В данном исследовании мы показали, что кардиальные волокна Пуркинье экспрессируют, по крайней мере, в два раза больше Nkx2-5 в ядрах клеток по сравнению с соседними работающими кардиомиоцитами в ходе всей дифференцировки. Более того, используя гены, маркирующие инициальную, промежуточную и позднюю стадии развития волокон Пуркинье, было показано, что этот локализующийся в ядрах сигнал Nkx2-5 увеличивается прогрессивно вплоть до вылупления. Конституитивная избыточная экспрессия Nkx2-5 при инициации развития волокон Пуркинье разрушает эту последовательность генной экспрессии созревания, в частности ингибируя sMHC, белок, активируемый на поздних стадиях дифференцировки проводящих клеток. Наконец, мы показали, что мутантная форма Nkx2-5, M170, которая как известно вызывает болезнь сердца у людей, не обмениваются эффектами избыточной экспрессии с Nkx2-5 дикого типа, указывая тем самым, что M170 может нарушать развитие AVCS, действуя как нефункциональный аллель, редуцирующий дозу гена посредством гаплонедостаточности. Исходя из этих данных, мы предполагаем, что повышение Nkx2-5 предопределяет популяцию кардиомиоцитов, активно дифференцирующихся в волокна Пуркинье. Более того, мы предполагаем, что точная временная регуляция уровней Nkx2-5 необходима для нормальной дифференцировки клеток волокон Пуркинье.

Нами и др. установлено, что Nkx2-5 экспрессируется на повышенных уровнях в проводящей ткани птиц (Takebayashi-Suzuki et al., [2001]; Thomas et al., [2001]). Наши более ранние исследования также отмечали, что время повышенной экспрессии Nkx2-5 в центральных и периферических проводящих клетках соответствует последовательности рекрутирования клеток в эти отличающиеся AVCS ткани (Gourdie et al., [1995]; Cheng et al., [1999]; Sedmera et al., [2003]). Т.о., в данном исследовании важным успехом оказалась способность скоррелировать временную изменчивость в иммуномечении Nkx2-5 с последовательностью белковых маркеров, определяющих стадии созревания волокон Пуркинье. Как здесь было показано с помощью преждевременного позитивного регулирования уровней Nkx2-5, существует возможность модифицировать эту последовательность генной экспрессии, тем самым это указывает на важность четкой временной регуляции дозы Nkx2-5 для прогрессивного созревания фенотипа волокон Пуркинье.

Инициальная индукция волокон Пуркинье, как было показано, ассоциирует с факторами, секретируемыми эндотелиальными клетками, включая endothelin и neuregulin, и может использовать входящие сигналы от эпигенетических механических факторов, таких как сдирающий (shear) стресс и растяжение ткани (Gourdie et al., [1998]; Rentschler et al., [2002]; Sedmera et al., [2003]; Patel and Kos, [2005]). Для периферических волокон Пуркинье in vivo, время этого индуктивного рекрутирования соответствует инициации экспрессии Cx40 на ст. E12. Здесь мы показали, что начало экспрессии Cx40 в волокнах Пуркинье маркируется совпадением с активацией экспрессии Nkx2-5 (квалифицируется как двухкратная индукция). Учитывая, что волокна Пуркинье затем подвергаются прогрессивной последовательности дифференцировок, возможно детерминированных, по крайней мере, до некоторой степени повышенными уровнями локализованных в ядрах Nkx2-5, то возникает интересный вопрос, как этот процесс оркестрируется? С одной стороны, регуляция уровней Nkx2-5 может быть предопределена генетически. Определенно, промотор Cx40 содержит сайты связывания для Nkx2-5, Tbx5 и членов GATA семейства транскрипционных факторов: последние два были известны как партнеры по связыванию с Nkx2-5 (Lee et al., [1998]; Sepulveda et al., [1998]; Hiroi et al., [2001]; Sedmera et al., [2003]). Nkx2-5 может трансактивировать Cx40 или сам по себе или в ассоциации с Tbx5, др. транскрипционным фактором, критическим для развиатия AVCS (Hatcher et al., [2003]; Moskowitz et al., [2004]). Однако, что делает поздно экспрессирующийся маркер волокон Пуркинье, такой как sMHC? Как мы продемонстрировали in vivo и in vitro, sMHC особенно чувствителен к повышению эндогенного Nkx2-5, a поддержание экспрессии sMHC in vivo, по-видимому, ассоциирует со снижением уровней локализованного в ядрах Nkx2-5. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, может ли подавление Nkx2-5 и активация sMHC in vivo происходить как следствие предетерминированной генетической программы или эти изменения происходят в ответ на паракринные сигналы, как это возможно имеет место во время инициальной индукции волокон Пуркинье. Скорее всего, механизм, участвующий во взаимодействии между генетически детерминированным и индуктивным сигнальным процессами сочетанно регулируют эту дифференцировку.

