Биологи с изумлением обнаружили, что большинство животных и растительных клеток обладает механизмом избирательного подавления экспрессии генов с помощью коротких двухцепочечных РНК, гомологичных данному гену. Биотехнологические компании уже размышляют над практическим применением этого механизма.

Геномная ДНК любой растительной или животной клетки содержит тысячи генов. Если бы транскрипционная машина была предоставлена самой себе, то все они экспрессировались бы одновременно: раскручивалась бы вся двойная спираль ДНК, транскрибировался бы каждый ген, образовывались бы мириады матричных РНК (мРНК), и на них синтезировалось бы несметное количество белков. Такой какофонии не выдержала бы ни одна клетка, а потому природа распорядилась так, что в каждый определенный момент большинство генов молчит, и слышны лишь единицы...

Однако есть гены, которых лучше лишить «права голоса» – настолько опасны они для клетки. Если бы гены мобильных генетических элементов могли беспрепятственно отправлять свои мРНК-послания, то в клетке возник бы хаос и, как следствие, рак. Аналогично, если бы экспрессия вирусных генов осуществлялась бесконтрольно, то клеточная белоксинтезирующая машина переключилась бы на производство вирусных белков.

У клеток есть способ избежать такого развития событий – синтезировать интерферон в ответ на проникновение вируса в организм. Этот универ- сальный защитный механизм выключает все чужеродные гены без разбора. Однако недавно обнаружилось, что у животных и растительных клеток есть гораздо более изящная, прицельная и мощная система внутренней безопасности, играющая роль цензора, – РНК- интерференция (РНКi). Когда в клетку попадает какой-нибудь опасный для нее ген, система заставляет его замолчать, распознавая и уничтожая кодируемую им мРНК и не трогая мРНК других генов. Выяснив механизм действия и запуска РНКi-системы, можно выключать гены, ассоциированные с различными заболеваниями.

Ученые, исследующие механизм действия системы геномного цензурирования у растений, червей, мух и других организмов, научились подавлять экспрессию почти любого гена.

Странное молчание

Впервые с РНКi-феноменом исследователи столкнулись 13 лет назад. Ричард Йоргенсен (Richard A. Jergensen) из Аризонского университета и Йозеф Мол (Joseph Mol) из Амстердамского свободного университета независимо друг от друга провели эксперимент: они встроили в геном петунии с фиолетовыми цветками дополнительные копии гена, детерминирующего данный цвет. Ожидалось, что окраска цветков станет интенсивнее, однако вместо этого на них появились белые пятна. Йоргенсен и Мол пришли к выводу, что лишние копии гена запускают процедуру цензурирования, «вычеркивающую» из генома все гены этого типа, в том числе и изначально в нем присутствующие, что приводит к появлению растений-альбиносов. Феномен двойного цензурирования (ко-супрессия) был обнаружен чуть позже у грибов, дрозофилы и других организмов.

Спустя несколько лет Уильям Доэрти (William G. Dougherty) из Орегонского университета исследовал растения табака, в геном которых было встроено несколько копий СР-гена (ген белка оболочки) вируса гравировки табака. Растения, инфицированные вирусом, оказались к нему устойчивыми. Ученый предположил, что в основе лежит ко-супрессия. Генетически модифицированные растения «выработали иммунитет» к чужеродным СР-генам, который проявился, как только в них попал вирус. При этом для «иммунного ответа» клеткам не нужен был вирус- ный белок оболочки, устойчивость к инфекции возникала на уровне РНК, транскрибируемой с СР-генов.

Доэрти также показал, что специфические вирусные гены перестают экспрессироваться не только под действием «иммунного ответа» растения, их может заставить замолчать сам вирус. У некоторых растений табака супрессия встроенных СР-генов не происхо- дила, и инфицировавший их вирус беспрепятственно размножался. При этом количество мРНК, транскрибированной со встроенных СР-генов ин- фицированных растений, уменьшалось, т.е. вирусная инфекция вызвала их инактивацию.

