Посещений:
Ретинальные Ганглиолярные Клетки

Роль Апоптоза

Retinal ganglion cells: dying to survive
MARC B. GUERIN, DECLAN P. McKERNAN1, COLM J. O’BRIEN and THOMAS G. COTTER
Int. J. Dev. Biol. 50: 665-674 (2006)| doi: 10.1387/ijdb.062159mg
Онтогенетический тканевой гомеостаз базируется на тонком балансе между гибелью и пролиферацией клеток. Центральны для подобного созревания в ЦНС является апоптоз. Эта уникальная форма запрограммированной гибели (PCD) участвует не только в некоторых патологиях зрелой сетчатки, но и также выполняет фундаментальную роль по ваянию этого органа на эмбриональной и постнатальной стадиях. Сетчатка позвоночных развивается из одиночного слоя недифференцированных нейроэпителиальных клеток в многослойную структуру терминально дифференцированных нейронов. Эти ретинальные нейроны, включая популяцию retinal ganglion cell (RGC), продуцируются в избытке во время нейрогенеза, затем они частично элиминируются с помощью серии апоптических волн прежде достижения финальной зрелости.

The development of the retinal ganglion cell population


Mature retinal ganglion cells


Зрелые RGCs являются гетерогенной, конечной совокупностью постмитотический нейронов сетчатки в глазах позвоночных (Fig. 1). Несмотря на локализацию в основном внутри наиболее внутреннего ядерного слоя зрелой сетчатки, тела некоторых RGCs смещаются из этого слоя ганглиолярных клеток (ganglion cell layer (GCL)) во внутренний плексиформный слой (Buhl and Dann, 1988)(Fig. 2). Напротив, до 50% клеток внутри GCL крыс могут быть амакринными клетками (Bunt and Lund, 1974, Perry, 1981). Как и только выходящие нейроны сетчатки, RGCs обладают уникальной способностью перерабатывать и проецировать информацию из сетчатки в зрительные центры, такие как superior collicullis (SC), pretectal ядра и латеральное geniculate ядро (Fig. 3). Эти ретинальные проекции организуют точную карту точной топографии сетчатки на зрительные центры. Свыше 90% RGCs крыс проецируется на контралатеральные SC, при этом 30% посылают коллатерали в латеральное geniculate ядро в талямусе (Dreher et al., 1985). Сенсорная информация передается вдоль немиэлинезированных RGC аксонов в зрительный нерв головы, вследствие чего конвергирующие аксоны оказываются заключенными в миэлиновые слои, продуцируемые олигодендроцитами, чтобы сформировать optic nerve (ON). Подсчет ON аксонов на поперечных срезах жает точное представление о количествах ретинальных ганглиолярных клеток у разных видов. Приблизительно они составляют только 1 % от общего количества клеток в сетчатке мышей, общие количества RGC варьируют от 32,000 до 87,000 у разных линий этого вида (Williams et al., 1996). RGCs у взрослых крыс были подсчитаны приблизительно равными 96,200-118,300 (Forrester and Peters, 1967, Danias et al., 2002).

Neurogenesis


Развитие RGC может быть подразделено на перекрывающиеся стадии спецификации, миграции и дифференцировки. Возникающие из мультипотентных гетерогенных клеток предшественников, RGCs являются первыми ретинальными нейронами, продуцируемыми во время ретиногенеза у позвоночных (Young et al., 1985a). Эти нейроны возникают между эмбриональным днем 13 (E13) и E19 у крыс, между E11 и postnatal day 0 (P0) у мышей и между E2 и E6 у эмбрионов кур (Dallimore et al.,2002, Isenmann et al., 2003, Prada et al., 1991). Считается, что решение плюрипотентных ретинальных клеток специфицироваться в RGC принимается постмитотически (Mu and Klein, 2004). Внутренне присущая экспрессия генов внутри таких клеток предшественников, как полагают, является центральной для этого критического решения специфицироваться в определенный тип клеток (Cepko et al., 1996). Гены, такие как pax 6,

