Посещений:
Редактирование РНК и РНК Интерференциея

Роль ADAR

Editor meets silencer: crosstalk between RNA editing and RNA interference
Kazuko Nishikura
NATURE REVIEWS | MOLECULAR CELL BIOLOGY VOLUME 7 | DECEMBER 2006 | 919-931 |doi:10.1038/nrm2061

The most prevalent type of RNA editing is mediated by ADAR (adenosine deaminase acting on RNA) enzymes, which convert adenosines to inosines (a process known as A→I RNA editing) in double-stranded (ds)RNA substrates. A→I RNA editing was long thought to affect only selected transcripts by altering the proteins they encode. However, genome-wide screening has revealed numerous editing sites within inverted Alu repeats in introns and untranslated regions. Also, recent evidence indicates that A→I RNA editing crosstalks with RNA-interference pathways, which, like A→I RNA editing, involve dsRNAs. A→I RNA editing therefore seems to have additional functions, including the regulation of retrotransposons and gene silencing, which adds a new urgency to the challenges of fully understanding ADAR functions.

ADAR
An adenosine deaminase that catalyses an RNA-editing reaction whereby an adenosine is converted to an inosine.

Alu repeat
A dispersed, moderately repetitive DNA sequence found in the human genome with ~1.4 million copies. The sequence is ~300 base pairs long. The name Alu comes from the restriction endonuclease (AluI) that cleaves the sequence.

LINE
A long interspersed element (LINE) sequence that is typically used for non-long terminal repeat retrotransposons.

Non-coding RNA
RNA that is transcribed from DNA, but that is not translated into protein. Introns, 5' and 3' untranslated regions of mRNA, antisense transcripts (RNAs transcribed from the antisense strand of DNA), siRNA, miRNA, RNAs transcribed from repetitive sequences, tRNA,rRNA, small nuclear (sn)RNA and small nucleolar (sno)RNA are all non-coding RNAs.

Retrotransposon
A mobile genetic element; its DNA is transcribed into RNA, which is reverse-transcribed into DNA and then is inserted into a new location in the genome.

RNA interference (RNAi).
A post-transcriptional gene-silencing process in which double-stranded (ds)RNA triggers the degradation of homologous mRNA. Degradation of the target mRNA is induced by siRNAs that are derived from long dsRNA.

Small interfering RNA (siRNA).
A small (19–23 base pair) non-coding double-stranded (ds)RNA that is processed from a longer dsRNA. Such non-coding RNAs hybridize with mRNA targets, and confer target specificity to the silencing complexes in which they reside.

microRNA (miRNA).
A small (19–23 nucleotide) single-stranded RNA that is processed from a precursor that consists of a short double-stranded (ds)RNA region, internal loops or bulges, and a loop. miRNAs have an essential role in suppressing translation or in the degradation of a target mRNA by the miRNA-mediated RNA- interference mechanism.

RNase III family
A group of double-stranded (ds)RNA-specific endonucleases that cleave dsRNA into short fragments with a 3' overhang and a recessed 5' phosphate on each strand. Drosha and Dicer, which are essential for RNA interference, belong to this family.

RNA-induced silencing complex(RISC).
This complex, which contains siRNAs and protein factors, such as AGO2, mediates the degradation of target mRNAs with high sequence complementarity to the siRNA. A similar complex that contains miRNA instead of siRNA (miRISC) suppresses the translation of target mRNAs with partial complementarity to the miRNA.

Deamination
The chemical process that replaces a primary amino group by a hydroxyl group, resulting in the conversion of one nucleoside to another.

Double-stranded RNA-binding domain (dsRBD).
This compact (~65 amino acids) domain with an α-β-β-β-α structure makes direct contact with the dsRNA. Proteins that function on dsRNAs contain a single or multiple dsRBDs.

Inositol hexakisphosphate (IP6).
A phospholipid that is widely distributed throughout the animal kingdom and is affiliated with a wide-ranging array of important physiological activities.

Z-DNA
A left-handed DNA form that is different from the A and B forms and that is believed to be involved in specific biological functions.

Expressed sequence tag (EST).
A single-pass, short read of complementary DNA that is generated from a transcribed region of the genome.

Single nucleotide polymorphism (SNP).
Typically a bi-allelic base-pair substitution, which is the most common form of genetic polymorphism.

SINE
Short interspersed, repetitive sequences, such as Aluu elements, generated by retrotransposition.

Nuclear speckle
An irregularly shaped nuclear organelle that can be visualized by immunofluorescence microscopy using anti-splicing-factor antibodies. Usually, ~25–50 speckles are present in the interphase mammalian nucleus, and they are thought to constitute storage and/or assembly sites for certain splicing factors.

rasiRNA
(repeat-associated siRNA). siRNA derived from repetitive sequences such as Alu or LINE retrotransposon elements or centromeric repeat sequences.

Wobble base pair
Non-G·C, A·U pairing, such as the thermodynamically less stable G·U, I·U pairing. Wobble base pairs, like Watson–Crick pairs, participate in forming helical regions in RNA folding.

piRNA
An siRNA-like, small non-coding RNA (26–30 nucleotides) that was identified as an RNA component that is complexed with Piwi-family proteins in testes.


Рис.1.  | Deamination of adenosine to inosine by ADAR.


Рис.2.  | Types of dsRBD-containing protein: ADAR-family proteins and proteins that are required for miRNA biogenesis.


Рис.3  |  Functional changes by A→I RNA editing of coding sequences.


Рис.4.  |  Extensive A→I RNA editing of non-coding repeat sequences.