Параллельно проводились эксперименты по инактивации генов с исполь- зованием «антисмысловой» РНК у нематоды Caenorhabditis elegans, крошечного прозрачного червя. РНК должна была спариваться с определенной мРНК с образованием двухцепочечной молекулы аналогично тому, как спариваются комплементарные цепи ДНК. Каждая цепь РНК и ДНК состоит из азотистых оснований аденина (A), цитозина (C), гуанина (G) и урацила (U) (у РНК) и тимина (T) (у ДНК). С всегда образует пару с G, а А – с U или Т. Одноцепочечная «антисмысловая» РНК связывается с комплементарной мРНК и образует двухцепочечную молекулу, на которой не может синтезироваться полноценный белок. Эксперименты с «антисмысловыми» РНК проводились на различных организмах уже давно, но без особого успеха. Первые обнадеживающие результаты были получены на червях, однако смущало то, что введение «смысловой» РНК тоже инактивировало гены, чего не должно было происходить, поскольку ее нуклеотидная последовательность в точности совпадает с нуклеотидной последовательностью соответствующей мРНК, а не комплементарна ей.

Решающий эксперимент пять лет назад провели Эндрю Файер (Andrew Z. Fire) из Института Карнеги в Вашингтоне и Крейг Мелло (Craig C. Mello) из Медицинской школы Массачусетского университета. Они предположили, что использовавшиеся ранее препараты «антисмысловой» и «смысловой» РНК были недостаточно чистыми и содержали в следовых количествах двухцепочечную РНК (дцРНК), которая могла влиять на работу «цензора». Чтобы проверить эту гипотезу, ученые ввели нематодам одноили двухцепочечные РНК, отвечающие гену unc-22, который контролирует мышечное сокращение. Относительно большое количество одноцепочечных РНК мало сказывалось на поведении нематод. Даже нескольких молекул двухцепочечной unc-22-РНК было достаточно, чтобы у червя и даже у его потомков возникли непроизвольные подергива- ния, однозначно указывающие на сбой в экспрессии гена unc-22. Аналогичный эффект наблюдался у всех исследованных генов, в том числе контролирующих плодовитость и жизнестойкость. Файер и Мелло назвали это явление «РНК-интерференция», чтобы подчеркнуть центральную роль дцРНК во включении механизма цензурирования.

ОБЗОР: РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ

• Ученые давно изобрели способ встраивания чужеродных генов в экспери- ментальные организмы. Но только недавно они обнаружили простой и эффек- тивный механизм выключения генов, которым пользуются живые клетки.

• Почти у всех животных и растительных клеток существует внутренняя система безопасности, использующая матричную РНК для избирательного «усыпления» тех или иных генов.

• Эта система играет двоякую роль: она защищает клетку от чужеродных генов и регулирует активность ее собственных генов во время роста и развития. Ее можно будет использовать для предотвращения развития различных заболеваний и для их лечения.

Ученые, исследовавшие растения и грибы, также предположили, что инициатором цензурирования является дцРНК. Они показали, что такой способностью обладает одноцепочечная РНК, содержащая взаимно комплементарные участки и образующая так называемые «шпильки». Далее обнаружилось, что для ко-супрессии клеткам необходим ген, отвечающий за перевод РНК из одноцепочечной конфор- мации в двухцепочечную. Все эти факты наводили на мысль, что растения петунии, на которых проводили эксперименты Йоргенсен и Мол, расценивали избыточные копии гена, детерминирующего окраску цветка, как чужеродные и переводили свои мРНК в двухцепочечную форму, которая заставляла замолчать как избыточные копии гена, так и ген, изначально присутствовавший в геноме. Теперь находило объяснение молчание СР-генов у растений, инфицированных вирусом гравировки табака. При репликации вируса в клетке появлялась дцРНК, и растения отвечали на это выключением мРНК всех вирусных генов, в том числе и СР-генов, встроенных в геном растения.

Удивительно, что столь мощный и универсальный способ регуляции экспрессии генов так долго оставался незамеченным. И теперь, когда тайное стало явным, ученые принялись активно изучать его, понимая всю перспективность практического применения этого механизма.