math 5, sonic hedgehog (shh) и notch играют регуляторную роль в спецификации RGC. В частности, math 5 играет важную позитивную роль в развитии RGC мышей и активность этого гена в клетках ретинальных предшественников, по-видимому, способствует спецификации RGC (Brown et al., 2001, Wang et al., 2001). Shh является одним из самых ранних факторов, поддерживающих RGC фенотип и, по-видимому, регулирует также экспрессию pax 6. Этот последний ген играет центральную роль в развитии глаз, как это иллюстрируется условным нокаутом pax 6 у мышей, который приводи к ингибированию спецификации RGC во время развития, позволяя специфицироваться только амакринным клеткам в сетчатке (Marquardt et al., 2001). Напротив, notch оказывает негативное влияние на продукцию RGC (Austin et al., 1995).
Будучи специфицированными, новые постмитотические RGCs мигрируют в маргинальную зону первичной сетчатки, чтобы сформировать inner neuroblastic layer (NBL). В то время как в процессе миграции RGCs могут начинать терминальную дифференцировку под воздействием генов, таких как brn3b (Gan et al., 1999). RGCs направляют свои аксоны в ON до начала формирования дендритов (Maslim et al.,1986). Амакринные клетки оказываются затем первыми соседними клетками, к которым RGCs пытаются простирать дендритные древа, тесно сопровождаемые соединениями с биполярными и горизонтальными нейронами (Sernagor et al., 2001). Дендритные древа затем завершают свое развитие в центро-периферическом направлении (Sernagor et al., 2001). Ретинальные аксоны от первыми возникших RGCs первоначально иннервируют superior colliculus у крыс на ст. E16/16.5, в то время как соединения позднее появившихся клеток могут возникать на ст. P4 или P5 (Lund and Bunt 1976, Dallimore et al., 2002). Dallimore et al. также сообщили, что аксоны от самых ранних возникших RGCs достигают superior colliculus плода в течение 3-х дней после их возникновения, в то время как аксоны, возникшие на ст. E19 от RGCs могут в течение 8-9 дней достигать своих центральных мишеней (Dallimore et al., 2002). Др. исследования сообщают, что RGCs, генерируемые на ст. E16 соединяются с superior colliculus при рождении, тогда как RGCs, возникшие при рождении делают это вплоть до ст. P5 (Isenmann et al., 2003).

Developmental death


Появляясь первыми у таких видов, как крысы, RGCs являются также первыми нейронами, которые погибают в сетчатке. Существуют два отдельных периода онтогенетической гибели клеток, представляющие раннюю фазу, совпадающую с началом возникновения, дифференцировки и миграции нейронов (E5-E7 у кур и E15-E17 у мышей), и позднюю фазу, связанную с физиологической гибелью клеток, совпадающую с иннервацией мишеней (Frade et al., 1997, Perry and Cowey, 1982, Perry et al., 1983). Эта вторая фаза гибели может быть просто "fine tuning" клеточной гибели, гарантирующей, что только мишени, иннервированные клетками, будут выживать (Galli-Resta and Ensini, 1996).
Дегенерация RGC у мышей обнаруживается вплоть до P11, но пик приходится между P2-P5 (Young et al., 1984). Подсчет ON аксонов показал, что 50% вновь генерированных RGCs у крыс погибает в течение первой недели, вскоре после достижения ими мишени superior colliculus и латерального geniculate ядра (Perry et al., 1993). Это, однако, может быть существенной недооценкой общего количества элиминированных RGCs, т.к. миграция вновь генерируемых RGCs к их слою происходит в течение нескольких дней и многие из них подвергаются апоптозу до завершения миграции всей популяции. Анализируя элиминацию RGCs разными датами возникновения во время эмбриогенеза, приблизительно можно предположить, что до одного миллиона RGCs подвергаются онтогенетической клеточной гибели, т.е. до 90% RGCs подвергаются PCD во время развития RGC (Galli-Resta and Ensini 1996). В этом сообщении также было отмечено существование временных взаимоотношений между нейрогенезом и гибелью индивидуальных нейронов. Эти "часы клеточной гибели" указывают на то, что онтогенетическая гибель RGCs крыс происходит в течение 5 дней их генеза, независимо от времени из появления. Это также утверждает, что вновь возникшие клетки, по крайней мере, в течение трех дней мигрируют в GCL и остаются здесь не более двух дней, прежде чем погибнут. Однако, эти находки противоречат таковым для сетчатки мышей, для которых отмечается, что клетки в GCL действительно экономятся сразу же после из возникновения (Farah and Easter, 2005).