Рис.5.  | Possible regulatory functions for non-coding RNA editing.


Рис.6.  | Interaction between RNA editing and RNA-interference pathways.


Рис.7.  | Regulation of microRNA processing and expression by RNA editing.


Box 1  | Different types of RNA editing

РНК транскрипты подвержены различного рода процессам созревания, таким как 5' capping, сплайсинг, 3' процессинг и полиаденилирование, после того как она транскрибируется с гена. Пост-транскрипционный процессинг первичных транскриптов является существенным для получения зрелых мРНК, которые готовы к трансляции в белки1. Редактирование РНК (RNA editing) является механизмом пост-транскрипционнного процессинга, который дает последовательности РНК, отличающиеся от тех, что кодированы геномом и тем самым вносит вклад в разнообразие генных продуктов. Существуют разные типы механизмов редактирования РНК, которые или добавляют или делетируют нуклеотиды или заменяют один нуклеотид на другой2 (BOX 1).
Тип редактирования РНК, который является наиболее преобладающим у высших эукариот превращает остаток adenosine (A) в inosine (I) в double-stranded (ds)РНК посредством действия ADAR (adenosine deaminase acting on RNA) энзимов 3-5. A→I редактирование коротких dsРНК, которые образовались между кодирующим экзоном и ближайшими интронными последовательностями, могут приводить к изменениям кодона и изменениям функции белка. Однако, недавно было установлено, что наиболее частыми мишенями для A→I редактирования РНК, по-видимому, являются длинные, но частично двунитчатые РНК, которые формируются из инвертированных Alu повторов, и long interspersed element (LINE) повторов. локализованных в интронах и untranslated regions (UTRs) мРНК6-9. Глобальное редактирование не кодирующих РНК может контролировать экспрессию генов, которые обладают этими повторяющимися последовательностями, происходящими из ретротранспозонов.
Пост-транскрипционная регуляция генов также может происходить за счет RNA interference (RNAi), эволюционно законсервированного феномена, который затрагивает молекулы dsРНК10,11. Small interfering RNAs (siRNAs) и microRNAs (miRNAs) являются некодирующими РНК, которые генерируются классом RNase III ribonucleases (в частности, Dicer и Drosha). Эти малые РНК инкорпорируются в RNA-induced silencing complex (RISC), который обеспечивает RNAi процесс12-16. Идея, что RNAi и пути A→I редактирования РНК могут конкурировать за общий субстрат dsРНК была впервые предложена Bass17. Недавние исследования показали. что предшественники РНК из определенных miRNAs в самом деле подвергаются A→I редактированию РНК18-21 и редактирование, по-видимому, регулирует процессинг и экспрессию зрелых miRNAs19. Более того, один из членов семейства ADAR у млекопитающих секвестрирует siRNAs, редуцируя тем самым эффективность RNAi22. Наконец анализ ADAR-нулевых линий Caenorhabditis elegans показал, что A→I редактирование РНК противодействует RNAi замалчиванию эндогенных генов и трансгенов23-25.