Орудие геномного цензора

Вскоре феномен геномного цензурирования был обнаружен у представителей разных ветвей эволюционного древа – водорослей, плоских червей и дрозофилы. У человека и других млекопитающих выявить его оказалось значительно сложнее. Если вирус, проникший в клетку человека, начинает реплицироваться с образовани- ем длинных дцРНК, то в ней включается сигнал «аварийной остановки»: блокируется трансляция как хозяйских, так и вирусных мРНК, и фермент РНКаза L разрушает их без разбора. Такая система является составной ча- стью защитного механизма при участии интерферона, поскольку в его присутствии она включается легче. К сожалению, введение в клетки млекопитающих искусственных дцРНК тоже вызывает синтез интерферона и выключение всех генов, и чтобы выяснить, как в этом случае действует РНКi-система, нужно устранить его влияние. По-видимому, дело обстоит следующим образом. В клетке дцРНК подвергается атаке со стороны фермента, прозванного «дайсер» (от англ. to dice, нарезать мелкими кусочками), который расщепляет молекулу на фрагменты – так называемые siРHК (от англ. short interfering RNA) – длиной в 22 нуклеотида. Расщепление цепей происходит с небольшим смещением, так что каждый фрагмент имеет по обеим сторонам выступающие одноцепочечные концы длиной в два нуклеотида (см. схему на развороте). Затем цепи siРHК расходятся, и одна из них включается в состав белкового комплекса, в результате чего образуется РНК-индуцированный сайленсинг комплекс (RISC, от англ. RNA-induced silencing complex). Молекула siРHК расположена в нем таким образом, что может гибридизоваться с мРНК. Из тысяч разных мРНК, присутствующих в клетке, с РНК в составе RISC спаривается только та, которая ей комплементарна полностью или частично. Таким образом, в отличие от интерферона, сайленсинг-комплекс высокоизбирателен и реагирует только на определенный сигнал.

Когда «замок» между siРHК и комплементарной ей мРНК защелкивается, фермент под названием «cлайсер» (нож) разрезает мРНК пополам, и обе половинки отсоединяются от комплекса и более не могут служить матрицами для синтеза белка. Сам комплекс RISC снова готов к работе и может присоединять следующие молекулы мРНК. Таким образом, РНКi-цензор использует двухцепочечные участки РНК-дуплекса как «черную метку», позволяющую отыскать определенную мРНК и заставить ее замолчать. Впервые siРHК были выделены Дэвидом Болкомбом (David C. Baulcombe) из лаборатории Сенсбери в Нортридже, Англия. Затем Томас Тушл (Thomas Tuschl) из Рокфеллеровского университета проверил их на способность выполнять функции сайленсеров. Для этого он синтезировал разные siРHК и использовал их как «спусковой крючок» для выведения из строя различ- ных мРНК. Все прошло отлично, и тогда ученый задал себе вопрос: а не могут ли эти короткие фрагменты РНК ускользнуть от интерфероновой «радарной системы» клетки, поднимающей тревогу? Обычно система не реагирует на РНК длиной менее 30 нуклеотидов. Чтобы проверить эту гипотезу, короткие синтетические siРНК

продолжение ↓

вводили в клетки млекопитающих в культуре. Результат превзошел все ожидания: замолчали только гены, выбранные в качестве мишени, «радарная система» не сработала ни разу. Открытие взволновало все биохимическое сообщество. Генетики уже давно научились вводить в клетки млекопитающих чужеродные гены (например, используя для этого вирусы), но чтобы целенаправленно выключить какой-либо ген, приходилось трудиться многие месяцы. Теперь их мечта сбылась: заставить замолчать почти любой ген в культивируемых клетках (в том числе и в клетках человека) стало возможно всего за несколько часов. Молчание длилось сутками – достаточно долго, чтобы провести нужный эксперимент.