Neurotrophic factors


Экспрессируемые в сетчатке и первичных зрительных центрах, нейротрофные факторы могут регулировать жизнеспособность, дифференцировку и регенерацию нейронов посредством аутокринных, эндокринных и паракринных свойств (Herzog and von Bartheld, 1998). В попытке выжить во время развития RGCs действительно конкурируют за эти полипептидные факторы, поставляемые структурами мишенями, такими как superior colliculus. Если аксональные проекции RGC неспособны правильно иннервировать намеченные мишени, то они элиминируются из-за лишения трофических факторов, необходимых для выживания. Однако, возможно также, что нейротрофные факторы могут происходить локально и из окружающих клеток (Herzog and von Barthold 1998). В самом деле, RGCs сами по себе могут синтезировать нейротрофные факторы и было продемонстрировано, что RGCs крыс могут испытывать влияние со стороны локальных нейротрофных выпусков внутри сетчатки (von Bartheld et al., 1996, Spalding et al., 2005, Wang et al., 2002). Нейротрофные факторы. участвующие в онтогенетическом апоптозе, включают семейство neurotrophin, представленное 6 родственными факторами; Brain Derived Neurotrophic Factors (BDNF), Nerve Growth Factor (NGF), Neurotrophin-3, Neurotrophin-4/5, NeuroTrophin-6 и NeuroTrophin-7. Эти трофины могут соединяться с двумя семействами трансмембранных рецепторов, включая TRK рецепторы из семейства tyrosine kinase, для этого они обладают строгим сродством, и внеклеточный домен из p75 neurotrophin рецепторов (Kaplan and Miller, 2000). Эти семейства рецепторов могут непосредственно взаимодействовать др. с др., делая возможным даленйшее перекрестное общение между этми путями (Bibel and Barde, 2000).

Role in early programmed cell death


Ранняя PCD, по-видимому, испытывает строгое влияние со стороны нейротрофинов, таких как NGF и BDNF, среди прочего. RGCs не только обладают рецепторами к BDNF (Garner et al., 1996), но также обладают и BDNF белком и РНК на ст. E4 (Frade and Barde, 1999). Далее было подтверждено, что экзогенное воздействие BDNF на эмбрионов кур in ovo снижает раннюю PCD в RGCs на E6 и увеличивает аксональную популяцию на ст. E9 (Frade et al., 1997, Frade et al., 1996). Отмечается, что BDNF в действительности не увеличивает продукцию RGC на E6 per se, но он увеличивает количество клеток, достигающих vitreal поверхности, тем самым создается впечатление. что мигрирующие RGCs избегают гибели. Более того, наблюдалось, что популяция клеток GCL увеличивается на 90% на E9, с 60% увеличением количества аксонов в зрительном нерве. Однако, это уменьшение гибели RGC вследствие воздействия BDNF может просто быть временной остановкой исполнения, т.к. было показано, BDNF нулевые мыши имеют нормальные количества RGCs при рождении (Cellerino and Kohler, 1997). В противоположность задокументированным эффектам увеличения жизнеспособности от NGF в др. нейрональных онтогенетических примерах, аккуратная аксональная иннервация может заставлять NGF стимулировать раннюю клеточную гибель early RGC. Учитывая эту противоположную способность neurotrophin внутри разных систем, было предположено, что neurotrophins скорее всего могут быть обозначены как "neuromodulators" (Yuan and Yanker, 2000).
NGF может непосредственно активировать гибель RGC путем соединения с p75 и активирования ложного внутриклеточного пути, участвующего в продукции ceramide (Frade and Barde, 1997, Carter and Lewin, 1997). Дальнейшие доказательства показывают, что вовлечение NGF включает использование anti-NGF и anti-p75NTR антител для ингибирования гибели RGC на ст. E6 в сетчатке кур (Frade and Barde, 1999, Frade et al., 1996). Более того, ранняя PCD ингибируется у NGF-/- мышей и у p75NTR-/- эмбрионов мышей (Frade et al., 1996, Frade and Barde, 1999).


Fig. 2. (i) Schematic of the adult rat retina at P60, with (ii) corresponding Hoechst stained nuclei of the adult rat retina at P60. Three of the layers within the rat adult rat retina contain cell bodies, including the ganglion cell layer (GCL), which is the innermost nucleated layer of the retina. Though mostly containing retinal ganglion cells (RGCs), up to 50% of the cells within the rat GCL may be amacrine cells. Conversely, the somata of some RGCs are displaced from the GCL to the inner plexiform layer. RGCs form synaptic connections with neighbouring bipolar and amacrine cells. Axonal projections from RGCs, constituting the Nerve Fibre Layer (NFL), travel to the optic disc where they converge to form the optic nerve.

NT3 также может выполнять роль по протекции RCG во время развития. Анти-NT3 антитела, как было показано, существенно редуцируют популяцию RGC на E6 в сетчатке эмбрионов кур и только 35% их присутствует на E16 (Bovolenta et al., 1996).

