Timeline: Spemann's organizer and self-regulation in amphibian embryos
 Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 296-302 (April 2006) | doi:10.1038/nrm1855 | |
 Рис.1. | Embryonic self-regulation. Весь ранний эмбрион собой само-дифференцирующеся морфогенетическое поле, в котором клетки общаются др. с др. на больших расстояниях. Это демонстрируется экспериментами, напр. на эмбрионах Африканской шпорцевой лягушки (Xenopus laevis), рассеченных на две половинки на ст. бластулы. Если быть уверенным, что обе половинки содержат часть области дорсального организатора, то будут получены два совершенно идентичных близнеца (интактный sibling показан на верху рисунка). У людей идентичные близнецы обнаруживаются в 3 случаях на 1,000 живых новорожденных и возникают чаще всего в результате спонтанного разделения внутренней клеточной массы бластулы млекопитающих на две, сопросождаемой саморегуляцией60. Впечатляющий пример саморегуляции предоставляет др. животное, состоящий из 9 полос броненосец, у которого каждый бластоцист дает 4 генетически идентичных siblings50. Отметим, что каждый близнец длиннее, чем половина длины интактного сибса, это говорит об еще одной попытке регулироваться в направлении нормального паттерна Оба полу-эмбриона, показанные здесь происходят из одной и той же бластулы.  Рис.2. | Ubiquitous neural differentiation: epidermal differentiation can be restored by transplantation of either a dorsal or a ventral centre.  Рис.3. | A network of interacting secreted proteins regulates dorsal–ventral cell communication. Box 1 | The Spemann–Mangold organizer experiment in 1924 Box 2 | Proteins secreted by the dorsal and ventral signalling centres in the gastrula Box 3 | Timeline | Birth, decline and rebirth of experimental embryology |
В 1924 Spemann и Mangold продемонстрировали индукцию Сиамских близнецов в трансплантационных экспериментах с яйцами саламандр. Недавнияя работа с повторением на эмбрионах амфибий показала, что клетки в сигнальных центрах, которые расположены на дорсальном и вентральном полюсах гаструлы эмбриона, общаются др. с др. посредством сети секретируемых антагонистов ростовых факторов, протез, которые деградируют их, ингибиторов протеаз и сигналов bone-morphogenic-protein.
Когда эмбрин рассекается на половинки, то они могут саморегулироваться и регенерировать недостающие части (Fig. 1). Область экспериментальной биологии, возникшая в 1883, когда Roux убил одну из двух клеток эмбриона лягушки горячей иглой и установил, что оставшаяся дает долько часть эмбриона, обычно правую или левую половину1 . Однако, в 1891, Driesch разделил два первых бластомера эмбриона морского ежа и установил, что каждая способна саморегулироваться и давать полный, хотя и меньший эмбрион1. В 1895, Thomas Hunt Morgan повторил эксперимент Roux's и показал, что если один издвух бластомеров осторожно отсосать пипеткой из эмбриона лягушки (вместо убивания его и оставления на месте), то амфибии тоже саморегулируются и дают полные эмбрионы из половинки яйца egg2.
D 1903, Hans Spemann использовав петлю из детского волоса (от собственной дочери) подразделил яйцо делящихся амфибий (саламандры) на две половинки. Если полу-эмбрион содержал часть будущей дорсальной губы бластопора (область, где стартует инволюция мезодермы), то он формировался в безупречного полностью пропорционального головастика1 (Fig. 1). В 1918, Американский эмбриолог Ross Harrison провел др. замечательный эксперимент: если поле передней конечности в мезодерме эмбриона саламандры рассечь на половинки и трансплантировать в бок эмбриона хозяина, то каждая половинка могла индуцировать образование полной конечности, а не половинки конечности3. Часть эмбриона, где этот феномен имеет место, была названа 'self-differentiating morphogenetic field'.
Само-регуляция является одним из наиболее интересных и мистических свойств эмбриона. Каковы молекулярные механизмы, которые объясняют врожденную тенденцию эмбрионов регулироваться в направлении целого? Этот короткий обзор концентрируется на успехах, полученных на амфибиях, хотя существенные шаги были сделаны и на др. модельных системах, таких ка плодовая мушка (Drosophila melanogaster), куры (Gallus gallus) и рыбки (Danio rerio)4. Gene-fishing in Spemann's organizer Стартовой точкой понимания само-регуляции послужил эксперимент Spemann–Mangold с трансплантациями организатора (после этого названным Spemann's организатором) на яйцах саламандр5 (Box 1). Этот эксперимент и заложил сущестующую точку зрения, что развитие живтоных происходит в результате последовательных межклеточных индукций, в которых группы клеток или организующие центры, передают сигнал дифференцировки своим соседям. Трансплантации дорсальной губы заставляли соседние клетки адаптировать нормальный паттерн тканевых типов, так что формировались Сиамские близнецы. В 1988 опубликованы лучшие мемориальные работы лаборатории Spemann Виктором Hamburger6 (Box 1).