A→I редактирование РНК с помощью ADARs


Deamination of adenosine to inosine. Во время процесса A→I редактирования РНК, аденозин превращается в инозин за счет гидролитического деаминирования основания аденина26,27 (FIG. 1a). Трансляционная кухня считывает инозин, как если бы это был guanosine (G) (FIG. 1b), приводя к включению missense кодонов в мРНК. Обратная транскриптаза также считывает инозин как гуанозин; следовательно, A→I редактирование РНК транслируется в A→G замену, если анализировать уровень кДНК.
ADAR genes. Каталитическая реакция A→I редактирования РНК обеспечивается ADAR энзимами (FIG. 2a). ADARs были первоначально идентифицированы в яйцах и эмбрионах Xenopus laevis благодаря их активности раскручивать dsРНК28,29. Затем было установлено, что эта активность является фактически активностью dsРНК-специфической adenosine deaminase26,27. Первым ADAR геном у млекопитающих стал ADAR1 человека, он был клонирован благодаря биохимической очистке и микросеквенированию белка ADAR130, это привело к идентификации ADAR2 (REFS 31-33) и ADAR3 (REFS 34,35) (FIG. 2a). Продемонстрирована ферментативная активность ADAR1 и ADAR230-33. Активность ADAR3 ещё не установлена, хотя свойства функционального домена законсервированы и у этого члена семейства34,35.
Эти три ADARs законсервированы у позвоночных3-5. Лишь немногие ADAR гены были обнаружены у беспозвоночных. Drosophila melanogaster имеет только один ADAR2-подобный ген, Adar36, в то время как C. elegans имеет два ADAR гена, adar-1 и adar-2 (REF. 24) (FIG. 2a). Не идентифицировано ADAR генов в геномах растений, грибов или дрожжей.
Domain structure of ADARs. Члены семейства ADAR содержат общие структурные признаки (FIG. 2a). dsRNA-binding domain (dsRBD; ~65 аминокислот) делает возможным прямой контакт с dsRNA37 и необходим для связывания dsRNA. С-терминальная область ADAR содержит аминокислотные остатки, которые законсервированы у некоторых cytidine deaminases и, как предполагается, участвует в образовании каталитического центра ADAR30,38. Кристаллическая структура каталитического домена ADAR2 человека показывает, что His394, Glu396 и два Cys остатка, Cys451 и Cys516, в ADAR2 в самом деле участвуют в координации атома цинка и в формировании каталитического центра39. Наиболее удивительно, однако, то, что структурные исследования также выявили присутствие inositol hexakisphosphate (IP6), погруженного в сердцевину энзима, но расположенного очень близко к каталитическому центру. Молекула IP6 д. выполнять критическую роль во время реакции деаминации39.
ADAR gene expression and regulation. И ADAR1 и ADAR2 присутствуют во многих тканях, в то время как ADAR3 экспрессируется только в головном мозге30-35. Выявлены две изоформы ADAR1, полной длины ADAR1L и короткая, укороченная с N-конца ADAR1S40. Один из трех промоторов, которые управляют геном ADAR1, является интерферон индуцибельным и мРНК, транскрибируемая с этого промотора, управляет трансляцией ADAR1L, инициируемой с вышестоящего Met кодона41. Существенное увеличение в экспрессии ADAR1L происходит во время экспериментально индуцированного воспаления у мышей42. Две др. ADAR1 мРНК транскрибируются с конституитивных промоторов, управляя синтезом ADAR1S, который инициируется с нижестоящего Met кодона благодаря альтернативному сплайсингу и пропустку экзона, который содержит вышестоящий Met кодон (FIG. 2a). Экспрессия ADAR2 регулируется с помощью транскрипционного активирующего cyclic-AMP-response-element binding (CREB) белка43, а регуляторный механизм для ADAR3 неизвестен.
ADAR1L обнаруживается в основном в цитоплазме, тогда как ADAR1S локализуется в нуклеоплазме и ядрышке40,44,45. ADAR2 локализуется преимущественно в ядре44,46. Значение локализации в ядрышке ADAR1S и ADAR2 пока неясно. Клеточное распределение ADAR1L указывает на расположение его мишеней, возможно разного класса dsRNA субстратов (напр., siRNAs) в цитоплазме22.
Substrate and editing-site selectivity. Как межмолекулярные, таки и внутримолекулярные dsRNAs из более 20 base pairs (bp) (два витка спирали dsРНК) могут служить в качестве субстратов для ADAR47. Большинство adenosine остатков из длинной, с полностью спаренными основаниями dsРНК(более 100 bp) редактируется не избирательно. Напротив короткие dsРНК (~20-30 bp) или длинные, но частично dsRNA с неправильно соединенными основаниями, выпячиваниями и петлями (несовершенные dsRNAs) редактируются селективно; лишь немногие adenosines выбираются специфически, указывая тем самым, что вторичная структура ADAR субстратов диктует избирательность сайтов для редактирования48. Напр., сайт-избирательное A→I редактирование РНК происходит на несовершенной fold-back dsRNA структуре, которая образуется между последовательностью экзона около сайта(ов) редактирования и нижестоящей интронной комплементарной последовательностью, называемой editing-site-complementary sequence (ECS), в пре-мРНК glutamate receptor-2 (GluR2) и serotonin (5-HT) receptor-2C (5-HT2CR)49,50 (see FIG. 3 и ниже). ECS и dsRNA структура необходимы для редактирования 3,5,51,52.
