат идентичных повторов или доменовой структуры. Большинство Notch, присутствующих на клеточной поверхности, находятся в гетеродимерной форме из N-терминального внеклеточного домена, соединённого с С-терминальным трансмембранным доменом. Notch лиганды, такие как Delta и Serrate белки у Drosophila, Jagged у млекопитающих и Apx-1 и Lag-2 белки у C. elegans, являются трансмембранными белками, которые обладают общими свойствами, коротким внутриклеточным доменом, несколькими внеклеточными EGF-подобными повторами и N-терминальным Delta/Serrate/Lag-2 (DSL) доменом, который обеспечивает соединение с Notch.

    Оба типа лигандов являются трансмембранными белками с рядом тандемных EGF-подобных повторов в их внеклеточном домене и с уникальным Delta, Serrate и Lag-2 (DSL)-связывающим доменом на N-конце, необходимым для взаимодействия с рецептором. Их появление на клеточной мембране, по-видимому, осуществляется сходным с Notch рецепторами образом. На это указывает одинаковый характер их дальнейших расщеплений.
    Исследования на мухах и червях показали, что исход передечи сигналов Notch чрезвычайно чувствителен к очень небольшим изменениям (двукратным) в количествах Notch рецепторов или лигандов. Более того, гапло-недостаточность по Jagged-1 лиганду вызывает Alagille syndrome (AGS), мультиорганное нарушение развития у людей. Эти данные указывают на то, что эффективность (strength) передачи сигналов Notch д. регулироваться очень точно, чтобы гарантировать, что будет сделан соответствующий выбор клеточной судьбы. Благодаря тому, что путь Notch используется в столь многих разных контекстах он является предметом многих способов регуляции.

    2. Регуляция Взаимодействия Рецептор-Лиганд посредством гликозилирования


    Последовательное добавление O-сцепленных гликанов к EGF доменам в CHO клетках. Схематически представлен один из epidermal growth factor (EGF) доменов. Сахара (окрашенные символы) добавляются последовательно с помощью отдельных glycosyltransferases. a | В Chinese hamster ovary (CHO) клетках, O-fucose тетрасахариды идентифицируются на EGF доменов Notch и их лигандов. b | В CHO клетках O-glucose трисахарид выявляется в Notch. The structure is presumed to be the same as identified previously on coagulation factor IX

    Notch рецепторы являются гликопротеинами, которые модифицируются ещё в аппарате Гольджи с помощью добавления fucose к специфическим серину и треонину в их Epidermal Growth Factor (EGF)-подобных повторах (Рис. 2, 4). O-фукозилирование Notch катализируется геном Ofut1. Потеря функции гена Ofut1 воспроизводит потерю активности Notch и у мух и мышей. Dl и Ser/Jagged также, по-видимому, синтезируются как гликопротеины и модифицируются с помощью O-фукозилирования своих EGF-повторов. Однако, генетический анализ у дрозофилы показал, что Notch является ключевой мишенью для Ofut1.
    Множественные O-fucosyl гликаны модифицированного Notch могут быть вовлечены в связывание с низким сродством с лектинами, т.е. белками, которые соединяются с остатками сахаров без дальнейшей их модификации. Т.к. экспрессия Ofut1, по-видимому, регулируется онтогенетически, а избыточная экспрессия Ofut1 блокирует передачу сигналов рецептора Notch, то O-фукозилирование может быть использовано в качестве регуляторного механизма для контроля взаимодействия Notch с лигандом. Согласуются с этой гипотезой и мутации, которые вносят новый сайт O-фукозилирования в EGF повтор 14 и вызывают эктопическую активацию Notch в фоторецепторных R8 клетках-предшественниках, подтверждая, что паттерн фукозилирования Notch м. влиять на способность Notch отвечать на лиганд Dl клеточно-специфическим способом.




    Рис. 5. Путь передачи сигналов Notch регулируется на множественных уровнях во время своей активации. Notch рецептор расщепляется с помощью furin-подобной протеазы в Гольджи и транспортируется на клеточную поверхность в виде гетеродимера. Он также гликозилируется в аппарате Гольджи с помощью Fringe (1). Оказавшись на клеточной поверхности Notch может взаимодействовать с Notch лигандами, такими как Delta или Serrate/Jigged (2). Экспрессия на поверхности лиганда Delta м. регулироваться с помощью Neuralized. После связывания лиганда Notch расщепляется с помощью ADAM metalloprotease и Presinilin/γ-secretase давая свободный Notch внутриклеточный домен (3). NICD м.б. убиквитинирован с помощью Numb/Itch, что регулирует его количество и внутриклеточную локализацию. NICD инициирует свои нижестоящие эффекты, мигрируя в ядро и соединяясь с RTGGGAA элементами (4). The nuclear MINT. EGF; Epidermal Growth Factor like repeats; DSL: Delta/ Scrrate/Lag-2 domain; LNR: Cysteine rich Lin-1/ Notch repeats; ANK; Ankyrin/CDC10 repeats.

    Далее Notch гликозилируется с помощью β-1,3-N-acetyl-glucosaminyl (GlcNac) трансферазы Fringe (известны 3 гена)(Рис. 5). Fringe физически взаимодействует с Notch и модифицирует О-сцепленную фукозу на специфических EGF-повторах Notch, включая EGF-повтор 12 (EGF12), который участвует в связывании лиганда. На культивируемых клетках показано, что модификация Notch с помощью Fringe увеличивает сродство Notch к лиганду Dl и снижает его сродство к лиганду Ser. Биологическое значение гликозилирования EGF12 было изучено с помощью мутирования EGF12 серинового остатка, к которому обычно присоединяется O-fucose, так что он не м.б. модифицирован ни с помощью Ofut1, ни Fringe. Функциональный анализ таких мутантных форм Notch показал, что O-фукозилирование EGF12 является важным для зависимого от Fringe подавления взаимодействий Notch-Ser, указывая тем самым, что EGF12 является ключевой мишенью для Fringe. Напротив, Fringe-обусловленное усиление взаимодействий Notch-Dl, по-видимому, осуществляется с помощью др. EGF повторов. Всё это указывает на то, что лиганды Dl и Ser обладают лектин-подобными свойствами, с помощью которых они соединяются с гликозилированным Notch с разным сродством в зависимости от степени и природы модификаций сахаров, которые несёт Notch.
    Др. модель, которая не исключает предыдущую, предполагает, что Fringe не модулирует сродство взаимодействия лиганд-рецептор. Вместо этого модулируется способность лигандов Dl и Ser активировать Notch, Fringe в этом случае должен регулировать способность Dl и Ser ингибировать Notch in cis положении (когда лиганды действуют клеточно автономно в воспринимающей сигналы клетке, блокируя сигнальную активность Notch). Эта модель предполагает, что Fringe противодействует образованию комплексов рецептор-лиганд в Гольджи и тем самым предупреждает появление цис-ингибирования Notch.
    Эта модель подтверждается двумя наблюдениями. Во-первых, трансфекция увеличивающая уровни у млекопитающих Lunatic Fringe, снижает количество рецептор-лиганд комплексов в культивируемых клетках млекопитающих. Во-вторых, многие О-фукозные сайты, которые могут удлиняться с помощью Fringe, картируются в EGF-повторах, которые мутантны в специфическом классе Notch мутаций, наз. Abruptex (Ax) (Рис.1). Интересно, что Ах мутантные рецепторы ведут себя как гиперактивируемые формы Notch, которые, по-видимому, не чувствительны более к цис-ингибированию с помощью Dl и Ser.
    Fringe-модулируемое распределение передач сигналов Notch является критическим для образования онтогенетических границ в крыльях, глазах, конечностях Drosophila, конечностях zona limitans intrathalamica (zii) циплят, сомитах позвоночных и м. осуществлять сходную роль в др. тканях, таких как зандний мозг. Fringe важны и для др. Notch-зависимых процессов, для экспрессии осцилирующих генов в качестве "сегментационных часов" во время сомитогенеза.

    3. Передача Сигналов посредством Регулируемого Внутримембранного Протеолиза (RIP)


    После соединения с лигандом Notch рецепторы подвергаются последовательным протеолитическим расщеплениям, в результате которых отщепляется Notch Intra-Cellular Domain (NICD), активная форма рецептора Notch (Рис. 3).
    Лигандом индуцировнная активация Notch делает NTM (Notch трансмембранный домен) чувствительным к расщеплению по S2 сайту с помощью внеклеточной протеазы семейства ADAM/TACE/Kuzbanian. Расщепление по S2 высвобождает эктодомен Notch и генерирует активированную связанную с мембраной форму Notch, наз. Notch Extracellular Truncation (NEXT). NEXT подвергается дальнейшему процессингу по двум внутримембранным сайтам, S3 и S4 (Рис. 1,3) Эти два расщепления катализируются γ-секретазной активностью Presenili-Nicastrin-Aph1-Pen2 белковым комплексом. Процессинг NEXT высвобождает NICD внутрь клетки и небольшой Nβ пептид вне клетки. Судьба последнего неизвестна.
    Передача сигналов посредством Regulated Intramembrane proteolysis (RIP) является необычным способом передачи сигналов для целого ряда неродственных белков, таких как SREBP, APP и N-Cadherin.