Role in late programmed cell death


Роль BDNF на поздних стадиях PCD остается спорной. Ранниее эмбриональные RGCs могут выживать без BDNF, но они оказываются зависимыми от BDNF in vitro на E11, в то же самое время они могут становиться зависимыми от мишенями продуцируемых трофических веществ in vivo (Rodriguez-Tebar et al., 1989). Исследования показали, что BDNF поддерживает жизнеспособность развивающихся E17 RGCs крыс in vitro в течение, по крайней мере, 4 дней, тем самым показывая, что RGCs, изолированные во время этого периода целенаправленной иннервации мишеней, чувствительные к BDNF (Johnson et al., 1986). Внешнее воздействие BDNF на superior colliculus новорожденных хомячков на ст. P3 снижают количества апоптических RGCs в 13-15 раз спустя 20 ч (Ma et al., 1998). Более того, BDNF увеличивает жизнеспособность P2 RGCs свыше 48 ч (Kashiwagi et al., 2000). Было предположено, что потребности выживания развивающихся RGCs меняются во время иннервации (Ma et al., 1998). Кратковременное in vitro выживание E18 RGCs крыс, обработанных только BDNF, составляло в целом только около 20%, в то время как почти 80% этих RGCs выживало после добавления tectal-кондиционированной среды. Это указывает на важность др. tectal факторов в выживании RGC помимо влияния нейротрофина. Интересно, однако, что не обнаружено чувствительности к трофическим факторам, если внутриклеточный cAMP увеличен

Fig. 3. Retinotectal projections of retinal ganglion cells (RGCs) in the vertebrate. RGCs process and project information from the retina along the optic nerve and optic tract to visual centres such as the superior collicullis, with 30% of RGCs in the rat sending collaterals to the lateral geniculate nucleus. These retinal projections map the distinct topography of the retina to the visual centres.

Чтобы усложнить дело, BDNF-/- имеют нормальные количества RGCs при рождении (Cellerino and Kohler, 1997). Одним из возможных объяснений является то, что защитный эффект BDNF является в основном временным. Тот факт, что экзогенное воздействие на эмбрионов кур BDNF в период онтогенетической гибели RGC не редуцирует PCD ещё больше подтверждает эту теорию (Drum et al., 1996). Т.о., роль нейротрофных факторов на поздних стадиях PCD далека от ясности и неясно, почему нейротрофные факторы являются критическими для жизнеспособности RGC во время всего этого периода гибели RGC death (Bahr, 2000). Полученные данные показывают позитивные эффекты на выживаемость RGCs множественных факторов, указывая тем самым на сложные взаимоотношения между нейротрофическими факторами, управляющими таким развитием. Возможно, что эффекты одиночных нейротрофинов на жизнеспособность RGC не могут быть достаточно оценены просто путем анализа нокаутных моделей или использованием соотв. антител, т.к. единственный негативный механизм может просто активировать др. путь.

Developmental apoptosis of retinal ganglion cells


Апоптоз может быть определен как зависимая от энергии форма автономной гибели клеток, при которой клетка отвечает за свою собственную судьбу. В самом деле, доказано, что живые клетки содержат врожденную геномную способность к само-деструкции в ответ на приказание различных стимулов (Bowen, 1993). Со склонностью происходить в одиночных клетках, часто среди здоровых соседей, апоптоз обладает определенными биохимическими и морфологическими характеристиками, такими как конденсация хроматина, сморщивание клеток, образование пузырьков плазматической мембраны, фрагментация ДНК и наконец, фрагментация клетки в покрытые мембранами пузырьки, называемые апоптическими телами (Kerr et al., 1972) (Fig. 4). В конечном итоге эти клетки фагоцитируются с помощью макрофагов или соседних клеток. Такие последствия контрастируют с теми, что обнаруживаются при некротической гибели клеток, которая наступает в ответ на патологический инсульт. Некротические клетки раздуты, с разрушенными внутриклеточными органеллами, разрушенными лизосомами и плазматическими мембранами и вызывают генерализованное воспаление ткани. Однако, эти две формы клеточной гибели не обязательно взаимоисключающие и могут занимать противопложные места одного и того же спектра (Vecino et al., 2004, Spalding et al., 2005). В самом деле, растут доказательства варьирующих уровней взаимодействия между разными медиаторами гибели, указывающие на способность переключения с одного способа гибели на др. (Sanvicens et al., 2004, Gomez-Vicente et al., 2005, Bahr, 2000).
Морфологические изменения, характерные для апоптоза, отмечены в ядерных слоях развивающейся сетчатки (Young et al., 1984). Такие наблюдения включают обнаружение ядерной конденсации, пикноз и фагоцитоз в GCL во время первой недели жизни. Биохимические техники для измерения фрагментации ДНК и изменений плазматических мембран, ассоциированных с апоптозом, подтвердили, что механизмом онтогенетической гибели RGC преимущественно является апоптоз. Причина такой клеточной гибели в развивающихся ретинальных ганглиолярных клетках является соответствующей её назначению в общем созревании млекопитающих: её целью является удаление ненужных структур (филогенетический апоптоз), она предназначена для контроля количества клеток (гистонгенетический апоптоз) и упомянутая ранее роль в скульптурировании сетчатки (морфогенетический апоптоз) (Cecconi et al., 1998).