Более того, некоторые сайты редактирования преимущественно редактируются только ADAR1 или ADAR2 (FIG. 3), указывая на существенные различия в их взаимодействиях РНК-субстрат, возможно посредством их dsRBDs (разных количеств и пространственного расположения между разными dsRBDs)53. Самостоятельные сайты избирательности ADAR1 и ADAR2 могут также обеспечиваться за счет функциональных взаимодействий между двумя мономерами из ADAR1 или ADAR2, т.к. такие взаимодействия возможно помещают специфические adenosine остатки относительно каталитического центра ADAR53,54.

Physiological significance of editing


Editing sites found in protein-coding regions. Ограниченное количество мишеней (~30 генов), таких как GluR49 и 5-HT2CR55 млекопитающихas, а также генов калиевого канала Kv1.1 (REF. 56) и D. melanogaster Na+-channel57 транскриптов, были идентифицированы в качестве объектов для A→I редактирования РНК в их кодирующих последовательностях51,52,56. Помимо клеточных генов транскрипты определенных вирусов, таких как вирус hepatitis delta, также редактируются58.
Наиболее часто редактирование РНК белок кодирующих генов меняет и диверсифицирует функции соотв. белков, как показано двумя наиболее изученными примерами (FIG. 3). Seeburg и др. идентифицировали всего 8 сайтов A→I редактирования РНК в кодирующих регионах рецепторов для некоторых GluR субъединиц49,51. Среди 8 сайтов редактирования сайт Gln/Arg (Q/R), расположенный в channel-pore-loop домене субъединицы GluR2, играет наиболее важную роль в функции ионного канала; редактирование этого одиночного сайта делает тетрамерный белок канала непроницаемым для Ca2+ (FIG. 3a). Emeson и др. установили всего 5 сайтов A→I редактирования РНК , расположенных на второй внутриклеточной петле или в G-protein-coupling домене 5-HT2CR55. Комбинаторное редактирование 5 сайтов приводит к изменениям в трех кодонах, Ile, Asn и Ile, что делает возможными 6 разных аминокислотных остатков, давая в результате экспрессию до 24 изоформ рецептора с измененными G-protein-coupling функциями. Напр., ответная реакция на лиганд (5-HT) рецептора, который был полностью отредактирован по всем 5 сайтам, снижается в 20 раз по сравнению с не редактированным рецептором (FIG. 3b).
RNA-editing deficiencies. Инактивация членов семейства ADAR имеет существенные физиологические последствия, описанные как фенотипические альтерации мутантов по гену ADAR, полученных у разных видов. Мухи с гомозиготной делецией в гене Adar обнаруживают изменения, связанные с головным мозгом, такими как отсутствие координированной локомоции и возраст-зависимая нейродегенерация36. Линии C. elegans, которые содержат гомозиготные делеции adar-1 и adar-2 обнаруживают дефектный хемотаксис24. Мыши с гомозиготной Adar2-нулевой мутацией погибают в течение нескольких недель после рождения. Эти мыши испытывают повторяющиеся эпизоды эпилептических судорог, которые возникают в результате избыточного притока Ca2+ и последующей гибели нейронов, вызываемой недоредактированной GluR2 пре-мРНК по сайту Q/R59, который является главной мишенью для ADAR2 (FIG. 3a). Наконец, инактивация ADAR1 ведет к эмбриональному летальному фенотипу, который обусловливается дефектным эритропоэзом и распространенным апоптозом60-62.
Болезни или патофизиологические состояния у людей также могут вызываться дисфункцией механизмов A→I редактирования РНК63,64. Гетерозиготность по функциональной нулевой мутации в гене ADAR1 приводит к dyschromatosis symmetrica hereditaria, пигментный гено-дерматоз человека с аутосомно доминантным наслендованием65. Недостаочность по редактированию РНК также лежит в основе нарушений ЦНС. Недоредактирование по сайту Q/R в GluR2 пре-мРНК (FIG. 3a) как полагают, ответственно за гибель при sporadic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) двигательных нейронов66, а также за апоптическую гибель нейронов во время ишемии, вызванной кардиальным арестом и нарушением кровотока в головном мозге43. Наконец, редактирование РНК 5-HT2CR может иметь определенное причинное отношение к нейропсихиатрическим нарушениям, таким как депрессия, т.к. паттерн редактирования 5-HTR мРНК (FIG. 3b) существенно изменен в префронтальном кортексе жертв суицида64,67,68.