    Рис. 6 γ-secretase и его роль во внутримембранном протеолизе Notch и amyloid precursor protein (АРР). a | В ответ на соединение с лигандом Notch рецептор подвергается удалению эктодомена с помощью расщепления металлопротеиназой по сайту S2. Это сопровождается γ-secretase-обусловленным расщеплением вблизи цитоплазматического конца трансмембранного домена (NTMD; S3), которое высвобождает Notch intracellular domain (NICD). Notch кроме того расщепляется по средине своего трансмембранного домена TMD (S4), в результате чего высвобождается Nβ фрагмент . b | Схематическое представление компонентов γ-secretase комплекса. Presenilin, который подвергается эндопротеолизу во время своего созревания содержит каталитические остатки aspartyl. Nicastrin, APH1 и PEN2 важны для созревания и переноса комплекса. Точная архитектура комплекса пока не определена, хотя недавние находки указывают на то, что presenilin может функционировать в качестве димера. Хотя исследования показывают, что эти 4 белка являются достаточными для генерации активного энзима, однако реконструкция протеазной активности с использованием очищенных белков не было достигнуто. c | Эктодомен amyloid precursor protein (APP) первоначально удаляется с помощью α-secretase- или β-secretase-обусловленного расщепления, а последующее расщепление некоторых поддающихся расщеплению связей осуществляется с помощью γ-secretase в средине трансмембранного домена TMD (на Рис. показано только одно место расщепления), высвобождающего P3 или амилоидогенный Aβ пептиды, соответсвенно. Aβ пептиды (которые являются Aβ40 и Aβ42) отличаются др. от др. по композиции своего С-конца. γ-Secretase расщепляет также вблизи цитоплазматического конца TMD по сайту, известному как S3-подобному или ε, и тем самым высвобождает APP ICD (внутриклеточный домен).

    Во-первых, протеолитическое расщепление является необратимым, поэтому интенсивность и продолжительность передачи сигналов не м. регулироваться с помощью рецепторной десенсибилизации. Во-вторых, передача сигналов направленна и не связана с молекулами вторичных мессенджеров. В-третьих, процессинг рецептора высвобождает внеклеточные побочные продукты, которые м. иметь или новые сигнальные активности или действовать, подавляя передачу сигналов, напр., посредством титрации лигандов.
    γ-Secretase м. выполнять аналогичную роль в нескольких путях передачи сигналов. Она отвечает за высвобождение внутриклеточных фрагментов с потенциалом сигнальной функции из APP, ErbB4, CD44 и LRP белков, это указывает на то, что γ-secretase-обусловленное расщепление рецепторов клеточной поверхности является широко используемой стратегией передачи сигналов.

    4. Внеклеточное Отщепление Notch Лигандов Dl и Ser


    Dl и Ser являются связанными с мембранами лигандами, которые соединяются и активируют Notch рецепторы на поверхности соседних клеток. Лиганд Dl м.б. расщеплен, чтобы высвободить растворимую форму Dl extra-cellular (DlEC), которая содержит Notch связывающий домен. Функциональное значение DlEC неизвестно. У червей экспрессия секретируемых форм LAG-2 и APX-1, двух лигандов Notch рецепторов GLP-1 и LIN-12 восстанавливает lag-2 мутантные фенотипы, демонстрируя, что растворимые лиганды м. передавать сигналы. Напротив, секретируемые формы лигандов Dl и Ser, по-видимому, действуют доминантно-негативным образом у дрозофил, и расщепление Dl, как полагают, является важной ступенью в выключении Dl сигнала. Потеря (shedding) внеклеточной части лиганда Dl также даёт мембран-связанную форму, которая в будущем подвергается процессингу Presenilin-зависимым образом. Одной из возможных интерпретаций является то, что Presenilin-зависимое расщепление лигнада Dl является частью общего очищающего механизма. Альтернативно, внутриклеточные формы Dl м. регулировать новые сигнальные события, это открывает возможность двунаправленной передачи сигналов.

    5. Регуляция сигнальной активности Dl с помощью Убиквитинирования


    Критической ступенью для эффективной передачи сигналов Dl являются Drosophila neuralized (neur) и mind-bomb (mib) у рыбок данио, которые регулируют убиквитинирование. Ubiquitin является полипептидом в 76 аминокислот, который ковалентно прикрепляется к белковым субстратам с помощью многоступенчатой реакции. Ubiquitin-protein ligases (E3-ligases) распознают специфические субстраты и катализируют перенос ubiquitin на белковый субстрат. Убиквитин был впервые выявлен в качестве метки для протеолитической деградации. Установлено, что он м. служить также сигналом для эндоцитоза. Neur и Mib являются эволюционно законсервированными и структурно отличающимися Е3-лигазами. Обе физически взаимодействуют с Dl и обусловливают убиквитинирование Dl. Подтверждено, что активность Neur обусловливает перераспределение Delta из плазматической мембраны в эндоцитотические пузырьки и ведет к их деградации. Предполагается, что Neur и Mib действуют клеточно неавтономным образом, чтобы усилить сигнальную активность Dl, указывая тем самым, что эндоцитоз Dl в клетках, посылающих сигналы, способствует активации Notch в клетках, воспринимающих сигналы. Как это осуществляется всё ещё неясно. Одна из возможностей, что с помощью стимуляции эндоцитоза Delta в сигнал-посылающих (Delta-презентирующих) клетках, м. стимулировать расщепление и активацию Notch в воспринимающих клетках. Альтернативное объяснение, что Neur м. действовать в сигнал-воспринимающих (Notch-представляющих) клетках. В самом деле, Delta ингибирует активность Notch в цис-положении [10,11,12] и , следовательно, деградация Delta (запускаемая с помощью Neur) в воспринимающих клетках м. способствовать здесь активации сигнального пути.
    Mib, который имеет гомологов и у Drosophila и у млекопитающих, является E3 ubiquitin лигазой, которая влияет на Delta и обеспечивает Delta ubiquitination и его эндоцитоз в late endosomal/lysosomal компартменте. Подтверждено, что Mib не действует в воспринимающих клетках, поэтому на сегодня считается, что Mib регулирует Delta в клетках, продуцирующих сигнал.
    Т.о., возможно, что убиквитинирование Dl способствует как его сигнальной активности в сигнал-посылающих клетках (Mib), так и его деградации в сигнал-воспринимающих клетках (Neur).
    По-видимому, регулируемое накопление Neur (и/или Mib) м. вносить вклад в спецификацию того, где и когда будут передаваться сигналы Dl. Время и место активации Notch безусловно зависит от присутствия активирующих его лигандов, однако паттерн активности Notch не совпадает с широким распределением лигандов, это указывает на существование регуляторных механизмов, ограничивающих активацию Notch рецепторов.

    6. Эндоцитоз лигандов + Notch ECD в качестве позитивного эффектора передачи сигналов Notch


    Передача сигналов Notch затрагивается эндоцитозом разными способами, наиболее необычным является трансэндоцитотическое событие, при котором Notch ECD комплексуется с Delta и интернализуется с помощью лиганд-несущих клеток (Рис. 1). Предполагается, что трансцитоз Notch ECD является существенным для передачи сигналов. Во-первых, экспериментальное ингибирование dynamin, GTPase, которая выщипывает эндоцитотические пузырьки из плазматической мембраны, показало, что эндоцитоз в целом необходим для передачи сигналов Notch [5]. Во-вторых, эндоцитоз лигандов является, по-видимому, критическим,



    Рис. 7. Эндоцитоз вносит позитивный вклад в активацию пути Notch. Notch рецептор (blue) активируется с помощью Delta (orange), экспрессируемой в соседней клетке. Связывание Delta стимулирует расщепление и высвобождение Notch extracellular domain (NECD) и его transendocytosis (в Delta-презентирующую клетку). Дальнейшее расщепление высвобождает цитоплазматический фрагмент, который транслоцируется в ядро и активирует транскрипцию. Эндоцитоз Delta необходим для активации Notch, возможно путём запуска расщепления Notch. Т.о., осуществление убиквитинирования Delta и её интернали зация с помощью Mib или Neur стимулирует передачу сигналов. Напротив, cis-взаимодействие между Notch и Delta (внутри одной и той же клетки) ингибирует передачу сигналов. Т.о., в cis-положении, Neur м. вносить позитивный вклад в передачу сигналов, способствуя интернализации Delta в воспринимающей клетке, устраняя тем самым её ингибирующее влияние. Сам Notch также является предметом негативной регуляции с помощью эндоцитоза: Numb и a-adaptin способствуют Notch интернализации, предупреждая тем самым Delta от взаимодействия с Notch.

    т.к. мутатные Delta, которые не м. эндоцитозироваться не способны активировать Notch in vivo. Важность эндоцитоза лиганда для передачи сигналов Notch подтверждена изучением двух генов, которые необходимы для передачи сигналов Notch: neuralized (neur) и mind bomb (mib). Ген neur кодирует RING-finger E3 ubiquitin лигазу. Активность Neur обусловливает перераспределение Delta из плазматической мембраны в эндоцитотические пузырьки и ведет к их деградации. Как Neur-обусловленное удаление Delta ведет к активации передачи сигналов Notch неясно. Одна из возможностей, что деградация Delta (запускаемая с помощью Neur) в воспринимающих клетках м. способствовать здесь активации сигнального пути.
    У рыбок данио ubiquitin лигаза Mib функционирует очень сходным образом. Mib, который имеет гомологов и у Drosophila и у млекопитающих, является E3 ubiquitin лигазой, которая влияет на Delta и обеспечивает Delta ubiquitination и его эндоцитоз в late endosomal/lysosomal компартменте. Делеционный анализ снова подтвердил, что ubiquitination важна. Делеция цитоплазматического хвоста Delta даёт неактивные молекулы, которые накапливаются на плазматической мембране. Важно, что сигнальная активность, также как эндосомный трафик, восстанавливаются, если ubiquitin половинка добавляется in frame к этой делеции. Это предоставляет строгие доказательства, что активность Delta регулируется с помощью ubiquitination. Подтверждено, что Mib не действует в воспринимающих клетках, значит Mib регулирует Delta в клетках, продуцирующих сигнал.
    7. Регуляция Активности Notch с помощью Эндоцитоза Рецепторов