В то время как sMHC чувствителен к дозе Nkx2-5, то уровни Cx40 в волокнах Пуркинье не были заметно нарушены при избыточной экспрессии Nkx2-5 in vivo. Полученные результаты указывают на то, что хотя Nkx2-5 и достаточен для увеличения Cx40 in vitro на ст. E3.5 в кардиомиоцитах, дальнейшее повышение Nkx2-5 после ст. E10 in vivo не может повышать экспрессию Cx40 ещё выше. Эти наблюдения параллельны результатам недавнего исседования у Nkx2-5 гетерозиготных нулевых мышей. В то время как снижение дозы Nkx2-5 посредством гаплонедостаточности приводит к более значительной, чем 50% потере волокон Пуркинье у этих модельных мышей, Cx40 внутри оставшихся проводящих клеток сохраняет количественно нормальные уровни (Jay et al., [2004]). Все эти данные на курах и мышах подтверждают, что как только начинается выбор судьбы клеток Пуркинье зарождающиеся проводящие клетки становятся рефрактерными к последующим изменениям дозы Nkx2-5, по крайней мере, в отношении экспрессии Cx40. Мы подчеркиваем, что та же самая парадигма не возникает в отношении Cx40-негативных кардиомиоцитов, которые могут быть индуцированы к активации Cx40 посредством избыточной экспрессии Nkx2-5. Представляет ли активация Cx40 инициальную ступень вниз по пути дифференцировки волокон Пуркинье или трансактивация одиночного гена не имеет определенного значения для потенциальных кардиомиоцитов, чтобы подвергнуться последующей дифференцировке в проводящие клетки, ещё предстоит определить.

Заслуживает внимания наше наблюдение активации Cx40 в работающих кардиомиоцитах в ответ на избыточную экспрессию экзогенного Nkx2-5, что отличает эти результаты от таковых Kasahara и др. ([2001]). Эти исследователи сообщили, что избыточная экспрессия Nkx2-5 дикого типа в кардиомиоцитах взрослых мышей вызывает снижение экспрессии Cx43 и не выявляет заметных изменений в Cx40. Это кажущееся расхождение отражает межвидовые вариации и/или изменения в компетентности кардиомиоцитов, находящихся на разных стадиях, в ответ на Nkx2-5. Здесь уместно упомянуть, что Nkx2-5, как было показано, быстро активируется в работающих кардиомиоцитах, моделирующих гипертрофию у млекопитающих (Thompson et al., [1998]). Повышенные уровни Nkx2-5 были также выявлены в желудочках после стимуляции гипертрофии адренэргическими агонистами (Saadane et al., [1999]). По существу, эктопическая активация Nkx2-5 в работающем миокарде, которую мы моделировали у эмбрионов кур может быть аспектом определенных патологических условий зрелого сердца. Интересно, что усиление активности Cx40 наблюдалось также в миокарде людей с congestive heart failure (Dupont et al., [2001b]), a повышенные уровни Cx40 ассоциируют с предрасположенностью к фибрилляции предсердий (Dupont et al., [2001a]). Хотя эти исследования не касаются Nkx2-5, наши данные показывают, что избыточная экспрессия этого транскрипционного фактора достаточна для активации экспрессии Cx40 в работающих кардиомиоцитах in vivo, подтверждая возможность взаимосвязи между этими двумя белками при болезни миокарда.

Второй аспект данного исследования в отношении сердечных заболеваний связан с использованием нами in vitro и in vivo моделей для выяснения функции известных NKX2-5 мутантов. Свыше 30 NKX2-5 мутаций идентифицировано у людей, которые вызывают функциональные и структурные кардиальные аномалии, включая AV блок (Schott et al., [1998]; Benson et al., [1999]; Goldmuntz et al., [2001]; Gutierrez-Roelens et al., [2002]; Ikeda et al., [2002]; Watanabe et al., [2002]; McElhinney et al., [2003]). Наличие AV блока наиболее часто ассоциирует с мутациями, затрагивающими гомеодомен Nkx2-5 (Benson et al., [1999]; Gutierrez-Roelens et al., [2002]). Одной из таки х мутаций является M170 вариант, при котором мутантный NKX2-5 локус дает укорочение С-терминального конца на уровне гомеодомена. В отличие от дикого типа Nkx2-5, избыточная экспрессия M170 укороченного мутанта в наших in vitro и in vivo моделях дифференцировки клеток Пуркинье, по-видимому, не нарушает паттернов экспрессии Cx40 или sMHC. В обеих моделях присутствовали эндогенные дикого типа Nkx2-5 аллели, указывая, что M170 мутантный аллель не обладает доминантным негативным эффектом. Поэтому мы пришли к заключению, что Nkx2-5 M170 белок является возможно нулевой мутацией и приводит в результате к потере функции Nkx2-5 посредством гаплонедостаточности. Др. исследование на мышах подтвердило важность дозы гена Nkx2-5 в развитии AVCS (Jay et al., [2004]; Pashmforoush et al., [2004]). Получена дальнейшая новая информация, что повышение и последующее контролируемое удержание повышенного уровня Nkx2-5 необходимо для нормальной дифференцировки волокон Пуркинье. Эта потребность в точной пространственно-временной регуляции Nkx2-5 скорее всего имеет значение для разработки терапевтических стратегий для смягчения эффектов Nkx2-5 мутаций на функцию AVCS.