Волшебный инструмент

Ценным инструментом РНКi стало для тех, кто занимается изучением низших организмов. Это связано с тем, что у них цензурирование носит системный характер и распро- страняется далеко за пределы той области, куда была введена дцРНК. Какого-нибудь червя можно отдать на растерзание генетически модифицированным бактериям, которые синтезируют дцРНК, отвечающую гену-мишени.

Но ученые смотрят дальше. Теперь, когда определена нуклеотидная последовательность геномной ДНК многих организмов, можно с помощью РНКi систематически исследовать функции генов, целенаправленно выводя их из строя. Были проведены тысячи экспериментов, каждый из которых был направлен на выключение одного из генов C. еlegans. Аналогичные широкомасштабные исследования проводятся сейчас на растениях и на клетках млекопитающих. РНКi-систему пытаются использовать и фармацевтические компании. Например, с ее помощью проводят быстрый скрининг генов для выявления тех из них, которые могут стать мишенью для новых лекарственных средств. Систематически выключая разные гены, можно определить, какие из них необходимы для деления раковых клеток и не столь существенны для нормальных. Воздействуя разными веществами на белковые продукты генов, можно отобрать наиболее эффективные и использовать их как противоопухолевые препараты. Биотехнологические фирмы делают ставку и на применение самой РНКi-системы как способа борьбы с раком, вирусными инфекциями, некоторыми генетическими заболеваниями с доминантным типом наследования. Ученым удалось приостановить размножение различных вирусов (среди них – ВИЧ, вирус полиомиелита и вирус гепатита С) в клетках человека в культуре. Клетки подвергались воздействию siРНК, которые выключали гены, необходимые для воспроизводства патогенных микроорганизмов. Недавно Джуди Либерман (Judy Liberman) из Гарвардской медицинской школы сообщил, что инъекции siРНК спасли многих мышей, больных гепатитом, от неминуемой гибели.

К сожалению, пройдет немало лет, прежде чем результаты лабораторных исследований удастся применить на практике. Основная проблема – адресная доставка siРНК. В отличие от растений и червей, у человека эти молекулы не распространяются от места их введения по всему организму. Кроме того, они слишком велики, чтобы препараты на их основе можно было принимать внутрь – они разрушаются в пищеварительном тракте, не успев попасть в кровоток. Сегодня ученые проверяют различные способы доставки siРНК ко многим органам, а также пути преодоления ими мембранных барьеров.

Альтернативный способ решения проблемы – генноинженерный. Ген, кодирующий нужную РНК, можно ввести в безвредный для организма вирус и инфицировать им клетки. Ученые из Айовского университета использовали модифицированный аденовирус для доставки генов, кодирующих siРНК, в клетки мозга и печени мышей. Для человека подобный подход пока невозможен.

И все же применение siРНК в медицинских целях выглядит более привлекательно, чем использование «антисмысловых» РНК и РНК как катализаторов. Это связано с тем, что в случае РНК-интерференции используется природный механизм регуляции генов, сформировавшийся в ходе эволюции.

Зачем клетке нужны цензоры?

Механизм геномного цензурирования сформировался миллиард лет назад как способ защиты прародителей современных растений, животных и грибов от вирусов и мобильных генетических элементов. Подтверждением служат результаты исследований, проведенных Рональдом Пластерком (Ronald H.A. Plasterk) из Института рака в Нидерландах, которые показали, что современ- ные черви защищаются с помощью РНКi от мобильных генетических элементов, а растения – от вирусов. Но, возможно, РНКi-цензор выполняет и другие функции. Мутантные черви и растения, у которых неэффективно работает «дайсер», развиваются с многочисленными отклонениями от нормы и не могут размножаться. Почему дефицит этого фермента отражается на них столь серьезно? Возможно, природа, создав столь удачный способ защиты от вредоносных вирусных генов и мобильных ДНК, стала использовать его и в других целях. Во всех клетках данного организма набор генов одинаков, индивидуальность клетки определяется тем, какие гены в ней экспрессируются, а какие молчат. Большинство растений и животных развивается из одной эмбриональной клетки, которая многократно делится и дает начало клеткам разного типа. Чтобы процесс развития шел нормально, одни гены при дифференцировке клеток должны выключаться, другие, наоборот, включаться. Когда клетке ничто не грозит и РНКi-механизм не должен бороться с чужеродными генами, он переключается на плановое «вычеркивание» из генома нормальных клеточных генов. Это необходимо для правильного развития организма – образования различных типов клеток (мышечных, нервных и т.д.) и формирования органов (например, мозга, сердца). Но что именно побуждает РНКi-механизм «усыплять» нормальные клеточные гены? Возможно, в каких-то случаях клетка для этой цели синтезирует длинную дцРНК. Однако чаще стимулом служат микроРНК – небольшие РНК-фрагменты, напоминающие siРНК, но имеющие другое происхождение. siРНК родственны тем генам или областям генома, которые в конце концов они и должны «усыпить», а микроРНК транскрибируется с генов, единственная цель которых – синтез этих крошечных регуляторных молекул.