    Интернализация активных рецепторов в лизосомы, где они деградируют, является общим механизмом десенсибилизации. Идентифицировали домен в 15 аминокислот в цитозольном хвосте Notch, который необходим для Ras-обусловленного подавления рецепторов. Внутри этой короткой аминокислотной последовательности расположен предполагаемый dileucine мотив интернализации Down-regulation Targetind Signal (DTS), а мутация в этом мотиве предупреждает интернализацию и деградацию Notch. Эндоцитоз Notch, по-видимому, законсервирован. Передача сигналов Ras модулирует передачу сигналов Notch с помощью контроля его деградации посредством эндоцитотического пути. Однако, на Drosophila подтверждено, что ubiquitination также м. использоваться. Дело в том, что suppressor of deltex [Su(dx)], ген, как известно, необходимый для подавления передачи сигналов Notch, кодирует ubiquitin лигазу. Это подтверждает, что ubiquitination Notch, осуществляемое с помощью Su(dx), м. ингибировать передачу сигналов в результате направления Notch на лизосомную и протеосомную деградацию. Гомолог Su(dx) у мышей, Itchy, м. убиквитинировать Notch. Itch содержит С2-типа фосфолипид связывающий мотив, который, возможно, направляет Itch в плазматическую мембрану, 4 WW-мотива участвуют во взаимодействии с внутриклеточным доменом Notch, а домен НЕСТ с Е3 ubiquitin ligase активностью. В клетках млекопитающих Itch взаимодействует с формой Notch, сходной с NEXT (т.е. Notch без эктодеомена) и способствует её убиквитинации. Itch ведет себя скорее всего подобно Su(dx) как негативный регулятор передачи сигналов Notch, т.е. Itch подавляет Notch. Ген dx кодирует RING finger белок, который локализуется в кортексе клетки, соединяется с внутриклеточным доменом Notch и действует как позитивный регулятор Notch.
    Эндоцитоз рецепторов м. также позитивно регулировать сигнальную трансдукцию. Напр., эндоцитоз м. приносить активные рецепторы в специфический внутриклеточный компартмент, где они будут ассоциировать с его сигнал-передающей кухней. Анализ гена дрозофилы shibire (shi), который кодирует GTPase, участвующую в выщеплении эндоцитотических пузырьков, играет, возможно, роль в передаче сигналов Notch рецепторам. ts shi мутанты обладают Notch-подобным фенотипом. Активность shi необходима и сигнал-посылающим и сигнал-получающим клеткам. Т.к. NICD является активным на мутантном shi фоне, то предполагается, что эндоцитоз м. переносить NEXT (т.е. Notch без эктодеомена) от плазматической мембраны во внутриклеточный компартмент, который обладает γ-секретазной активностью.

    8. Регуляция Передачи Сигналов Notch с помощью Numb и Sanpodo


    Дальнейшие доказательства регуляторной роли эндоцитоза в передаче сигналов Notch получены после выделения специфичного мутантного аллеля гена α-adaptin. α-adaptin является одной из 4-х субъединиц эндоцитотичского АР-2 комплекса. Мутации, которые специфически делетируют или инактивируют функцию ear-домена α-adaptin дрозофилы дают фенотип щетинок, который ассоциируется с гиперактивацией передачи сигналов Notch рецептора. Белок Numb ко-локализуется с эндоцитотическими пузырьками в культивируемых клетках млекопитающих и непосредственно связывается с внутриклеточным доменом Notch, а также с ear доменом α-adaptin. Эти наблюдения привели к модели, согласно которой Numb действует как адаптор между α-adaptin и его Notch грузом и тем самым способствует подавлению Notch за счёт его интернализации. По-видимому, Numb влияет только на доступность Notch для лигандов, но не на его стабильность, т.е. не меняет его количества в клетке. McGill and McGlade показали, что Numb соединяется с E3 ubiquitin ligase Itchy, и способствует ubiquitination как Notch полной длины, так и внутриклеточного домена Notch (после отщепления). В то время как последнее событие ubiquitination ведет к протеосомами-обеспечиваемой деградации фрагмента Notch, первое, по-видимому, не вызывает подавления рецепторов.
    Недавний анализ гена Drosophila sanpodo (spdo) указал на альтернативную модель того, как Numb м. действовать. Spdo является 4 раза пронизывающим мембрану белком, необходимым для передачи сигналов Notch. Генетический анализ показал, что Spdo действует иерархически ниже лиганда Dl и полной длины Notch, но выше NICD. Эксперименты на дрозофиле подтверждают модель, согласно которой Spdo позитивно регулирует передачу сигналов Notch, запуская эндоцитоз Spdo.

    9. Передача Сигнального Notch Внутриклеточного Домена в ядро


    После своего высвобождения из рецептора NICD транслоцируется в ядро. Механизмы транспортировки NICD в ядро неизвестны, хотя как показано выше этот процесс может обеспечиваться геном sanpodo (spdo). Обычно белок, чтобы проникнуть в ядро должен обладать специфическими последовательностями NLS (nuclear link signal). Драматические последствия, вызываемые форсированной экспрессией NICD, указывают на то, что Notch сигнальная активность м. тонко регулироваться и на этом этапе, напр., экспрессия активированной версии Notch1 человека в Т клетках вызывает острую лимфобластому, а эктопическая экспрессия NICD блокирует ранний нейрогенез у эмбрионов мух и позвоночных.

    10. Выключение передачи сигналов с помощью Регулируемой Деградации NICD


    Др. важным аспектом регуляции активности NICD является её подавление с помощью убиквитин-протеасомного пути. О роли в этом процессе гена Numb говорилось выше. Первые указания на этот регуляторный процесс были получены в результате идентификации sel-10 в качестве негативного регулятора семейства Notch рецептора LIN-12 у C.elegans. Sel-10 является Cdc4-родственным белком. содержащим F-бокс и 7 WD повторов. По аналогии с Cdc4p было предположено, что Sel-10 рекрутирует мультибелковый комплекс SCF, который обладает активностью убиквитин лигазы Е3. Функциональный анализ Sel-10 млекопитающих строго подтверждает эту модель. В самом деле, Sel-10 связывает NICD посредством WD повторов и вместе с тремя др. компонентами комплекса SCF, обеспечивает убиквитинирование и деградацию с помощью протеосом. Подтверждено, что и у дрозофилы NICD м. подвергаеться протеасомной деградации. Быстрая деградация NICD в ядре м. объяснить, почему его невозможно обнаружить в ядре. Является ли негативная регуляция с помощью Sel-10 конституитивной или он сам является субъектом онтогенетической регуляции пока неизвестно.

    11. Передача Сигналов посредством CSL


    NICD действует в очень низких концентрациях, не обнаружимых иммуно-детекцией. В ядре NICD собирается в четвертичный комплекс с CSL (human CBF1, fly Supressor of Hairless, worm Lag-1) ДНК-связывающим белком и с Mastermind (MAM)/Lag-3 ко-активатором. Этот комплекс соединяется со специфическими регуляторными последовательностями ДНК и активирует экспрессию CSL/Notch генов-мишеней. В отсутствие NICD CSL м. рекрутировать репрессорные комплексы на цис-регуляторную область CSL/Notch генов-мишеней (Рис.1, 3, 8). Установлено, что гены Deltex и SHARP/MINT, предопределяют, будет ли CSL активировать или репрессировать транскрипцию генов-эффекторов.
    Когда NICD вступает в ядро, то он соединяется с CSL, устраняет корепрессоры и рекрутирует транскрипционные коактиваторы, которые индуцируют экспрессию членов семейств генов Hairy-Enhancer of Split (HES) и Hes-related proteins (HERP).Предполагается, что одним из подобных коактиваторов, участвующих в активации экспрессиию HES, могут быть члены семейства CCN, В частности CCN3 (Katsube,Sakamoto, 2005). HES/HERP белки являются basic helix-loop-helix (bHLH) ДНК--связывающими белками, которые ингибируют экспрессию и/или функцию клон-специфицирующих bHLH генов, таких как MASH-1 (нейрогенез), MyoD (миогенез) и E2A (B лимфопоэз). Хотя CSL/HES путь обеспечивает многие аспекты передачи сигналов Notch, однако, недавние данные указывают на то, что в некоторых системах оперируют также CSL-независимые пути.




    Рис. 8. Notch активация нижестоящих сигнальных событий. Транскрипционные ко-репрессоры соединены с CSL в отсутствие Notch, что вдет к репрессии нижестоящих мишеней (1). Высвобождение Notch внутриклеточного домена NICD, мигрирующего в ядро воспринимающей клетки (2). NICD вытесняет ко-репрессорный комплекс (CoR) из CSL и рекрутирует ко-активаторный комплекс (CoA)(3). Транскрипция нижестоящий мишеней, таких как HES, ингибирует транскрипцию и/или функцию других Helix-Loop-Helix белков, таких как Mash-1, E2A и Myo-D (4)

    Неизвестно, конкурирует ли NICD с репрессорным комплексом за соединение с CSL, уже связанным с ДНК, или Mam-NICD-CSL комплексы конкурируют с CSL-ко-репрессорными комплексами за связывание ДНК. Т.к. CSL рекрутируют разные ко-репрессорные комплексы, то должны действовать разные механизмы. Более того структура хроматина и/или доступность ко-факторов также м. регулировать это переключение.

    Млекопитающие имеют 4 гена, кодирующие Notch рецепторы (N1-N4). Передача сигналов Notch рецепторами используется для разных онтогенетических решений с разными исходами в зависимости от клеточного контекста. Т.о., разные Notch/CSL мишени экспрессируются в разных клетках после стимуляции лигандом. Это указывает на то, что транскрипционная реакция на активацию Notch тонко регулируются и подтверждает, что избирательная реакция генома на активацию Notch м. составлять основную регуляторную ступень в передаче сигналов Notch рецепторов.