В нашей лаб. в исследованиях Шпемановского организатора использовались подходы по клонированию его молекулярных компонентов: библиотеки кДНК были созданы из вручную иссеченных губ дорсального бластопора Xenopus laevis, которые были впервые подвегнуты скринингу на гомобоксные последовательности. Гомеобоксные гены кодируют ДНК-связывающие белки, которые участвуют в контроле развития, в частности у у шпорцевых лягушек содержатся гомеобоксные гены Hox типа7. В 1991, наша группа достигла успехов в выделении гомобоесного гена , goosecoid (Gsc), который специфически экспрессируется в Шпемановском организаторе8. Gsc мРНК демаркирует, очень специфически, ткань, принадлежащую к Шпемановскому организатору. Паттерн экспрессии Gsc позволяет нам сегодня визуализовать то, что Шпемановский организатор существует как самостоятельная молекулярная сущность8.
Несколько месяцев спустя группы Igor Dawid и Milan Jamrich сообщили, что гены, кодирующие два др. транскрипционных фактора, Xlim1 и Xfkh1/Hnf3beta, также экспрессируются в области организатора шпорцевых лягушек9,10. Важно, что микроинъекции мРНК Gsc в вентральные клетки вызывают образование второй оси, это указывает на то, что ген Gsc является частью молекулярной кухни (machinery), которая ведет к активности Шпемановского органзатора8. Т.к. Gsc кодирует ДНК-связывающий белок, то мы предположили, что он может , в свою очередь, активировать экспрессиию секретируемых сигнальных белков, которые и осуществляют изменения клеточной дифференцировки в соседних клетках. Это действительно оказалось так11,12. Ген Gsc был затем выделен у многих др. видов и стал широко испольщзуемым маркером для сравнительных исследований гаструляции13.
В 1992, Richard Harland сообщил о выделении первого секретируемого белка, который экспрессировался в Шпемановском организаторе14. Использован др. метод — функционального скрининга молекул, которые изменяют эмбриональное развитие после избыточной экспрессии, при котором пулы кДНК росли и транскрипбировались in vitro с помощью SP6 RNA polymerase бактериофага и микроинъецировались эмбрионам шпорцевых лягушек. Те, что с биологической активностью затем суб-селектировались пока не идентифицировался одиночный клон. С использованием этого метода были выделены многие интересные гены15. Микроинъецированная noggin мРНК индуцировала нервную ткань в эксплантах эктодермальных клеток16. Впоследствии было установлено, что follistatin, др. секретируемая молекула, которая специфична для Шпемановского организатора, также является нейральным индуктором17.
Spemann's organizer secretes many antagonists. Многие секретируемые белки, крторые специфичны для Шпемановского hufybpfnjhf? были изолированы из гаструлы шпорцевой лягушки благодря обширным молекулярным скринингам. В Шпемановском организаторе был открыт сигнал в основном в виде секреции коктейля из антагонистов bone morphogenic protein (Bmp; члена сверхсемейства transforming growth factor (Tgf)beta) и Wnt18,19. Тот факт, что эти новые компоненты оказались антагонистами ростовых факторов, стал сюрпризом. Из всех молекул организатора, показанных в Box 2, только anti-dorsalizing morphogenic protein (Admp) оказался ростовым фактором. Admp является членом семейства Bmp, который экспрессируется в дорсальной части организатора20,21. Такая локализация является парадоксальной, поскольку Bmps, включая и Admp, индуцируют вентральное развитие и также поскольку Шпемановский организатор обычно появляется в области низкой передачи сигналов Bmp (see below).