Bcl-2 family and the mitochondrion


Митохондрии играют важную роль в апоптозе (Fig. 5). В дополнение их повседневной роли как силовой станции клетки, эти органеллы с двойными мембранами содержат также множество белков, которые обладают caspase зависимыми и независимыми ролями, включая cytochrome c, apoptosis inducing factor (AIF), Smac/Diablo, endonuclease G и Omi/HtrA2.
Внутри ЦНС и сетчатки bcl-2 гена семейство белков тонко контролируют mitochondrial membrane permeabilization (MMP) и высвобождение белков. вызывающих апоптоз. Это семейство может быть подразделено на три основные подгруппы на основании их функции и структуры. В первой группе, Bcl-2, Bcl-XL, Mcl-1, A1 и Bcl-w обладают анти-апоптической активностью и обычно содержат 4 законсервированных мотива, известных как Bcl-2 homology (BH) домены. Bcl-2 и Bcl-XL, как было показано, участвуют в контроле за высвобождением cytochrome c из митохондрий (Kluck et al., 1997, Yang et al., 1997, Vander Heiden et al., 1997). Эти два белка могут формировать гетеродимеры с Bax и Bak посредством BH доменов, чтобы нейтрализовать их проапоптическую функцию.
Вторая группа состоит из мультидоменовых про-апоптических белков Bax, Bak и Bcl-XS, которые обладают BH1, 2 и 3 доменами. Значение Bax и Bak белков было продемонстрировано Bax/Bak двойными нокаутами. Большинство Bax/Bak дефицитных животных не подвергаются достаточному онтогенетическому апоптозу и погибают перинатально (Lindsten et al., 2000). Mouse embryonic fibroblasts (MEFs), изолированные от таких эмбрионов не способны к MMP и последующему апоптозу (Wei et al., 2001). После олигомеризации эти BCL-2 белки затем вставляются в наружную митохондриальную мембрану, образуя поры, позволяющие проходить белкам в цитозоль.
Третья группа, группа с единственным BH3 доменом, включает Bim, Bid, Bik, Bad, DP5/Hrk, Spike, Puma и Noxa (Danial and Korsmeyer, 2004). Эти белки действуют выше MMP как стражи специфических апоптических стимулов. BH3-only могут регулироваться как на транскрипционном, так и пост-трансляционном уровнях в нейронах, чтобы индуцировать апоптоз (Ham et al., 2005, Ley et al., 2005, Willis and Adams 2005). Путем устранения определенных членов анти-апоптического Bcl-2 семейства, которые связывают Bax/Bak, белки BH3 способствуют высвобождению Bax, разрешая ему индуцировать проницаемость митохондрий (Chen et al., 2005, Letai et al., 2002). Это позволяет Bax/Bak олигомеризоваться и индуцировать митохондриальную проницаемость. Было продемонстрировано, что ингибирование анти-апоптических белков достаточно, чтобы индуцировать апоптоз несмотря на присутствие непосредственного активатора Bax или Bak, таких как Bid or Bim (Kuwana et al., 2005). Кстати, исследования нокаута показали, что ни один из BH3-only белков не достаточен для возникновения клеточной гибели в нервной системе, указывая тем самым, что может быть определенный уровень перекрывания среди белков во время этого периода (Akhtar et al., 2004).
Про- и анти-апоптические Bcl-2 белки дифференциально экспрессируются в развивающейся и зрелой ЦНС. Bax экспрессируется на высоком уровне при начале развития клеточной гибели, с последующим подавлением в зрелых нервных тканях (Vekrellis et al., 1997). Исследования bax нокаутных мышей продемонстрировало, что отсутствие этого гена, способствующего гибели, во время развития, оказывает слабый, но различимый эффект на взрослую сетчатку, приводя к утолщению внутреннего слоя нейробластов и увеличению количества клеток в GCL (Pequignot et al., 2003). Было сообщено, что обильная клеточная гибель наблюдается с E11.5 в развивающихся слоях как дикого типа, так и Bax-/- мышей и продолжается вплоть до P1 (White et al., 1998). Однако, это исследование в дальнейшем установило, что TUNEL позитивные клетки по существу отсутствуют в RGC слое у Bax нулевых мышей между P1 и P4, приводя к более

Fig. 4. Cell undergoing apoptosis. Apoptosis is marked by distinctive biochemical and morphological characteristics. These include chromatin condensation, cell shrinkage, blebbing of the plasma membrane, DNA and nuclear fragmentation and finally, cell fragmentation into membrane bound vesicles termed "apoptotic bodies", which are then phagocytosed by macrophages or neighbouring cells.