    12. Signaling Cross-talk


    Передача сигналов с помощью RIP, когда одна и та же молекула интегрирует в себе функцию восприятия сигналов на клеточной поверхности и регуляции генов в ядре, как полагают, д. снижать возможность регуляторного взаимного общения между путём Notch и др. сигнальными путями в цитоплазме. Тем не менее такие взаимно-регуляторные взаимодействия происходят с другими генами, не входящими в Notch-сигнальный путь.
    Продемонстрировано, что, напр., phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) путь позитивно регулирет передачу сигналов Notch в T клетках и нейронах (McKenzie et al., 2004). Данные по нокауту PI3K указывают на то, что, по крайней мере, иммунологические фенотипы таких мышей м.б. связаны с неправильной регуляцией путей Notch.
    Установлено (Abe et al., 2004), что activin A индуцирует экспрессию Delta-1, Delta-2 и Notch и тем самым активирует передачу сигналов Notch. Activin A, член семейства TGF-β, обладает сильной мезодерм-индуцирующей активностью и м. индуцировать широкий спектр мезодермальных генов и тканей из проспективных эктодермальных клеток амфибий (анимальной шапочки) зависимым от концентрации способом. Передача сигналов Notch участвует во многих онтогенетических процессах и регулирует решения клеточной судьбы путём локальных межклеточных сообщений. Передача сигналов Notch поддерживает клетки предшественники в недифференцированном состоянии и позволяет клеткам внутри мультипотентных предшественников достигать специфической судьбы во время развития. Области экспрессии членов пути передачи сигналов Notch, по-видимому, перекрываются с областью, где передача активин-подобных сигналов индуцирует мезодерму. Авт. продемонстрировали, что активин А м. индуцировать гены Notch-сигнального пути зависимым от концентрации способом и м. активировать передачу сигналов Notch в анимальной шапочке. Также in vivo активин-подобные сигналы контролируют экспрессию Delta-1 и Delta-2. Боле того было показано, что активин А индуцирует Delta-1 и Delta-2 и Notch с помощью разных каскадов. Так, было показано, что MyoD м. индуцировать Delta-1, но не экспрессию Delta-2 и Notch. Напротив, MyoD ингибирует экспрессию Delta-2 в анимальных шапочках in vivo . Активин А м. индуцировать и некоторые др. белки помимо MyoD, которые, по-видимому , и индуцируют Delta-2 и Notch (Рис.9)

    Рис. 9. Предполагаемая модель активации передачи сигналов Notch, индуцируемая с помощью активина А

    Сходным образом анализ роли передачи сигналов EGFR при дифференцировке фоторецепторов у дрозофилы выявил, что активация EGFR облегчает репрессию экспрессии гена Dl с помощью комплекса, формируемого Su(H) и ко-репрессора SMRTER. Эта де-репрессия нуждается в Strawberry notch (Sno) и Ebi, F-box/WD40 доменовом белке, оба они физически взаимодействуют с Su(H)-SMRTER репрессорным комплексом. Т.о., активация EGFR заставляет Ebi находить ещё неизвестный компонент Su(H)-SMRTER репрессорного комплекса для обеспечиваемой протеосомами деградации. Дифференцировка клеток-предшественниц сенсорных макрохет мезоторакса связана с антогонистическими отношениями между EGFR- и Notch-сигнальными путями (Culi et al., 2001).
    Данные генетических экспериментов у D. melanogaster позволяют предполагать влияние генов wingless и Notch на функции друг друга. Недавние биохимические эксперименты доказали наличие прямого физического контакта между Wingless и Notch, не приводящее к расщеплению молекулы Notch. Кроме того, Notch взаимодействует с Dishevelled, участником Wg-каскада (Axelrod et al., 1996). Интересно, что внутриклеточный домен Notch может образовывать белковый комплекс не только с Su(H), но и с другими регуляторами транскрипции, такими как ацетилазы гистонов (Klein et al., 2000).
    Уже отмечалось выше, что разные сигналы м.б. интегрированы на уровне эндоцитоза Notch. У C.elegans семейства Notch рецептор LIN-12 подавляется в одной из 6 клеток, предшественников вульвы, Р6.р, вследствие передачи сигналов Ras.
    В-третьих, стабильность NICD, по-видимому, регулируется с помощью фосфорилирования. GSK3β фосфорилирует NICD in vitro, а ингибирование GSK3β снижает стабильность NICD и редуцирует передачу сигналов Notch рецепторов. Т.о., GSK3β-обусловленное фосфорилирование, по-видимому, стабилизирует NICD и потенциирует его активность.
    Наконец, перекрёстная регуляция с др. сигнальными путями м. направлять на цель Notch регуляторы. Напр., Numb у мышей подавляется с помощью двух Е3 убиквитиновых лигаз, Sina и LNX, т.о. возникает возможность того, что стабильность Numb м. регулироваться сигналами.
    Приобретение нейрального статуса предшественниками нейронов в глазном имагинальном диске происходит под контролем и при взаимодействии передающих каскадов Hh и Notch. Белок Notch выступает в роли регулятора негативных репрессоров транскрипционного фактора Atonal, зависящего опосредовано от Hh-пути через секретируемый белок Dpp из семейства TGF-β (Baonza, Freeman, 2001). Координированные взаимодействия систем, образующих сигнальную сеть, являются основой согласованной регуляции функционирования генома живых организмов.

    13. CSL-Независимая Передача Сигналов


    Исследования у беспозвоночных и позвоночных указывают на существование также CSL-независимых сигнальных активностей. Лучше всего документирован случай с новыми аллелями NotchMcd. Эти аллели вызывают доминантную потерю SOPs. Этот фенотип противоположен фенотипу потери функции Notch или Su(H). Однако, эти мутантные аллели являются не просто аллелями с избыточной функцией. В самом деле, NotchMcd;Su(H) двойные мутанты, по-видимому, развиваются как NotchMcd клетки, указывая тем самым, что NotchMcd мутантный белок обладает новой активностью, которая не зависит от Su(H). Это указывает на о, что NotchMcd рецепторы передают сигналы независимо от CSL. 6 из 7 NotchMcd аллелей кодируют С-терминально укороченные рецепторы. Предположительно эта область связывает Dishevelled (Dsh), ассоциированный с мембраной белок, необходимый для передачи сигналов Wnt (Рис. 2). Т.к., путь, активируемый с помощью этих укороченных рецепторов недостаточно изучен, но молекулярные и генетические данные взаимодействий указывают на то, что мутантные NotchMcd белки избегают ингибирования с помощью Dsh. Т.о., эти данные открывают возможность, что дикого типа Notch рецепторы м. передавать сигналы CSL-независимым, но Dsh-регулируемым способом.
    Возможной функцией этой новой ветви пути Notch является регуляция динамики актина во время дорсального закрытия у эмбриона. Дорсальное закрытие является сложным морфогенетическим процессом, который использует передачу сигналов Notch, Вmр и Jun N-terminal Kinase (JNK). В соответствии с CSL-независимой функцией Notch в этом процессе экспрессия укороченных конструкций указывает на то, что Notch действует CSL-независимым способом, модулируя JNK сигнальную активность в наиболее дорсальных клетках эпидермиса.

    14. Индуктивная и латеральная передача сигналов


    Два самостоятельных типа клеточных взаимодействий м. индуцировать передачу сигналов Notch: индуктивную и латеральную передачу сигналов Индуктивная передача сигналов происходит, когда Notch рецептор и лиганд экспрессируются на двух разных типах клеток, так что Notch м. активироваться только в клетках предшественниках, несущих рецепторы. Латаральная передача сигналов происходит, когда два эквивалентных предшественника исходно экспрессируют и рецептор и лиганд, позволяя каждому предшественнику и посылать и получать Notch сигналы. Однако, стохастические вариации или внутренне присущие различия случайно м. вызывать превалирование экспрессии рецепторов в одном типе клеток и превалирование экспрессии лиганда в др. Эта асимметрия усиливается с помощью негативной петли обратной связи, чтобы гарантировать, что одна клетка будет активировать Notch в соседней и что обе клетки воспримут разные клеточные судьбы. Эти два способа м. продемонстрировать на сосудистых клетках.



    Рис. 10. A. Детерминация судьбы клеток: это видно на примере артериальной или венозной дифференцировки.

    B: Клеточная поддержка: взаимное общение между соседними сосудистыми клетками необходимо для поддержания жизнеспособности клеток.

    . ПРОЦЕССЫ, В КОТОРЫХ УЧАСТВУЕТ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА NOTCH


    . Notch регулирует самообновление и выбор клеточных клонов во многих тканях


    Notch рецепторы и лиганды широко экспрессируются во время органогенеза у эмбрионов млекопитающих и передачи сигналов Notch регулируют клеточно-клональные решения в тканях, происходящих из всех 3-х первичных зародышевых листков: энтодермы (поджелудочная железа), мезодермы (склет, молочные железы, васкулатура, гематопоэтические клетки) и эктодерма (нейрональные клоны). Некоторые развивающиеся ткани экспрессируют несколько разных рецепторов и лигандов, тогда как др. экспрессируют одиночную пару рецептор-лиганд. Хотя некоторы Notch рецепторы, по-видимомому, выполняют генетически перекрывающиеся функции в определенных онтогенетических контекстах (напр., N1 и N4 в васкулогенезе), др. обладают уникальными и существенными функциями, выявляемые по тяжелым нарушениям эмбриогенеза в результате мутаций потери функции (Табл. 1). Notch функционируют в развитии многих тканей и клеточных клонов. Передача сигналов Notch поддерживает клетки предшественники в недифференцированном состоянии и позволяет клеткам внутри мультипотентных предшественников достигать специфической судьбы во время развития. Более того, передача сигналов Notch регулирует цитодифференцировку миогенеза, пронефрических протоков, пронефрических канальцев, панкреатических клеток и сердца (Apelqvist et al., 1999; Delfini et al., 2000; McCrught et al., 2001; McLaughlin et al., 2000; Nofziger et al., 1990; Rones et al., 2000).