Global editing of non-coding RNAs


Первоначальное выявление физиологически важных генов мишеней редактирования, таких как GluR2 и последующих изменений функций белка заинтересовало многих исследователей. Однако, ряд генов, которые были идентифицированы как мишени для редактирования имел намного меньше, чем предполагалось, inosine, как это может быть обнаружено в poly(A)+ РНК в головном мозге крыс69. Это привело к глобальным поискам A→I сайтов редактирования в кодирующих и не кодирующих областях.
Bioinformatics screening for A→I RNA editing sites. Некоторые группы разработали метод системного компьютерного анализа для идентификации по всему геному новых мест A→I редактирования РНК6-9. Обратная транскриптаза распознаёт inosine как если бы он был guanosine (FIG. 1b). Следовательно, сайт A→I редактирования РНК может быть идентифицирован, если последовательности кДНК или expressed sequence tag (EST) и соотв. геномные последовательности расположены на одной линии, учитывая, что остатки guanosine, reverse транскрибируемые с inosines, выявляются на месте геном закодированных adenosines (FIG. 4a). Стратегия скрининга заключается в алгоритме, чтобы выстроить в линию кластер A→G mismatches в кДНК или ESTs с геномной последовательностью и собрать их в кластеры, которые содержат полные или частичные гены в dsRNA областях (как это предсказывается присутствием комплементарных последовательностей на ограниченном расстоянии с помощью компьютерной программы). Это сопровождается элиминацией single nucleotide polymorphisms (SNPs) и оценкой качества данных. С помощью этой техники было идентифицировано значительно больше ожидаемого числа мест A→I редактирования РНК у человека6-9. Наиболее поразительным было то, что почти все эти новые сайты, которые были идентифицированы в транскриптоме человека (~15,000 сайтов, картированных ~2,000 разных генах) располагались в кодирующих областях, которые состояли из обратно ориентированных повторяющихся элементов (FIG. 4b), в основном Alu повторы (~90%) и некоторые LINE повторы (~10%), представляющие ~13% и ~21% генома человека, соотв.
На базе этого анализа было предсказано, что более 85% пре-мРНК возможно редактируются с подавляющим большинством, находящимся в интронах (~90%), и остальное в UTRs6. Сходная стратегия скрининга, которая ограничивалась кодирующими областями привела к идентификации лишь немногих редактируемых генов мишеней70,71. Всё это указывает на то, что большинство общих мишеней для ADARs находится в не кодирующих последовательностях транскриптома и что рекодирование белков в результате A→I редактирования РНК встречается редко.
Editing of repeat RNAs in non-primate species. Если глобальное редактирование не кодирующих Alu повторов в транскриптоме человека имеет некий биологический смысл, то можно бы ожидать, что то же самое верно и для др. организмов. Alu являются short interspersed elements (SINEs), которые являются уникальными для приматов. Однако, SINE элементы, которые рассматриваются как имеющие общее эволюционное происхождение с Alu повторами, д. существовать и в др. организмах. Поэтому компьютерный анализ был использован для поиска сайтов A→I редактирования РНК в базах данных EST мышей8,72. Уровень редактирования в SINEs мышей, по крайней мере, на порядок величин ниже по сравнению с Alu повторами у людей8,72. Эта существенная редукция частоты может быть объяснена различиями в длине повторов (~300 bp по сравнению с ~150 bp для Alu у людей и SINE у мышей, соотв.) и более высокой гомогенностью последовательностей среди Alu повторов у людей по сравнению с SINEs мышей8,72. Скрининг на сайты A→I редактирования РНК у крыс, кур и мух транскриптомов показал, что некодирующие повторяющиеся последовательности являются основными мишенями для ADARs, но частота редактирования снова значительно ниже, чем та, что наблюдается в транскриптомах людей72. Итак, хотя и имеется изменчивость в частотах редактирования у разных организмов, A→I редактирования РНК не кодирующих, повторяющихся последовательностей РНК по-видимому, является широко распространенным феноменом в царстве животных. i
Editing of non-coding antisense transcripts. Глобальный анализ транскриптома показал, что большие фракции генома продуцируют транскрипты как со смысловых, так антисмысловых нитей (70%). Большинство смысловых и антисмысловых пар транскриптов экспрессируются скоординированно, это указывает на то, что антисмысловая транскрипция может вносить вклад в контроль смысловых транскриптов73,74. Однако, неизвестно насколько часто смысловые и антисмысловые транскрипты млекопитающих формируют межмолекулярные dsRNAs. Т.к. A→I редактирование РНК происходит только на dsRNA, то глобальная проверка мест редактирования для смысловых и антисмысловых транскриптов д. предоставить необходимую информацию об образовании in vivo межмолекулярных дуплексов РНК, соответствующих парам смысловых и антисмысловых транскриптов (FIG. 4c).
Недавние биоинформационные исследования баз EST человека в отношении смысловых и антисмысловых пар РНК показали, что A→I редактирование РНК ограничено внутримолекулярными дуплексами РНК, что согласуется с обратно ориентированными повторами последовательностей или смысловых или антисмысловых РНК. Однако, A→I редактирование РНК не выявлено в регионах вне повторяющихся последовательностей75. PCR after reverse transcription of RNA (RT-PCR) и анализ секвенирования смысловых и антисмысловых РНК cyclin CNNM3, происходящих из интронной области, которая содержит два инвертированных Alu повтора, подтвердили, что как смысловые, так и антисмысловые РНК экстенсивно редактируются, то только в своих внутримолекулярных шпилечных (fold-back) dsRNA структурах76 (FIG. 4b). Не выявлено редактирования вне Alu последовательностей, это указывает на то, что образование межмолекулярных смысловых-антисмысловых дуплексов РНК не происходит76 (FIG. 4c). Интересно, что анализ эквимолярной смеси смысловых и антисмысловых CNNM3 РНК, которые были редактиированы in vitro с помощью рекомбинантного ADAR1 и ADAR2 снова показало, что A→I редактирование РНК ограничено внутримолекулярными fold-back структурами, это указывает на то, что в обратную сторону ориентированные Alu повторы преимущественно формируют внутримолекулярные dsRNA и что их взаимодействие с ADARs может предупреждать образование межмолекулярных дуплексов РНК76.