The ventral-centre factors. Сейчаст становится ясным, что второй сигнальный центр формируется на вентральной стороне гаструлы19 (Box 2). На ранних стадиях развития экспрессиия ventral-centre генов обнаруживает тенденцию к диффузии и поэтому существование этого сигнального центра было пропущено. Область вентрального центра маркируется высочайшими уровнями передач сигналов Bmp4 и Bmp7. Эти факторы роста связываются мембранными Bmp рецепторами, которые затем фосфорилируют конец транскрипционного фактора, известного как Smad1, заставляя его мигрировать в ядро и активировать определенный субнабор генов. Гены вентрального центра скоординированно активируюся за счет высокой активности Smad1 и являются частью, которая ранее была обозначена как Bmp4 synexpression группа (т.е. группа генов. которые координированно активируются во время развития)22. Что поразительно, так это, что многие компоненты, которые экспрессируются в вентральном центре и которые транскрибируются, когда сигналы Bmp высоки, имеют свои копии в дорсальном центре, в котором они транскрибируются, когда сигналы Bmp низки. Итак, вентральные Bmp4 и Bmp7 соответствют дорсальному Admp и ventral crossveinless-2 (Cv2), а sizzled соответствует дорсальному chordin и crescent, соотв. Такое расположение, при котором белки со сходными биохимическими активностями экспрессируются на противоположных полюсах эмбриона, создают молекулярную основу для понимания эмбриональной само-регуляции. Bmp inhibition and neural induction The demise of Spemann's organizer. Одним из признаков Шпемановского организатора было то, чтомезодерма дорсальной губы индуцирует развитие полной WYC? наиболее сложной и запутанной из всех органных систем. Spemann выделял этот феномен как 'primary embryonic induction'1. В 1932, было открыто, что вскипяченная (и, следовательно, мертвая) ткань Шпемановского организатора может индуцировать нервнуют ткань, если он помещен между слоями эктодермы или имплантирован в полость бластулы23. Идентификация химических субстанций, которые вызывают нейральную индукцию, становятся Святым Гралем и привлекла некоторые из лучших име эмбриологов, таких как J. Needham, C. Waddington, J. Brachet и J. Holtfreter. Многие 'heterologous inducers' были обнаружены в тканевых экстрактах, в очищенных фракциях, таких как рибосомы (нуклеопротеиныs), в жирных кислотах и стеролах и в очищенных нефизиологических субстанциях, таких как methylene blue и даже частицы песка24. Эти открытия стали погребальным маршем для поля, т.к. исследователи установили, что эктодермальные экспланты эмбрионов саламандр (но не Африканских щпорцевых лягушек) могут заставляють дифференцироваться в нервную ткань очень легко. Завершающий удар произощел в 1940s, когда Barth and Holtfreter открыли, что эктодермальные клетки Amblystoma maculatum (близкий родственник аксолотля, или Мексиканская саламандра) могут дифференцироваться в нервную ткань не нуждаясь в каком-либо организаторе или индуцирующей субстанции, просто при культивировании жксплантов в субоптимальных растворах солей25,26. В результате эра подобных исследований сошла на нет. Когда я был студентом в 1970s, то повсюду можно было слышать "Spemann's organizer set developmental biology back by 50 years."
The revival of Spemann's organizer. Ренессанст экспериментальной бмологии наступил, когда были клонированы эндогенные факторы из Шпемановского организатора. Неожиданно было установлено, что нейральной индукции с помощью chordin, noggin и follistatin может помешать инъекцией мРНК Bmp427. Затем с помощью биохимических подходов было показано, что эти три антогониста соединяются непосредственно с Bmp428-30.
Анлисмысловые morpholino олигомеры стали мощной технологией, которая позволила устранять продукты индивидуальных генов31. Используя эти ген-специфичные ингибиторы, было установлено, что экспрессия chordin абсолюьно необходима для индуктивной активности трансплантатов организатора, но не для формирования ЦНС у интактных эмбрионов32. У мышей (Mus musculus), нокаут noggin и chordin необходим для выявления дефектов в развитии переднего мозга33. У Африканской шпорцевой лягушки тройной нокдаун follistatin, chordin и noggin34, или cerberus, chordin и noggin35, вызывает катострофическую потерю структур ЦНС. Итак, эндогенный коктейль из Bmp антагонистов, который секретируется тканью Шпемановского организатора, необходим для нейральной индукции.