    1. Детерминация Энтодермы


    Уже на самых ранних стадиях эмбрионегенза передача сигналов Notch м. влиять на принятие решения клеток стать энтодермой, возможно за счёт отделения их от мезодермы. Не исключена возможность, что передача сигналов Notch регулирует временной паттерн экспрессии bon, который функционирует выше sox17 и foxA2. Полученные данные показывают, что преждевременное активирование сигналов Notch ведет к преждевременному снижению экспрессии bon и последующему снижению количества энтодермальных клеток (Kikuchi уе al., 2004). И как показывает дальнейшее уменьшение энтодермальных клеток у мутантов bon, которым инъецируется NICD, что сигналы Notch также м. регулировать образование энтодермы и другим bon-независимым способом.

    2. Васкулогенез


    Во время ранних стадий развития сосудов предшественники эндотелиальных клеток дифференцируются и сливаются в сеть гомогенного размера примитивные кровеносные сосуды в процессе васкулогенеза. Более позднее развитие связано со сложным процессом ремодлирования и очистки, с пролиферацией, ветвлением и удалением лишних из вновь образованных сосудов в процессе ангиогенеза. N1 и N4 экспрессируются в эндотелиальных клетках в эмбриональной васкулатуре и, по-видимому, обладают частичной функциональной перекрываемостью. В то время как N4-/- мыши являются нормальными, N1-/- или N1/N4 двойные мутантные эмбрионы обнаруживают тяжёлые дефекты ангиогенного васкулярного ремоделирования (Табл.1). Сходный васкулярный фенотип наблюдается и когда N4ICD экспрессируется у эмбрионов мыши, указывая тем самым, что соотв. уровни передачи сигналов Notch являются критическими для собственно развития эмбриональных сосудов. Notch лиганд Dll-1 и Jag-1 регулируют передачу сигналов Notch в этом контексте, т.к. неспособность экспрессировать эти лиганды во время эмбриогенеза мыши вызывает гемморагии и дефекты ремоделирования сосудов.
    Более того, как было продемонстрировано на предыдущем рисунке сигнальная система Notch участвует в выборе дифференцировки сосудов в направлении артерии или вены, а также в поддержании жизнеспособности сосудистых эндотелиальных клеток.

    3. Гематопоэз и развитие лимфоцитов


    Notch рецепторы и лиганды широко экспрессируются в гемтопоэтических тканях и органах. Известно, что передача сигналов Notch играет важную роль на некоторых стадиях гематопоэза (Рис. ).


    Рис. 11. Notch-1 влияет на развитие лимфоцитов на множественных стадиях развития костного мозга и тимуса. Условный нокаут Notch-1 делает возможным развитие эритроидных, миэлоидных и В клеток, но блокирует раннее развитие Т клеток в BM. Pear et al. использовали NICD в BM клетках, чтобы блокировать развитие В клеток и продукцию Т клеток в BM. Выявлена существенная функция Notch-1 в супрессии развития В клеток ы имусе.

    Напр., искусственно вызванная активация передачи сигналов N1 в hematopoietic stem cells (HSC) м. повышать их способности к самообновлению и супрессировать их дифференцировку в миэлоидные, эритроидные или лимфоидные клоны (32-36). Однако, условные делеции N1 в гематопоэтических стволовых клетках и/или в очень ранних гематопоэтических предшественниках постнатально, по-видимому, не влияют на поддержание стволовых клеток in vivo . Тем не менее, исследования N1-дефицитных эмбрионов мыши показали, что N1 необходим для генерации самих гематопоэтических стволовых клеток из гематогенных эндотелиальных клеток во время инициальной стадии дефинитивного гематопоэза в эмбриональной параортальной splanchnopleura. Насколько N1 является критическим для генеза гематопэтических стволовых клеток, настолько же он кажется ненужным для их дальнейшего поддержания. Пока неясно, насколько заключения, полученные в этих исследованиях, отражают различия функций N1 в генерации и поддержании плодных и взрослых гематопоэтических стволовых клеток. Однако, важно отметить, что исследования по идентификации роли N1 в поддержании гематопоэтических стволовых клеток связаны со сверх-физиологической активацией Notch пути или посредством лигандом обусловленной стимуляции или посредством экспрессии постоянно активного N1ICD; хотя они м.б. не аккуратными индикаторами физиологической роли Notch в самообновлении гематопоэтических стволовых клеток.
    Затем Notch сигналы влияют на выбор клеточной судьбы на ряде стадий развития лимфоцитов. Хотя Т лимфоциты развиваются в тимусе, а В клетки в костном мозге, оба клона, как полагают, возникают из общего лимфоидного предшественника (LP), генерируемого в костном мозге (по крайней мере у взрослых мышей). Условное удаление N1 из гематопэтических стволовых клеток и лимфоидных предшественников (HSC/LP) полностью блокирует Т-клеточное развитие на самых ранних стадиях, тогда как конституитивно активный N1ICD предупреждает лимфоидные предшественники от генерации В лимфоцитов. Необходимо почеркнуть важную функцию N1 в этом выборе клеточной судьбы, которая гарантирует, что Т и В клетки будут разиваться в разных тканях, т.к. лимфоидные предшественники, экспрессирующие N1ICD эктопически генерируют Т-клеточные клоны в костном мозге, тогда как N1-дефицитные лимфоидные предшественники эктопически продуцируют В клетки в тимусе. Т.о., активация N1 д.б. соотв. регулируема, чтобы гарантировать, что лимфоидные предшественники будут генрировать В клетки в костном мозге, а Т клетки в тимусе, но как это достигается не ясно. Модуляторы Notch, такие как Deltex и Lunate Fringe м. в этом участвовать, т.к. они м. заставлять лимфоидные предшественники адаптировать судьбу В клеток в тимусе.
    N1 регулирует также поздние стадии Т-клеточного развития в тимусе тогда как N2 регулирует созревание В клеток в селезенке. Наиболее незрелые тимоциты являются CD4 и CD8 двойными негативами (DN) и эти предшественники, которые имеют in-frame перестройки локуса T-cell receptor (TCR)-β воспринимают пре-TCR сигналы, которые заставлют их экстенсивно пролиферировать и созревать в CD4/CD8 двойные позитивы (DP) промежуточной стадии. Большинство DP тимоцитов погибает, но те, которые экспрессируют αβ-TCR комплекс с сотв. лиганд-специфичностью позитисно отбираются для созревания в CD4+ или CD8+ T клетки. Активация N1 критически регулирует или экспрессию или функцию пре-TCR, а культура пре-TCR-экспрессирующих тимоцитов с Dll-1-экспрессирующими клетками индуцирует их пролиферацию и созревание in vitro. Хотя N1 не существенен для CD4 или CD8 Т-клеточного развития, ряд исследований подтверждает роль N1 в предопределении СВ4-/CD8-клонов и в созревании/выживании CD4 и CD8 клеток. Большинство Notch лигандов экспрессируется в тимусе, но какие из них существенны для Т-клеточного предопределения и созревания неизвестно.
    Notch лиганды (которые необходимы для активации Notch) экспрессируются только thymic epithelial cells (TECs), но не лимфоидными предшественникаи из тимуса или печени. Это указывает на то, что активация и поддержание передачи сигналов Notch и функция во время развтия тимоцитов зависят от вcтупления лимфоидных предшественников в тимус и их взаимодействия с Notch лигандами, экспрессируемыми TECs. IL-7R<α+ лимфоидные предшественники из околотимусной мезенхимы (которые еще не контактирует с эпителием тимуса) экспрессируют Notch1 и Dtx1, но не Hes1 или pTα (компонент pre-T-клеточных рецепторов), тогда как лимфоидные предшественники, полученные из областей тимусного эпителия, экспрессировали все эти гены.
    Сходная ситуация имеет место в селезенке. Ген Mint стого ингибирует CSL-обусловленную активацию транскрипции, индуцируемую Notch1, 2, 3 и 4, но Mint обладает ограниченным паттерном экспрессии, это указывает на то, что он м.б. вовлечен в ткане-специфическую регуляцию активности Notch. Установлено, что Mint не является важным для выбора между клонами Т- и В-клеток. Однако, в селезенке Mint регулирует решение предшественников В клеток дифференцироваться в marginal-zone или фолликулярные В клетки, этот КПП (checkpoint) как известно, связан с передачей сигналов Notch–CSL (Kuroda, K. et al., 2003). Наблюдение, что Notch2-экспрессирующие клетки располагаются вдоль наружного края маргинальной зоны, позволило им предположить, что это м.б. транзитные В клетки, ожидающие предопределения своей судьбы путем взаимодействий с клетками, несущими Notch-лиганды, такими как дендритные клетки.

    4. Иммунитет


    Нарушения передачи сигналов phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) связаны с многочисленными болезненными состояниями: в иммунной системе они приводят к аутоиммунности и раку. McKenzie et al., (2004)) установили, что фармакологическая блокада PI3K в Jurkat и в первичных CD4+ T клетках человека вызывает дозово-зависимое ингибирование передачи сигналов Notch. Восстановление PTEN в Jurkat T-клетках устраняет Notch чувствительность. Сходным образом в первичных нейронах гиппокампа крыс активация PI3K пути с помощью цитокина BDNF усиливает передачу сигналов Notch посредством Wortmannin-чувствительного механизма, тогда как избыточная экспрессия PTEN устраняет BDNF-индуцируемые Notch сигналы. Эти данные указывают на то, что PI3K путь выполняет важную функцию регулятора Notch-responsiveness в самых разных типах клеток. Интригующие данные по нокауту PI3K указывают на то, что, по крайней мере, иммунологические фенотипы этих мышей м.б. связаны с неправильной регуляцией путей Notch.