Implications of repetitive RNA editing


Какова роль глобального A→I редактирования РНК не кодирующих, повторяющихся последовательностей для контроля за генной экспрессией (FIG. 5a)? Изменение последовательности A→I, которое вносится в пре-мРНК, по-видимому, распознается с помощью кухни сплайсинга. Более того, некоторые клеточные активности, по-видимому, специфически распознают и функционируют на inosine-содержащей РНК (I-RNA) или dsRNA (I-dsRNA).
Modulating splicing sites? Inosine интерпретируется кухней сплайсинга как guanosine. A→I редактирование РНК д., следовательно, создавать или делетировать сплайс-донорские и -акцепторные сайты. Напр., высоко законсервированные канонические динуклеотидные последовательности распознавания в 5'-сплайс сайте, GU (AU→IU = GU), или в 3'-сплайс акцепторном сайте, AG (AA→AI = AG), могут создаваться за счет редактирования5. Само-редактирование интронных dsRNA последовательностей ADAR2 пре-мРНК в самом деле приводят к созданию альтернативного 3'-сплайс акцепторного сайта и к супрессии экспрессии ADAR277. Описан также ряд генов (напр., ADAR2b), которые содержат внутренние белок-кодирующие Alu экзоны32,33,78,79. Возможно, что некоторые из этих Alu экзонов генерируются за счет создания сплайс сайтов вследствие A→I редактирования РНК в Alu fold-back dsRNA (FIG. 5b). Несколько примеров исключения и включения Alu экзонов, обусловленных редактированием последовательностей Alu fold-back dsRNA было идентифицировано благодаря анализу последовательностей кДНК у человека6 (FIG. 5b). A→I редактирование РНК может, следовательно, влиять на альтернативный сплайсинг, чаще, чем это предполагалось, в интронах, которые содержат Alu fold-back dsRNA.
Nuclear retention? Аффинная хроматография, использующая I-RNA (т.е., синтетическую РНК, которая содержит множество inosines на месте guanosines), привела к идентификации led to the identification of p54nrb (REF. 80). p54nrb является локализованным в ядре многофункциональным белком, который взаимодействует с сплайс-фактором PSF и matrin-3 (ядерный матричный белок), и, как было предположено, играет роль в механизме по отлавливанию экстенсивно редактируемой РНК вируса polyoma в ядре80. Ранее не было известно, регулирует ли p54nrb удержание в ядре каких-либо клеточных РНК, которые содержат много inosines как результат A→I редактирования РНК. Однако, теперь кажется, что A→I редактирование длинных dsRNA создает инвертированные повторы SINEs, которые присутствуют в 3' UTR CTN-РНК, а их соединение с p54nrb может участвовать в регуляторном механизме, который удерживает эти РНК в ядерных speckles (известных также как кластеры межхроматиновых гранул)81. При стрессах, CTN-РНК расщепляется пост-транскрипционно и полиаденилируется de novo на альтернативном сайте, чтобы дать белок-кодирующую Cat2 мРНК, которая затем транслируется в катионные белки аминокислотного транспортера-281. Факторы, участвующие в механизме расщеплении и полиаденилировании de novo неизвестны (FIG. 5c).
Degradation? Описана активность ribonuclease, которая специфически расщепляет I-dsRNA82. Предпочтительное расщепление с помощью этой рибонуклеазы происходит на обеих нитях dsRNA, которая содержит множественные I·U пары оснований82. Рибонуклеаза является специфической для I-dsRNAs; т.к. dsRNAs, которые содержат Watson-Crick пары оснований, или dsRNAs, которые содержат G·U пары основания вместо I·U пар оснований, не расщепляются. Интересно, что Tudor staphylococcal nuclease (Tudor-SN), ассоциированный с RISC компонент, который лишен известной функции в механизме RNAi16, недавно был идентифицирован как потенциальная I-dsRNA специфическая рибонуклеаза или, по крайней мере, как существенный кофактор активности83. Хотя Tudor-SN находится в цитоплазме ооцитов X. laevis83, его клеточное распределение в соматических клетках ещё предстоит установить84. A→I редактирование РНК Alu или LINE fold-back dsRNA структур может, следовательно, приводить к деградации пре-мРНК с помощью Tudor-SN, это, в свою очередь, может контролировать экспрессию генов, которые обладают повторяющимися последовательностями (FIG. 5d).
Heterochromatic silencing? Возможное участие A→I редактирования РНК в механизме гетерохроматинового молчания было предположено после идентификации Vigilin в качестве др. клеточного фактора, который соединяется с I-RNAs85. Vigilin обнаружен в комплексах, которые содержат ADAR1, Ku86-Ku70 гетеродимер (ДНК-связывающие белки, которые участвуют в механизме репарации ДНК) и RNA helicase A (RHA). Vigilin локализуется в гетерохроматине, а гомолог D. melanogaster Vigilin, DDP1, оказывается существенным для молчания гетерохроматиновых генов у мух. RHA, как было предположено, обладает различными функциями, такими как разматывание dsRNA структур, сформированных вокруг экзон-интрон гена D. melanogaster Na+-канала, который также является одной из мишеней для A→I редактирования РНК57. Комплекс Vigilin-ADAR1-Ku-heterodimer-RHA рекрутирует ДНК-зависимый протеин киназный PKcs энзим, который фосфорилирует ряд мишеней, включая heterochromatin protein-1 (HP1). HP1 играет главную роль в механизме гетерохроматинового молчания85 (rev.86,87). Важность др. находок, описанных выше, касающихся образования комплекса Vigilin-ADAR1 и связывания I-RNAs с Vigilin, а также гетерохроматинового молчания, ещё предстоит определить (FIG. 5e).
Suppression of rasiRNA? Fold-back dsRNAs из ретротранспозонов C. elegans и D. melanogaster превращаются в siRNA-подобные молекулы - rasiRNAs, известные также как ассоциированные с повторами siRNAs - в зародышевых клетках. Как предполагается rasiRNAs понуждают к экспрессии ретроэлементы и защищают целостность генома в яйцах и ранних эмбрионах за счет RNAi-обусловленного механизма гетерохроматинового молчания86,88,89. Детали того, как rasiRNAs активирует механизм, неизвестны. Генерируют ли rasiRNAs и участвуют ли они в сходном RNAi-обусловленном механизме молчания у млекопитающих (rev. 86,90,91)? Многочисленные rasiRNAs, как недавно было идентифицировано в яйцеклетках мышей и у ранних эмбрионов, обнаруживают, что fold-back dsRNAs из последовательностей ретротранспозонов млекопитающих могут подвергаться процессингу с помощью rasiRNAs92. Более того, rasiRNAs , как сообщалось, деградируют репортерную мишень РНК, которая содержит повторяющийся элемент в 3' UTR, когда инъецировалась в ооциты мыши. Это указывает на то, что ретротранспозоны супрессируются посредством пути RNAi в ооцитах мышей92. Т.к. A→I редактирование РНК изменяет структуру fold-back dsRNA, то процессинг rasiRNAs может затрагиваться редактированием и, по-видимому, на уровне экспрессии ADAR (FIG. 5f). Напр., генерация rasi-RNAs может быть супрессирована посредством A→I редактирования РНК fold-back dsRNA в соматических клетках и тканях, так что мРНК, которые обладают повторяющимися элементами в своих UTRs не замалчиваются в trans-положении (FIG. 5f). В подтверждение этой гипотезы, A→I редактирование РНК повторов РНК происходит только на низких уровнях в овариях и тестисах8. Более того, ядерная или цитоплазматическая локализация и активация ADARs регулируется во время созревания ооцитов и ранних эмбрионов X. laevis93.