в двое большему количеству RGCs в постмитотической сетчатке. Очевидно, что эмбриональная онтогенетическая гибель клеток со ст. E11.5 является Bax-независимойt, Bax, по-видимому, необходим для онтогенетической гибели RGC в постнатальной сетчатке. Эти находки проливают свет не только на фундаментальное значение PCD для конструкции нормальной, функциональной сетчатки, но и также убеждают в вовлечении Bax в процесс онтогенетической гибели RGC (Mosinger Ogilvie et al., 1998, Pequignot et al. 2003, White et al., 1998). У Bax-/-Bak-/- двойных нокаутных мышей, гистология выявляет повышенные количества нейронов внутри GCL из зрелой сетчатки по сравнению с диким типом (Hahn et al., 2003). В самом деле, на ст. P7, периоде пика онтогенетического апоптоза, было выявлено, что имеется почти полное отсутствие TUNEL позитивных апоптических клеток в сетчатке этих нокаутных моделей. Bcl-2 экспрессируется также на высоком уровне во время эмбрионального и постнатального развития ЦНС, включая GCL, но снижение экспрессии совпадет со зрелостью (Chen et al., 2004, Isenmann et al., 1997, Levin et al., 1997). Мыши, дефицитные по Bcl-2 жизнеспособны при рождении и некоторые могут доживать до взрослого периода, но большинство погибает до ст. P14 (Michaelidis et al., 1996). Bcl-2 дефицитные мыши обнаруживают потерю примерно трети своих RGCs после периода естественно возникшей гибели клеток (Cellerino et al., 1999), указывая тем самым на важную роль Bcl-2 в выживании нейронов после периода онтогенетической PCD, но не для самой онтогенетической PCD. Мыши, дефицитные по анти-апоптическому гену, Bcl-XL, испытывают эмбриональную летальность со ст. E13 из-за массивного апоптоза недоразвитых нейронов (Motoyama et al., 1995). Т.к. нет описаний фенотипа сетчатки, то эти находки указывают на критическую роль Bcl-XL в модуляции онтогенетического нейронального апоптоза.

Executioners of retinal ganglion cell death


Семейство cysteine aspartyl-specific proteases, наз. caspases, которых существует 15 у млекопитающих, является центральным регулятором апоптоза. Эти энзимы присутствуют в клетках в виде неактивных зимогенов и становятся активными в результате протеолитического процессинга или индуцированной близости (proximity). Каспазы, будучи активированными, участвуют в упорядоченном каскаде, кульминацией которого является протеолиз ключевых структурных и ядерных компонентов и в кончнои итоге деструкция клетки (Earnshaw et al., 1999). Идентифицированы два пути, которые активируют один из крупных исполнителей клеточной гибели, caspase-3. Они включают внешний путь, с вовлечением способствующих гибели рецепторов и лигандов и внутренний путь, который регулируется серией специфических способствующих гибели молекул, высвобождаемых в митохондриях (Fig. 5).
Внешний (death receptor) путь связан с активацией death рецепторов на клеточной поверхности, которые являются членами сверхсемейства tumour necrosis factor (TNF) рецепторов. Эти рецепторы содержат цитоплазматический death домен, который будучи активированным путем связывания внешнего фактора, формирует смерть-индуцирующий сигнальный комплекс



Fig. 5. Pathways of apoptosis. There are two major apoptotic pathways in the cell. The extrinsic pathway (left) involves the binding of extracellular ligands to death-promoting receptors, resulting in the formation of a death inducing complex (DISC). DISC, through the adaptor Fas-associated death domain (FADD) protein, then recruits procaspase-8, which in turn activates caspase-8. The intrinsic pathway (centre) is regulated by a series of specific death-promoting molecules released from the mitochondrion. Pro and anti-apoptotic BCL-2 family members compete at the mitochondrion surface to control the release of cytochrome-c. Once released, cytochrome-c associates with Apaf-1 and procaspase-9, in a dATP dependent manner, to form the apoptosome, which then activates caspase-9. The extrinsic and intrinsic pathways share a common end point at the level of caspase-3 activation. Interaction between these pathways is provided by caspase-8 triggered cleavage of Bid. Interaction of Bid with Bax or Bak at the mitochondrial outer membrane results in cytochrome-c release. The anti-apoptotic BCL-2 family can prevent such release by direct interaction with Bax and/or Bak. Further caspase-independent pathways (right) may occur through the release of apoptogenic molecules such as Apoptosis-Inducing Factor (AIF), Endonuclease G (EndoG) and Omi/HtrA2.