    5. Нейрогенез


    Notch белки чрезвычайно важные рецепторы в нервной системе. У млекопитающих активация Notch обязательна in vivo для поддержания (само-обновления) нейральных стволовых клеток, которые являются предшественниками всех нейральных и глиальных клеток в нервной системе млекопитающих. В нервной трубке формирующиеся нейроны экспрессируют DSL лиганды и ингибируют популяции Notch-экспрессирующих предшественников. Гомозиготное разрушение N1 или CSL у мышей нарушает само-обновление нейральных стволовых клеток и этим способствуют дифференцировке нейрональных и астроглиальных клонов. Одним из действующих механизмов м.б. HES-зависимая репрессия MASH-1, bHLH транскрипционного фактора, необходимого для нейрогенеза. Показано, что разные кДНК эмбрионов кур, кодирующие членов семейства Hairy-Enhancer-of-Split (Hes), активируются с помощью Notch и образуют динамические обменивающиеся между собой петли экспрессии Hes expression и что эти гены, по-видмому, являются каноническими Notch мишенями и эффекторами.



    Рис.12. Ранняя экспрессия Х-Delta-1 обеспечивает паттерн первичного нейрогенеза. а. Схематическая диаграмма паттерна первичного гейрогенеза у эмбрионов Xenopus. Первичные нейрональные предшественники возникают в виде трёх полос на каждой из сторон от срединной линии нервной пластинки, маркированных m (medial), i (intermediate) и l(lfteral). Т.к. пластинка удлинняется и сужается, то эти домены сдвигаются и в конечном итоге занимают вентральную , промежуточную и дорсальную позицию в нервной трубке, где они дифференцируются в моторные нейроны. интернейроны и сенсорные нейроны, соотв. b-e, in situ, гибридизация , показывающая экспрессию X-Delta-1 (b, d) или N-tubulin (c,e), передний конец слева. Ранняя экспрессия X-Delta-1 в b и d предопределяет характер экспрессии N-tubulin в с и е. (Из A.Chitnis et al., 1995)

    Скорее всего связывание Delta с Notch побуждает воспринимающую клетку не становиться нервной. Итак, передача сигналов Notch, по-видимому, контролирует по крайней мере два аспекта нейрального развития: дифференцировку глиальных клеток и древовидное разветвление нейритов (arborization), т.е. длину и организацию дендритных отростков от нейронов (См. след. раздел).
    В глазах позвоночных взаимодействия между Notch и его лигандами, по-видимому, также регулируют какие клетки станут оптическими нейронами и какие станут глиальными клетками (Dorsky et al., 1997; Wang et al., 1998). Взаимодействия Notch с лигандами м.б. критическими для нейрального развития.

    Рис. 13. Паттерн экспрессии генов сигнального пути Notch предполагает постоянную Notch активацию на границах в заднем мозге. In situ гибридизации проводили для выявления транскриптов (A–C) rFng, (D–F), deltaA, и (G–I) deltaD на ст. 16 hpf - 24 hpf. Головки стрелок показывают границы ромбомеров, а заполненные кружки показывают отические пузырьки. Экспрессия rFng expression происходит на граница ромбомеров, тогда как deltaA и deltaD имеют более распространённую экспрессию на низком уровне и повышенную экспрессию в нейробластах заднего мозга. Отметим, что пробелы в экспрессии deltaA и deltaD видны на границах ромбомеров в центре ромбомеров (стрелки на [F] и [I]). (J) Окрашивание гематоксилином и эозином сагитальных срезов 24 ч. эмбрионов. Головки стрелок показывают границы в заднем мозге. (K и L) rFng транскрипты выявляются в виде двух рядов клеток, фланкирующих физические границы (головки стрелок в [K] и [L]). rFng-экспрессрующие клетки в L псевдоокрашены в флюоресцентный оранжевый и вторично окрашены DAPI (псевдо-зеленый), чтобы локализовать ядра клеток. Scale bar in (A): 100 µm indicates the scale of (A)–(I); scale bar in (J): 50 m indicates the scale of (J)–(L).

    Во время развития заднего мозга позвоночных формируется отдельная популяция пограничных клеток на стыке между каждым из сегментов. Мало известно относительно механизмов, которые регулируют формирование или функции этих клеток. У рыбок данио задний мозг экспрессирует radical fringe в пограничных клетках, а гены delta экспрессируются по-соседству с границами. Это согласуется с устойчивой активацией Notch в пограничных клетках. Эксперименты по мозаичной экспрессии выявили, что активация пути Notch/Su(H) регулирует свойства клеточного сродства, которые позволяют сегрегировать клеткам, образуя границы. Кроме того, передача сигналов Notch коррелирует с задержкой нейрогенеза на границах в заднем мозге и необходима для ингибирования преждевременной нейрональной дифференцировки пограничных клеток. Следовательно, сигнальная система Notch связана с регуляцией локализации и дифференцировки пограничных клеток заднего мозга. Это м.б. важным для этих клеток, чтобы действовать как стабильные сигнальные центры.


    Регуляция развития нейритов у млекопитающих с помощью Notch1.

    Рис. 14. Предполагаемая модель cis и trans эффектов Delta 1 на нейриты. (а) Взаимодействие эндогенных Notch с лигандом регулирует вырост нейритического отростка без влияния со стороны лиганда соседней клетки. N, Notch1; D, Delta1; J, Jagged1. (b) Лиганды, экспрессируемые клеткми вдоль пути миграции репрессируют вырост нейрита, экспрессирующего Notch1. (с) Высокие уровни Delta1 ингибируют рецепцию лингандов вдоль пути миграции, индуцируя Jagged1 и Notch1 и усиливая вырост нейритов. Относительные размеры звездочек указывают на предполагаемые количества передаваемых сигналов Notch.

    Notch взаимодействует синергично с Abl тирозин киназой, регулируя нахождение пути специфическим аксоном. Sanpodo является другим возможным медиатором Notch регуляции развития нейритов через его взаимодействие с цитоскелетом. Итак, можно предположить, что Notch осуществляет свое влияние на рост нейритов через локальные модуляторы цитоскелета, такие как Sanpodo или Abl скорее, чем через ядерные эффекты. Т.к. в последнем случае необходимо, чтобы активированные фрагменты перемещались на большие расстояния от ростового конуса в ядро. Но могут интегрированно действовать оба механизма локальный и ядерный.

    6. Сомитогенез


    У позвоночных сегментация пресомитной мезодермы даёт парные блоки параксиальной мезодермы, называемых сомитами, которые дифференцируются в аксиальный скелет, мускулатуру, сухожилия и дермис. Первые сомиты появляются в передней части туловища, отпочковываясь от ростального конца параксиальной мезодермы с регулярными интервалами (Рис.15).



    Рис. 15. Нервная трубка и сомиты при скринрующей ЭМ. Когда поверхностная эктодерма удалена, то выявляются хороо сформированные сомиты, а также параксиальная мезодерма (внизу справа), которая ещё не разделена на отдельные сомиты.Закручивание параксиальной мезодермы в сомитомеры видно внизу слева и видны клетки нейрального гребня, мигрирующие вентрально из верхней части нервной трубки (фото K.W. Tosney)

    Образование сомитов начинается когда клетки параксиальной мезодермы оказываются организованными в завитки клеток, называемые сомитомерами. Сомитомеры компактизуются и оказываются связанными вместе с помощью эпителия и в конечном счёте отделяются от пресомитной мезодермы, чтобы сформировать индивидуальные сомиты. Общее количество сомитов является видоспецифичным (50 у эмбрионов кур, 65 у мышей и 500 у некоторых змей.
    Ключевым агентом в периодическом образовании сомитов является сигнальный путь Notch. Гензеновский узелок регулирует время сомитогенеза с помощью регуляции экспрессии Lunatic fringe. Когда клетки проходят через Гензеновский узелок, они секретируют FGF8. Этот паракринный фактор предупреждает клетки от экспрессии Lunatic fringe. Как только узелок регрессирует, то эти клетки параксиальной мезодермы оказываются способными становиться сомитами. Установлено, что непограничные клетки могут приобретать свойства пограничных клеток после электропортации в эти клетки белка Notch или Lunatic fringe белка, который активрует Notch (Sato et al., 2002).



    Рис. 16. Дорсальный вид контрольной мышки и сибса с мутацией в гене Delta-like3 (кодирующем Notch лиганд). Мутант имеет несколько центров оссификации (белые точки), расположенных неправильно и уродливые рёбра

    Мутации, затрагивающие передачу сигналов Notch, ответственны и за аномальное образвание позвонков у мышей и у людей. У людей, индивиды с spondylocostal dyspalsia имеют многочисленные дефекты позвонков и рёбер, которые обусловлены мутациями лиганда Delta-like3 (Рис. 16)(Bulman et al., 2000; Dunwoodie et al., 2002).
    Если сигналы Notch предопределяют местоположение образования сомита, то Notch д. контролировать каскад генной экспрессии, который функционирует как автономные сегментационные "часы" (Palmeririm et al.,; Jouve et al., 2000; 2002). Одним из таких генов является Hairy1, гомолог гена сегментации дрозофилы.
    Подобно др. генам, регулируемым сигнальным путём Notch, ген Hairy1 экспрессируется динамическим образом. Во-первых, он экспрессируется в каудальной части каждого сомита и он персистирует в этих каудальных областях, по крайней мере, 15 ч. Во-вторых, он экспрессируется в пресомитной сегментной пластинке циклически, волно-образным способом, с пиком каждые 90 мин. Его экспрессия обнаруживается сначала в самой каудальной области пресомитной мезодермы; эта область экспрессии затем перемещается вперед при образовании каждого сомита. В конечном счёте, подобно волне накатывающейся на пляж его экспрессия отступает каудально, оставляя тонкую полосу экспрессии на самом переднем гребне. Наиболее задняя часть этой полосы передней экспрессии коррелирует с задним концом следующего сомита. который будет сформирован (Рис. 17).