Молекула РНК, транскрибируемая с микроРНК-гена (она называется предшественником микроРНК), складывается пополам и образует структуру, напоминающую шпильку для волос. «Дайсер» разрезает ее посередине, и образуется дцРНК, которая во многом ведет себя так же, как siРНК, но за одним важным исключением: она выискивает не тот ген, который напоминает ее прародителя, а совсем другой. Биологи не сразу оценили роль микроРНК в регуляции экспрессии генов. Еще совсем недавно им были известны всего две микроРНК – lin-4-РНК и let-7-РНК. Их открыли Виктор Амброз (Victor Ambros) из Дартмутской медицинской школы и Гэри Равкан (Gary Ruvkun) из Гарвардской медицинской школы. За последние два года были обнаружены сотни микроРНК-генов у червей, мух, растений и человека. По нашим оценкам, геном человека содержит 200–255 микро-генов, т.е. на их долю приходится 1% суммарного числа генов. Они ускользали от вни- мания ученых, поскольку компьютерные программы не были нацелены на поиски нуклеотидных последовательностей, конечным продуктом кото- рых является РНК, а не белок. Интересно, что РНК lin-4 и let-7, впервые обнаруженные у червей, могут использовать и другую тактику: мРНК, являющиеся мишенью для этих микроРНК, комплементарны послед- ним лишь частично и не подвергаются гидролизу, трансляцию мРНК с образованием полноценных белков блокирует другой механизм.

Столкнувшись с таким разнообразием способов цензурирования, биологи пытаются трезво оценить роль малых РНК и РНКi. Сопоставление всех данных показывает, что siРНК не только «вылавливают» нужные РНК и обеспечивают их последующее уничтожение, но и участвуют в цензурировании на уровне ДНК, в экстремальных ситуациях буквально «вычеркивая» гены из генома. Однако при редактировании ДНК гены не уничтожаются, просто двойная спираль в этом месте туже скручивается, и данный участок ДНК не транскрибируется.

С момента открытия феномена геномного цензурирования история его изучения прошла долгий путь. РНКi-системы применяются сегодня в биологии и биомедицине, их используют в качестве инструмента выключения генов у самых разных организмов. И все же немало вопросов остается без ответа. Насколько широк спектр биологических процессов, в которых участвуют РНКi-система и микроРНК? Каков механизм действия РНКi на молекулярном и атомном уровнях? К каким заболеваниям могут приводить неполадки в работе РНКi ? Когда наука сможет ответить на все эти вопросы, тогда и сам феномен получит полное объяснение и, возможно, станет одним из краеугольных камней генетической медицины.

ОБ АВТОРАХ: Нельсон Ло (Nelson C. Lau) и Дэвид Бартел (David P. Bartel) занимаются исследо- ванием микроРНК и других малых РНК, участвующих в регуляции генов. Ло закан- чивает работу над докторской диссертацией в Массачусетском технологиче- ском институте. Бартел, получив степень доктора в Гарвардском университете, работает в Институте Уайтхеда. Он также является приглашенным профессором Массачусетского технологического института.