Crosstalk between RNA editing and RNAi


Параллельно с недавними находками по редактированию не кодирующих повторов РНК, накоплен ряд доказательств, что A→I редактирование РНК и RNAi пути часто взаимодействуют, выявляя новую функцию редактирования, которая также затрагивает глобальную экспрессию многих генов.
Suppression of RNAi by A→I RNA editing. RNAi, подобно A→I редактированию РНК, является процессом, который функционирует в вирусных и клеточных dsRNAs14,16. Многие белки, которые участвуют в механизме RNAi mechanism, такие как Dicer, Drosha, DGCR8 и TRBP, содержат dsRBDs, как и у ADARs (FIG. 2b). Множественные adenosines из длинных dsRNA могут быть деаминированы с помощью ADAR, в то время как RNase III-подобная рибонуклеаза Dicer превращает длинные dsRNAs в 19-21 bp siRNAs (FIG. 6). Затем, AGO2 nuclease, компонент RISC, деградирует однокоренные мРНК mRNAs посредством siRNA-направляющего механизма RNAi14,16.
В целом, dsRNA-связывающие белки лишены сиквенс-специфичности в прямом смысле94. Поэтому было предположено, что механизм A→I редактирования РНК может взаимодействовать с RNAi путем посредством конкуренции за общие dsRNA субстраты и путем снижения эффективности RNAi17. dsRNA, которая экстенсивно редактируется in vitro с помощью ADAR в сомом деле становится резистентной к Dicer, генерируя в результате меньше siRNA и редуцируя RNAi95 (FIG. 6a). Dicer? как полагают, различает между dsRNAs, которые содержат I·U wobble пары оснований от dsRNAs, которые содержат только Watson-Crick пары оснований95.
Линии C. elegans, которые содержат гомозиготные делеции как adar-1, так adar-2 генов (FIG. 2a) обнаруживают дефектный хемотаксис24. Эти фенотипические отклонения, однако, могут быть устранены в линиях C. elegans, которые имеют RNAi недостаточность, указывая тем самым, что фенотипы ADAR-нулевых червей являются зависимыми от RNAi23. Экспрессия гена, который участвует в механизме хемотаксиса ('chemotaxis gene') может находиться под контролем баланса между A→I редактированием РНК и RNAi на dsRNA, происходящих с хемотаксисного гена (FIG. 6a). Предполагается, что имеются слишком усиленные RNAi эффекты и супрессия фенотипов гена хемотаксиса у ADAR-нулевых червей, но детали этого взаимодействия между редактированием РНК и путем RNAi предстоит установить.
В добавление к исследованиям по экспрессии трансгенов у ADAR-нулевых червей показано, что A→I редактирование dsRNAs, которые происходят из инвертированных повторов трансгенов, по-видимому, предупреждает молчание трансгенов с помощью RNAi у C. elegans25 (FIG. 6a). Результаты снова говорят против антагонистических эффектов ADAR in vivo на RNAi, которая контролирует инвазию трансгенов, вирусную инфекцию и активность транспозонов11,14,16. Такого типа молчание трансгенов (co-suppression), а также молчание вирусных РНК посредством RNAi, является эффективным у растений и грибов. которые лишены генов ADAR и системы A→I редактирования РНК11,14,16,96. У этих организмов RNAi, по-видимому, единственный защитный механизм против инвазии трансгенов и вирусной инфекции. Система A→I редактирования РНК может участвовать в противовес RNAi у организмов, у которых развита более продвинутая иммунная система.
Suppression of siRNA by ADAR1L. В исследованиях, описанных выше, длинные dsRNA, как было предположено, являются мишенями для ADAR23,25. A, Dicer и ADAR,как полагают, конкурируют за субстраты из длинных dsRNA (FIG.6a). Кроме того, функция siRNAs, которые уже подверглись процессингу из длинных dsRNA с помощью Dicer, могут быть подавлены в клетках млекопитающих (FIG. 6b). Определенные вирусные и клеточные факторы функционируют как супрессоры RNAi. Напр., ERI-1 является 3'→5' exonuclease, которая влияет на эффективность эндогенного механизма RNAi с помощью специфически деградированных siRNAs97. Напротив, 19-kDa белоковый (p19) гомодимер, синтезируемый с помощью tombusvirus, тесно и специфически соединяется с siRNAs, супрессируя тем самым у растения хозяина защитный RNAi механизм98,99. Цитоплазматический ADAR1L, как сообщалось, также тесно соединяется с siRNA 22. Замалчивание генов с помощью siRNA значительно более эффективное в фибробластах мышей, которые являются гомозиготными по Adar1-нулеовой мутации, по сравнению с клетками дикого типа22. Эти находки приложимы и к ADAR1L, т.к. клеточный фактор, который ограничивает потенциал siRNA в клетках млекопитающих, как это делает p19, уменьшает эффективную концентрацию siRNA и её включение в RISC (FIG. 6b)22. Экспрессия генов Eri1 и Adar1 индуцируется у мышей, которым инъецировали высокие дозы неспецифических siRNA100, это указывает на вовлечение ADAR1 и ERI1 в клеточный механизм обратной связи в ответ на siRNA. Эндогенные siRNAs или siRNA-подобные молекулы, которые регулируются посредством связывания ADAR1L (напр., rasiRNAs, FIG. 5f) остаются не идентифицированными.
Editing of miRNA precursor sequences. Открыты многочисленные клеточные и вирусные малые некодирующие РНК, которые известны как miRNAs12-16. Эти малые молекулы РНК функционируют посредством механизма, который сходен с siRNA-обусловленной RNAi13,15. Хотя miRNA являются однонитчатыми, они генерируются из длинных первичных транскриптов (pri-miRNA), которые состоят из несовершенных короткой dsRNA области и петли (FIG. 7a). Ядерный Drosha, вместе с dsRNA-связывающим белком DGCR8 (FIG. 2b), расщепляет pri-miRNAs, высвобождая в 60-70 нуклеотидов промежуточные предшественники (pre-miRNAs). Распознавание правильно превращенных pre-miRNAs и их экспорт в ядро осуществляются с помощью exportin-5 и RanGTP. Цитоплазматический Dicer вместе с dsRNA-связывающим белком TRBP (FIG. 2b), затем превращают pre-miRNAs в 20-22-нуклеотидные siRNA-подобные дуплексы (FIG. 7b)13,15. Одна или обе нити дуплекса могут служить как зрелая miRNA. После их инкорпорации в RISC, miRNAs блокируют трансляцию частично комплементарных мишеней, которые расположены на 3' UTR специфических mRNAs, или они приводят к деградации мишеней мРНК, как это делают siRNAs12-16. Любая dsRNAs, которая распознается с помощью RNAi механизма, является также потенциальной мишенью для A→I редактирования РНК, a возможность того, что pri-miRNAs могут редактироваться с помощью ADAR уже подчеркивалась ранее61.
Недавнее исследование показало, что определенные предшественники miRNA в самом деле редактируются с помощью ADAR18-21. Систематический обзор последовательностей pri-miRNA человека идентифицировал сайты A→I редактирования в ~6% из всех изученных pri-miRNAs21. Однако, возможны заниженные оценки21, исследования редактирования in vitro случайно выбранных pri-miRNAs предсказывают, что до 50% из всех pri-miRNAs могут иметь специфические сайты A→I редактирования РНК19. Редактирование предшественников miRNA д. иметь важное значение для их процессинга, также как и для экспрессии и функционирования зрелых miRNAs. A→I редактирование РНК изменяет структуру fold-back dsRNA из предшественников miRNA; это может влиять на их последующий процессинг и экспорт.
Недавние исследования установили, что редактирование двух специфических сайтов pri-miRNA-142 (+4 и +5 сайтов на FIG. 7a) полностью супрессирует их расщепление с помощью комплекса Drosha-DGCR819. Также и Tudor-SN способствует деградации высоко редактируемых pri-miRNA-142 (REF. 19) (FIG. 7c). Как и ожидалось экспрессия зрелых miRNA-142 существенно увеличена у Adar1-нулевых или Adar2-нулевых мутантных мышей19. Хотя это ещё предстоит показать, но A→I редактирование РНК определенных pri-miRNAs в специфических сайтах, как ожидается, супрессирует экспорт pre-miRNA из ядра посредством exportin-5 и RanGTP, и расщепляет pre-miRNA до зрелой miRNA с помощью комплекса Dicer-TRBP (FIG. 7d). В исследованиях pri-miRNA-142 редактирование определенных сайтов, таких как +40 сайт (FIG. 7a), не влияет на расщепление с помощью Drosha или Dicer19. Итак, структурные изменения определенных предшественников miRNA, которые вызываются редактированием по немногим избранным сайтам, могут быть допустимы. Это указывает на то, что редактирование определенных pri-miRNAs может приводить к экспрессии редактированных зрелых miRNAs, в зависимости от локализации редактируемого сайта(ов). В самом деле, описана экспрессия Kaposi-sarcoma-associated virus miRNA (miRNA-K12-10b), которая редактируется в позиции 2 (+2 сайт)20. Редактирование miRNA может замалчивать ряд генов мишеней, которые отличаются от тех, которые замаливаются с помощью нередактируемых miRNA, особенно, если сайт редактирования располагается в 'seed sequence'; т.е. в 5' половине (+2 - +8) последовательностей miRNA, которые важны для спаривания с мишенью мРНК12,13 (FIG. 7e). Или редактирование может влиять на выбор 'effective' нити miRNA, которая будет загружена на RISC и приведет её на мишень мРНК. Выбор 'эффективной' нити зависит от локальной стабильности дуплекса смысловая-антисмысловая miRNA12,13,16. A→I редактирование РНК ожидается, что будет затрагивать локальную стабильность дуплекса.