    Рис. 17. Образование сомитов коррелирует с волнообразной экспрессиией гена Hairy1 у эмбрионов кур. (А) Схематическое представление задней части эмбрионов кур. S1 только что отпочковавшаяся сомитная мезодерма. Экспрессиия гена hairy1 (обозначена пурпурным цветом) видна в каудальной половине этого сомита, также как и в задней части пресомитной мезодермы и в тонкой полоске, которая будет формировать каудальную часть слекдующего сомита (S0). (B) Каудальная выемка (маленькая стрелка) начинает отделять новый сомит от пресомитной мезодермы. Задняя область экспрессии hairy1 распространяется кпереди. (С) Вновь сформированный сомит теперь обозначается как S1; он сохраняет экспрессию hairy1 в своей каудальной половине, тогда как домен экспрессии hairy1 движется далее кпереди и одновременно укорачивается. Первоначальный S1 сомит теперь называется S2, он подвергается дифференцировке. (D) Формирование сомита S1 заканчивается, а передняя область (гребень волны) домена экспрессии hairy1 становится задней в формирующемся следующем сомите. Весь процесс занимает 90 мин.

    Ген Hairy1 кодирует транскрипционный фактор, но его мишень неизвестна. Возможными мишенями (прямыми или косвенными) являются гены для ephrin и его рецептора. У рыбок данио и кур граница между только что отделившимся сомитом и пресомитной мезодермой образуется между ephrin-B2 в задней части сомита и EphA4 в наиболее передней части пресомитной мезодермы (Рис. 18) (Durbin et al., 1998).



    Рис. 18. Ephrin и его рецептор возможно представляют место отсечения при формировании сомита. (А) Паттерн экспрессии рецепторной тирозин киназы EphA4 (голубой) и его лигандоа, ephrin-B2 (красный) во время образования сомита. Граница сомита образуется в месте соединения области экспресии ephrin на заднем конце последнего из образующихся сомитов и областью экспрессии Eph в передней части следующего формируемого сомита. В пресомитной мезодерме паттерн воссоздаётся вновь во время отделения каждого сомита. Наиболее задняя часть следующего сомита неэкспрессирует ephrin до тех пор, пока сомит не станет готов к отделению. (В) Гибридизация in situ показывает экспрессию EphA4 (тёмно синим) по мере образования новых сомитов у эмбрионов кур. (А По Durbin et al., 1998; В (фото) J.Kastner)

    Как только сомит сформируется, этот паттерн генной экспрессии смещается каудально. Нарушения передачи этих сигналов ( инъекции РНК доминантно негативных Ephs) ведут к аномальноу образованию границы сомитов.
    Граница сомита не следует в точности паттерну EphA4 , поэтому возможно, что функция EphA4 м.б. важной после того, как сомит начинает отделяться от сегментной пластинки (Kulesa, Fraser, 2002).
    Итак, формирование сомитов контролируется с помощью 'segmentation clock', внутреннего молекулярного осциллятора, связанного с периодической активацией генов, участвующих в пути передачи сигналов Notch, таких как HES-1, -5, и -7 и Lunatic Fringe. Периодическая активация передачи сигналов Notch необходима для установления регулярного набора соматических границ, т.к. мыши, мутантные по N1, Dll-1, Dll-3, CSL и Lunatic Fringe обладают тяжелыми дефектами, возникающими в результате нерегулярного или отсутствия образования границ сомитов, что приводит к возникновению аномальных осевых скелетных структур.

    7. Спецификация сомитов вдоль передене-задней оси


    Хотя все сомиты выглядят одинаково, они будут формировать разные структуры в разных положениях вдоль передне-задней оси. Напр., ребра являются производными сомита. Сомиты, которые формируют шейные позвонки и поясничные не способны формировать рёбра; ребра образуются только сомитами, формируемыми токаракльными позвонками. Более того, спецификация торакальных позвонков происходит очень рано в развитии. Если область сегментальной пластинки, которая д. дать торакальные сомиты. трансплантировать в шейную область эмбриона, то эмбрион хозяин будет формировать рёбра в шее, но только на стороне трансплантата (Рис. 19) (Kieny et al., 1972; Nowicki, Burke, 2000).



    Рис. 19. Мезодерма сегментной пластинки детерминирована в отношении своего положения вдоль передне-задней оси ещё до сомитогенеза. Когда мезодерма сегментной пластинки, которая должна формировать торакальные сомиты, трансплантируется в область более молодого эмбриона (каудальнее первого сомита) в место образования шейных сомитов, то трансплантированная мезодерма будет дифференцироваться в соответствии со своим исходным положением и будет формировать в шее рёбра (По Kieny et al., 1972)

    Мутационный анализ показал, что гены Hox ответственны за спецификацию качественных особенностей позвонков (Krumlauf, 1994). Во время развития Hox гены активируются последовательно в соответствии со своим положением в кластере (Duboule, 1994), это приводит к уникальным комбинациям экспрессиируемых Hox генов на разных аксиальных уровнях, это обозначается как 'Hox code' (Kessel, 1991; Kessel and Gruss, 1991). Нох гены, очевидно, активируются одновременно с формированием сомитов и эмбрион, по-видимому, "считает сомиты" при закладке границ экспрессии Нох генов.После образования сомитов Hox гены продолжают экспрессироваться в сомитах и их производных с сохранением соответствующих границ экспрессии (Нох кода). Каждый сомит сохраняет паттерн экспрессиии Нох генов, даже если они трансплантируются в др область эмбриона (Nowicki, Burke, 2000). Регуляция Нох генов с помощью сегментационных часов должна координировать образование и спецификацию новых сегментов. Отклонения в передаче сигналов Notch в параксиальной мезодерме эмбрионов мышей меняют качественные особенности позвонков. Полученные результаты предоставляют прямые доказательства того, что координация сегментации и позиционная спецификация тканей, производных мезодермы вдоль передне-задней оси тела, нуждаются как в достаточных уровнях сигналов Notch, так и циклической активности Lfng и др. циклических генов, контролируемых Notch.
    Результаты анализа экспрессии 15 Hox генов с помощью in situ гибридизации у Dll1dn эмбрионов между 8.5 и 10.5 днём показали, что точное позиционирование ростральной границы экспрессии Hox нуждается в точно регулируемой активности Notch в пресомитной мезодерме. В целом активация Hox в параксиальной мезодерме, по-видимому, серьёзно затрагивается только, если передача сигналов Notch сильно снижена или полностью блокирована потенциально уже в предшественниках параксиальной мезодермы. Как активность Notch и регуляция транскрипции Hox генов купированы молекулярно, пока неясно.

    8. Участие в развитии почек


    Продемонстрировано участие компонентов сигнального пути Notch в развитии почек путем взаимодействия с геном Cux-1 (Sharma et al., 2004). В частности подтверждено взаимодействие между Notch 2 и Cux-1 в регуляции пролиферации мезангильных клеток в развивающихся гломерулах. Notch 1 и Notch 3 (NICD) также как и Cux-1 репрессруют ген р27. Предполагается также , что Notch 3 и Cux-1 играют специфическую роль в созревании подоцитов.
    . БОЛЕЗНИ, В КОТОРЫХ УЧАСТВУЕТ СИГНАЛЬНАЯ СИСТЕМА NOTCH


    1. Передача сигналов Notch и рак


    Установлено, что субнабор Т клеток при острой лимфобластной лейкемии связан с конституитивной экспрессией N1ICD белка. Исследования показали, что эктопическая активация N1 в предшественниках Т клеток вызывает их малигнизацию с высоким показателем и коротким латентным периодом. Избыточная экспрессия N3ICD индуцирует Т-клеточную лейкемию, сходную с той, что индуцируется N1ICD, но физиологическая функция N3ICD в развитии Т клеток неизвестна. Эти данные указывают на то, что нормальная функция N1 в регуляции пролиферации и дифференцировки Т-клеточных предшественников д. тонко контролироваться, т.к. передача сигналов Notch м.б. легко нарушена, что способствует Т-клеточному онкогенезу. Сходным образом, функции N2 в созревании В клеток в селезенке м.б. связаны в некоторых случаях с В-клеточной хронической лимфоцитарной лейкемией. Интересно, что белок EBNA2, кодируемый Epstein-Barr virus (EBV), по-видимому, воспроизводит передачу сигналов Notch путём взаимодействия с CSL, индуцируя экспрессию Notch-регулируемых генов в отсутствие активации Notch. Этот механизм скорее всего отвечает за способность EBV индуцировать В клетки и др. лимфомы.
    Недавние данные указывают на то, что Notch м. кооперироваться с онкогенами. Girard et al., использовали провирусных инсерционный мутагенез для идентификации генов, которые действуют вместе с с-myc по ускорению развития CD4/CD8 Т-клеточных лимфом у мышей и нашли 52% конституитивно экспрессируемых активных версий N1. Далее, N3ICD-индуцированные Т-клеточные лимфомы экспрессируют постоянно активный nuclear factor kappa B (NF-κB), регулятор клеточной жизнеспособности, пролиферации и продукции цитокина. Анализ DN субнабора у N3ICD трансгенных мышей выявил накопление поздних DN тимоцитов, для которых характерны анти-апоптические эффекты передачи сигналов NF-κB в ответ на передачу сигналов пре-TCR. Интересно, что N1ICD непосредственно взаимодействует с NF-κB посредством ankyrin повторов in vitro, способствуя трансактивации NF-κB при низких концентрациях, т.к. при высоких концентрациях отмечается ингибирующий эффект. Следовательно, N3ICD м. взаимодействовать с NF-κB посредством того же самого механизма. Недавно Beverly и Capobianco было показано, что доминантно-негативные изоформы Ikaros, лимфоид-ограниченного транскрипционнного фактора, увеличивают показатели и укорачивают латентный период Т-клеточной лейкемии у N1ICD трансгенных мышей. Ikaros функционирует как транскрипционный репрессор во многих контекстах и интересно, что Ikaros и CSL соединяются с общей стержневой последовательностью, TGGGAA. Поэтому было предположено, что, что во время N1ICD-индуцированного Т-клеточного лейкемогенеза, гены, которые обычно репрессируются с помощью Ikaros, эктопически активируются с помощью Notch. Следовательно, подтвержается, что Notch-индуцированный Т-клеточный онкогенез зависит от дисрегуляции комплекса, взаимодействующего с сигнальными сетями.
    Дисрегуляция передачи сигналов Notch м. также вызывать неопластические трансформации в др. типах клеток, чьё развитие регулируется Notch. Напр., передача сигналов Notch регулирует способность панкреатических клеток предшественников выбирать между эндокринным и экзокринным клеточным клоном, а недавние результаты подтвердили, что эктопическая активация Notch вызывает экспансию метапластического эпителия протоков, первичное повреждение при раке поджелудочной железы у человека. Последующие исследования показали, что передача сигналов Notch действует иерархически ниже др. факторов роста, таких как TGF-α и EGF, при индукции опухолей поджелудочной железы. Онкопротеин Ras м.б. ключевым промежуточным фактором между передачей сигналов ростовых факторов и активацией Notch, т.к. передача сигналов N является существенным нижестоящим эффектором онкогенного Ras и является важной для поддержания неопластического фенотипа Ras-трансформированных клеток. Дисрегуляция функции белков, которые модифицируют передачу сигналов Notch также м.б. онкогенной, на это указывают недавние находки, что хромосомные транслокации, изменяющие функцию Notch коактиватора, Mastermind-like 2 (MAML2), превалируют в мукоэпидермоидных карциномах, наиболее распространённых злокачественных опухолей слюнных желез у людей.
    В дополнение к способности аберрантной активации Notch способствовать неопластической трансформации многих типов клеток, недавно было показано, что N1 действительно функционирует как опухолевый супрессор в коже. Nicolas et al., показали, что условные делеции N1 в коже вызывают гиперпролиферацию базального эпидермального слоя, кульминацией чего является развитие кожных опухолей в 95%. Боле того, N1 нехватки облегчают развитие химически индуцируемых кожных карцином. Пути передачи сигналов Notch м. осуществлять свой супрессирующий опухоли эффект в коже путём ингибирования пути передачи сигналов Wnt. Полученные данные подтверждают, что нормальной функцией Notch в регуляции само-обновления и выбора клеточной судьбы во время органогенеза, м.б. кооперативаня или антогонистическая роль в необластической трансформации в широком круге типов клеток.

    Cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalophathy (CADASIL)


    CADASIL является аутосомно доминантным нарушением, затрагивающим главным образом артерии головного мозга, вызывая субкортикальную гибель ткани белого вещества. Оно ассоциирует с мутациями N3 и вызывает в результате деструкции vascular smooth muscle cells (VSMC) артериол, которые необходимы для собственно образования многослойных стенок сосудов в артериях. Наиболее заметным признаком CADASIL является позднее начало болезни, в среднем в возрасте 45 лет. Симптомы CADASIL включают субкортикальные ишемические инсульты, нарушения настроения, мигрени и наиболее заметна прогрессивная деменция и гибель спустя 15-20 лет после клинического начала. Лежащей в основе причиной болезни является системная артериопатия, благодаря прогрессивной потере VSMC и замещения их granular eosinophilic material (GOM) неизвестного состава вокруг базальной мембраны и внеклеточного матрикса VSMC.
    Участие N3 в CADASIL впервые было продемонстрировано с помощью позиционного клонирования в одной из семей, позволившего картировать эффект хромосомы 19. Анализ сцепления др. семей с историей CADASIL позволил сузить искомую область до 800 т.п.н., в которой был идентифицирован мутантный N3 ген. CADASIL характеризуется накоплением внеклеточной области N3 (N3ECD) на клеточной мембране вблизи GOM . Накопление N3ECD в сосудах кожи используется для диагностики CADASIL. Однако др. доказательства указывают на то, что N3ECD накопление и GOM м.б. вторичными следствиями нарушений закрепления VSMC во внеклеточном матриксе, вызываемых мутациями в N3. Следовательно, механистические взаимоотношения между N3ECD мутацией и аккумуляцией, отложением GOM, дегенерацией VSMC и симптомами CADASIL неясны.
    Действительно все CADASIL N3 мутации участвуют в добавлении или потере цистеиновых остатков в одном из 34 EGF повторов внеклеточного домена (особенно в кластере первых 5 повторов, или за счёт непосредственно миссенс мутаций или мутаций сплайс-сайта). Эти изменения ингибируют нормальное формирование трёх дисульфидных связей на EGF повторах, тем самым меняется структурная конформация белка. Это м. в свою очередь нарушать связывание лиганда, димеризацию, пост-трансляционные модификации, трафик клеток или очистку из мембран N3, каждое из них м. вызывать или усиление или уменьшение передачи сигналов. Усиление передачи сигналов N3 недавно было связано со снижением апоптоза в VSMC . Однако, при CADASIL не ясно, происходит ли усиление сигнала N3, что вызывает накопление "поврежденных" VSMC, или происходит снижение сигнала N3, вызывающее апоптоз во всём остальном здоровых клеток. VSMC существенны не только для формирования сосудистой архитектуры, но также высвобождают фактор проницаемости, vascular endothelial growth factor (VEGF), который увеличивает перфузию крови. Снижение высвобождения VEGF м. снижать кровоток в определнных областях головного мозга, как это наблюдается у пациентов с CADASIL, это в свою очередь ведёт к инсульам и симптомам CADASIL. Выяснение функции N3 в VSMC и роли мутантного N3 в качестве причины CADASIL проливает свет на структурно-функциональные взаимоотношения внутри N3.

    Alagille syndrome


    AGS в отличие от поздно начинающейся CADASIL является болезнью развития с клиническими признаками, обычно проявляющимися в течение первых двух лет. Это аутосомно доминантное, мультисистемное заболевание, характеризующееся дефектами печени, сердца, скелета и глаз, дающими в езультате широкий круг симптомов и величину смертности в 15-20%. Идентифицированы Jagged-1 мутации как ответственные за AGS, по-крайней мере, у 70% пациентов. Цитогенетический делеционный анализ области 20р12 подтвердил, что AGS является результатом изменений в одиночном гене, идентифицированном как Jagged-1. Делеция всего гена Jagged-1 обнаруживается у 3-7% от всех AGS пациентов, указывая тем самым, что гаплонедостаточность является причиной, по крайней мере, некоторых случаев AGS. Из оставшихся известных мутаций Jagged-1 83% связаны с укорочением Jagged-1 из-за ненсенс мутаций или мутаций сплайс-сайта. Остальные 17% связаны с миссенс мутациями, образующими кластер вокрут внеклеточной части Jagged-1, кодирующей область DSL и первый повтор EGF (106). Тщательное исследование этих мутаций м. позволить выяснить нормальный механизм передачи сигналов или стабильности белка Jagged-1. Хорошо известные генотип-фенотипические взаимоотноешия у людей связаны с мутациями законсервированного глицина, это обусловливает аномальное гликозилирование субпопуляции Jagged-1 in vitro, не позволяя ей достигать клеточной поверхности. Пациенты с этой мутацией имеют 50-100% от нормального уровня Jagged-1, что приводит в результате к кардиальным дефектам, но не к аномалиям печени. Сильно варьирующая экспрессиия AGS у пациентов с одной и той же мутацией вместе с тем фактом. что 30% AGS пациентов не имеют известных Jagged-1 мутаций, указывает на то, что участвуют и др. средовые или генетические факторы, такие как вышестоящие или нижестоящие модификаторы и регуляторы Notch. Анализ сцепления у таких пациентов поможет выяснить др. критические части пути Notch в развитии у человека.

    Spondylocostal dysostosis


    Spondylocostal dysostosis (SD) является семейством родственных заболеваний, где дефекты поозвонков ассоциированы аномалиями рёбер и карликовостью из-за короткого туловища. Одна из специфических форм аутосомно рецессивного SD обусловливается мутациями в Dll-3 и характеризуется аномальной сегментацией остистых отростков, скорее всего из-за потери функции Dll-3 во время сомитогенеза и в сегментационных часах, как было описано выше (108). Недавно 17 различных мутаций в Dll-3 было выявлено, которые связаны с укорочением белка, добавлением или делецифми цистеиновых остатков внутри EGF повторов или замещением существенных аминокислот. Открытие Dll-3 мутаций в субнаборе пациентов с SD открывает важность пути пердачи сигналов Notch в развитии скелета. Показано (slova3/orgnzMch.htm) , что передача сигналов Wnt, Notch и BMP необходима для формирования хвоста из хвостовой почки (хвостового организатора).

    Болезнь Алцгеймера?


    Как было показано на Рис. 6 при болезни Алцгеймера нарушается работа γ-секретазного комплекса, осуществялющего внутримембранное расщепление. Эктодомен amyloid precursor protein (APP) первоначально удаляется с помощью α-secretase- или β-secretase-обусловленного расщепления, а последующее расщепление некоторых поддающихся расщеплению связей осуществляется с помощью γ-secretase в средине трансмембранного домена TMD (на Рис. показано только одно место расщепления), высвобождающего P3 или амилоидогенный Aβ пептиды, соответсвенно. Aβ пептиды (которые являются Aβ40 и Aβ42) отличаются др. от др. по композиции своего С-конца. γ-Secretase расщепляет также вблизи цитоплазматического конца TMD по сайту, известному как S3-подобному или ε, и тем самым высвобождает APP ICD (внутриклеточный домен). Это указывает на возможное участие одного из звеньев сигнального пути Notch в патогенезе этой болезни. Правда, было установлено, что существуют различия между двумя субстратами, которые м. влиять на их γ-secretase-обусловленный процессинг. В самом деле, предложен новый класс isocoumarin лекарств, который не прямо ингибирует γ-secretase, он м.б. потенциально использован для терапептического снижения продукции Aβ40/42, которое не влияет на расщепление Notch (Fortini, 2002).
    Сайт создан в системе uCoz