(DISC) в клетках (Ashkenazi and Dixit, 1998). Этот комплекс может активировать procaspase-8 с помощью димеризации посредством адапторной молекулы Fas activated death domain (FADD) (Boatright et al., 2003). Активированная caspase-8 может затем расщеплять и запускать исполнительную procaspase-3 (Ashkenazi and Dixit, 1998).
Внутренне присущий (митохондриальный) путь активируется с помощью различных апоптических стимулов и использует высвобождение cytochrome-c из митохондрий в цитозоль, которая в свою очередь активирует протеолитический каскад (Li et al., 1997). Cytochrome c взаимодействует с C-терминальными WD-40 повторами адапторной молекулы Apaf-1, вызывая конформационные изменения, которые делают возможным связывание dATP/ATP. Возникший в результате мультимерный комплекс затем рекрутирует caspase-9, чтобы сформировать активный голоэнзим, apoptosome (Jiang and Wang, 2004, Acehan et al., 2002). Caspase-9 расщепляет каспазы убийцы, такие как caspase-7 и caspase-3. Активированная caspase-3 расщепляет caspase-2 и caspase-6, при этом caspase-6 оказывается способной расщеплять caspase-8 и -10 (Slee et al., 1999).
Взаимодействие между внешними и внутренними путями обеспечивается с помощью укороченных Bid молекул посредством действия caspase-8. Этот энзим, как было установлено, расщепляет Bid, приводя к последующей транслокации С-терминального конца в митохондрии и способствуя высвобождению cytochrome-c посредством активации Bax (Li et al., 1998, Luo et al., 1998). Активация каспаз может быть эндогенно ингибирована за счет действия inhibitor of apoptosis proteins (IAPs), среди которых XIAP, c-IAP1 и c-IAP2 могут непосредственно ингибировать каспазы. Путем использования разных механизмов, XIAP ингибирует caspases -3, -7 и -9 посредством их baculovirus IAP repeat (BIR) доменов (Salvesen and Duckett, 2002). IAPs сами по себе могут противодействовать своему действию посредством IAP antagonist белков, таких как Smac, его мышиного гомолога DIABLO и serine protease Omi/HtrA2. Эти белки, которые высвобождаются вместе с cytochrome c из ставших проницаемыми митохондрий, могут высвобождать каспазы от IAPs путем соединения с BIR доменами посредством AVP (I/S) связывающего мотива (Du et al., 2000, Verhagen et al., 2000, Suzuki et al., 2001, Salvesen and Duckett, 2002).
Каспазы играют жизненно важную роль в некоторых случаях гибели взрослых RGC (McKinnon et al., 2002, Kermer et al., 1999). Имеется также множество доказательств, подтверждающих центральную роль каспаз в клеточной гибели в GCL. Анализ нокаутных животных оказался фундаментальным в идентификации роли Apaf-1 и членов семейства каспаз в онтогенетическом апоптозе нейронов in vivo. Apaf-1 нулевые мыши характеризуются гиперплазией сетчатки и изменениями хрусталика (Cecconi et al., 1998), тогда как caspase-9 нулевые мыши обнаруживают избыточное накопление большинства клеток ЦНС (Hakem et al., 1998). Мыши. лишенные caspase-3, характеризуются пониженным апоптозом в нейронах ЦНС, что приводит к гипертрофии головного мозга и преждевременной гибели (Kuida et al., 1996). Пока это делает невозможным изучение эффектов устранения caspase-3 в зрелой ЦНС сетчатке и в отношении онтогенетического апоптоза. Недавнее исследование Zeiss с коллегами роли caspase-3 в постнатальном развитии сетчатки (Zeiss et al., 2004) показало, что активные caspase-3 иммуно-позитивные клетки обнаруживаются в развивающемся GCL новорожденных caspase-3 достаточных мышей. Однако, отмечено, что сходное окрашивание отсутствует в GCL caspase-3-/- мышей, несмотря на присутствие погибающих клеток. Отмечается также, что устранение caspase-3 не полностью ингибирует онтогенетический апоптоз, а вызывает лишь временную задержку, указывая тем самым на существование альтернативного, возможно компенсаторного, caspase-3 независимого пути. Было также обнаружено, что каспазы необходимы для развития RGC в эмбриональной сетчатке кур. Исследования ранней PCD в нейроэпителии сетчатки у эмбрионов кур на ст. E2-E6 предоставили доказательства в пользу роли caspase-3 в онтогенетическом апоптозе (Mayordomo et al., 2003). В этом исследовании TUNEL-позитивные клетки окрашивали на активную caspase-3 и использовали каспазные ингибиторы z-DEVD-fmk и Boc-Dfmk, наблюдалось уменьшение количества TUNEL позитивных клеток на 50% спустя 6 ч. Продолжение воздействия этих ингибиторов приводило к незначительному расширению центральной части нейральной сетчатки с одновременным увеличением GCL и повышением количества RGC. Эти результаты демонстрируют появление зависимой от каспазы PCD в раннем эмбриональном развитии сетчатки. Более того, анализ выявил присутствие на P2-6 расщепленной caspase-3 и -9 в TUNEL позитивных клетках развивающегося ганглиолярного слоя клеток у мышей (McKernan et al., 2006) (Fig. 6 (i)). Т.о., очевидно, что прирожденные митохондриальный путь активируется во время постнатального развития.
Интересно, что чувствительность RGCs к апоптозу индуцируется с помощью axotomy в зависимости от возраста. Сообщалось, что в то время как гибель RGC у взрослых крыс in vivo после axotomy не обнаруживается вплоть до 3 после операции и не достигает пика вплоть до 7-го дня, гибель RGC в сетчатке новорожденных после удаления superior colliculus наивысшая спустя 24 ч и завершается спустя 48 ч (Spalding et al., 2005). Исследования в этой лаб. не только выявили возраст-зависимую чувствительность к онтогенетической гибели клеток в GCL мыши в модели эксплантов сетчатки, но и установили сходную чувствительность к гибели после