Concluding remarks and outlook


ADARs were originally discovered as a mysterious dsRNA-unwinding activity, but they were soon identi-fied as enzymes that are involved in A→I RNA editing, which is essential for the re-coding of important mam-malian genes. The roles of ADAR genes and A→I RNA editing, however, need to be redefined, as we have now realized that non-coding, repetitive RNAs are their most frequent targets. Furthermore, recent findings all point to an intimate interplay between A→I RNA editing and RNAi. Indeed, we are just beginning to grasp the magni-tude of the biological significance of A→I RNA editing, with many questions remaining to be answered.
The RNAi machinery is functional in ADAR-null worms and is therefore independent of A→I RNA editing25' Furthermore, ADAR genes are missing in plant, fungi and yeast genomes, whereas these species do have RNAi. Has A→I RNA editing evolved specifically to tune and regulate RNAi in the animal kingdom, possibly along with the expansion of repeat elements in the genome? Although SINEs are edited genome wide in different species, the editing frequency of primate-specific Alu repeats is substantially higher (30–40 fold) than that of mouse SINE repeats. Does this mean that A→I RNA editing is less important in non-primate species, even though all three ADAR genes remain conserved among vertebrates? Alternatively, does this mean that the biologically most important dsRNA targets for A→I RNA editing have yet to be discovered? A large new class of small RNAs (~26–30 nucleotides) in complex with PIWI-family proteins (piRNAs, PIWI-interacting RNAs) has been reported in mammalian testes92,101–103' It would be interesting to determine whether A→I RNA editing is at all involved in the suppression of piRNA biogenesis.
The inactivation of Adar1 leads to an embryonic lethal phenotype, which is caused by widespread apoptosis60–62. It seems that the editing of currently unknown target dsRNA(s) protects developing embryos from massive apoptosis. Perhaps by addressing the questions men-tioned above and by achieving a better understanding of the interaction between A→I RNA editing and RNAi pathways, we might uncover the mechanism that underlies the phenotype of Adar1-null mutant mouse embryos.
Сайт создан в системе uCoz