Fig. 6. Developmental apoptosis and differential susceptibility of the mouse ganglion cell layer (GCL) to cell death. (i) Immunohistochemical staining of P6 retinal sections for cleaved caspase-3 shows evidence of the active caspase fragment (black arrows) in the GCL. However this staining is not present within the GCL at P60. (ii) Positive TUNEL staining indicates that P6 cells in the GCL are markedly more susceptible to apoptotic cell death following 6 hours of treatment with 1 мM calcium ionophore A23187 (white arrows), than A23187 treated P60 cells. (iii) Spontaneous developmental cell death occurs in the GCL of the P6 retinas, as evidenced by the presence of TUNEL positive cells (white arrows). However this developmental death is absent at P60. (iv) Hoechst stained nuclei of P6 and P60 retinal sections are shown.

axotomy и внешних цитотоксических стимулов в этой модели (McKernan et al., 2006) (Fig. 6(ii)). Более того, мы установили, что приблизительно 90% изолированных RGCs крыс внутри культуры диссоциированных клеток сетчатки на ст. P6 чувствительны к апоптической гибели in vitro после воздействия calcium ionophore, A23187, в течение 24-час. периода. Однако, их взрослые аналоги оказались более резистентными к таким стимулам (unpublished data). Эти различия в восприимчивости коррелируют с онтогенетическим подавлением про-апоптических белков, включая Apaf-1 и caspase-3 во взрослом GCL (McKernan et al., 2006). Сходный феномен был отмечен у модельных крыс с травматическими повреждениями головного мозга, где эти белки заметно уменьшались в зрелом кортексе (Yakovlev et al., 2001). Т.о., реактивация этих генов необходима для апоптических повреждений нейронов во взрослом головном мозге. Эти результаты, сходные с находками этой Лаб., подтверждают, что появляются развивающиеся RGCs, предназначенные умереть в соответствии с адекватным физиологическим развитием в GCL (Fig. 6(iii)). Однако, как только это развитие завершается, то этот default апоптический путь закрывается и взрослые нейроны затем адоптируют защитный механизм против любых повреждающих ударов (Benn and Woolf, 2004).
В то время как caspases четко играют центральную роль во многих примерах апоптоза, накапливаются доказательства, что апоптоз может возникать при определенных условиях caspase-независимым способом. В то время как ряд альтернативных протеаз вызывает разрушение клеток, приводя к альтернативной морфологии по отношению к обычной зависимой от каспаз клеточной гибели, редки доказательства сходного проявления в онтогенетической гибели RGC (Leist and Jaattela, 2001, Tezel and Yang, 2004). Недавнее исследование Spalding et al. показало, что устранение superior colliculus у новорожденных крыс (P4) вызывает заметную гибель RGC в течение 24 ч. Т.к. эта гибель не блокируется специфическими или общими ингибиторами каспаз, то авт. предположили присутствие независимого от каспаз пути гибели у новорожденных мышей (Spalding et al., 2005).

Conclusion


The retina represents one of the most accessible aspects of the central nervous system for analysis and research and recent years have witnessed the elucidation of many of the pathways central to neurogenesis and developmental apoptosis within the nascent RGC population. However certain fundamental areas still remain to be explored in full and future investigations will need to examine the roles of both neurotrophins and caspase independent pathways, in order to gain a more transparent perspective on RGC growth patterns.

Summary


This review examines the maturation of the retinal ganglion cell (RGC) population within the nascent retina. Apoptosis, a form of programmed cell death prevalent throughout the developing central nervous system (CNS), is evident in the growth of RGCs within the ganglion cell layer. These cells provide an accessible and illuminating platform to elucidate the apoptotic pathways present in the developing CNS and the role this form of cell death plays in RGC growth. This article focuses on the seminal stages of RGC development and the role played by neurotrophic factors and apoptosis in this process.
Сайт создан в системе uCoz