А как же гетерологические нейральные индукторы, которые парализовали эту область в течение нескольких десятков лет? Работы на шпорцевой лягушке показали, что нейральная индукция может быть также получена простой диссоциацией эктодермальных клеток в течение нескольких часов36,37. Недавно было устанровлено, что диссоциация клеток запускает устойчивую активацию mitogen-activated protein kinase (Mapk), которая, в свою очередь, вызывает фосфорилирование Smad1 по сайтам, которые ингибируют активность этого транскрипционного фактора38. В ходе нормального развития фосфорилирование Smad1 с помощью Mapk передает сигналы от рецепторных тирозин киназ, таких как рецепторы fibroblast growth factor (Fgf) и insulin-like growth factor (Igf)39,40. Активация Mapk противодействует активирующим эффектам передачи сигналов Bmp на Smad1, тем самым ингибируется эпидермальная судьба и усиливается нейральная дифференцировка. Mapk акивируется с помощью множества неспецифических клеточных стимулов — её активация, по-видимому, и объясняет эффекты гетерологических индукторов38. Molecular self-regulation Ubiquitous neural induction. Эмбриональное развитие обладает прирожденной избыточностью, чтобы гарантировать безошибочность и воспроизводимость процесса ль индивида к индивиду. Одновременный нокдаун Bmp2, Bmp4 и Bmp7 у эмбрионов шпорцевой лягушки затрагивает крупные дорсальные структуры, но как было установлено, всё ещё сохраняет выраженные дорсо-вентральный паттерн41. Неожиданно, у эмбрионов, которые лишены Шпемановского организатора (что достигается облучением яиц УФЛ или хирургическим вмешательством в вентральной половине эмбриона) эффекты были значительно более выражены, так что истощение Bmp2, Bmp4 и Bmp7 вызывало дифференцировку головного мозга, лишенного дорсо-вентрального паттерна. Это указывает на то, что Шпемановский организатор сам по себе является источником сигналов, которые компенсируют потерю Bmps. Основным компонентом этого сигнала явилась дорсальная Bmp молекула Admp; в самом деле, четвертичный нокдаун Admp, Bmp2, Bmp4 и Bmp7 приводит к тому, что вся эктодерма становится тканью ЦНС и элиминируется дифференцировка с эпидермальные клетки42 (Fig. 2a–d). Итак, когда дорсальный и вентральный Bmp сигналы подавляются, то само-регулирующееся морфогенетическое поле подвергается коллапсу и наступает повсеместная нейральная индукция.
Трансплантация ткани дикого типа в такие Bmp-depleted эмбрионы показала, что вентральный и дорсальный центры могут служить в качестве источников Bmps, которые диффундируют на значительные расстояния у эмбрионров и запускают изменения в клеточной дифференцировке42, как показано на Fig. 2e,f. Этот двойной градиент сигналов Bmp, который испускается с противоположных полюсов эмбриона обеспечивает надежность формирования дорсо-вентрального паттерна.
Cell–cell communication. Рис. 3 показывает как сеть внеклеточных белков регулирует формирование эмбионального дорсо-вентрального паттерна. Гены Шпемановского организатора транскрибируются, когда уровни Bmp низки, тогда как гены вентрального центра нужадются в высоких уровнях Bmps для своей транскрипции. Само-регулция может быть объяснена этой 'see-saw' реципрокной транскрипционной регуляцией42. Когда уровни Bmp понижены, то транскрипция Admp увеличивается в дорсальной части, это ведет к компенсации, т.к. Admp обладает Bmp-сигнальной активностью. Когда же уровни передачи сигналов Bmp увеличиваются, то Bmp антагонисты — такие как bambi и sizzled — транскрипбируются в вентральном центре, где они функционируют как негативные регуляторы петли обрат ной связи42. Хотя Admp продуцируется в дорсальной части, он не способен передавать сигнал в этом месте, т.к. он соединяется с chordin. Admp передает сигналы только на вентральной стороне, как только chordin будет отщеплен с помощью xolloid-related (Xlr) metalloproteinase42,43, которая продуцируется вентральным центром44.
Недавно было открыто, что sizzled противодействует передаче сигналов Bmp с помощью непрямого молекулярного механизма: он является конкурентным ингибитором Xlr metalloproteinase45. Хотя sizzled обладает структурой секретируемого secreted frizzled-related protein (sFrp, a type of Wnt inhibitor) — и поэтому ожидалось, что он может быть Wnt антагонистом — но фенотип потери функции у эмбрионов Африканской шпорцевой лягушки46 и рыб данио рерио47,48 очень сходен с тем, что у chordin. Энзим Xlr обладает сходным химическим сродством (константа диссоциации (Kd) ~20 nM) со своим субстратом chordin и с его ингибитором sizzled45. Удивительно, что эмбриональный дорсо-вентральный паттерн контролируется путем модулирования относительных уровней этих двух белков во внеклеточном пространстве.
Многие орган-формирующие морфогенетические поля - такие как те, что необходимы для роста конечностей, хрусталика, глаз и сердца — формируются во время развития живтоных3,49, а реципрокная транскрипционная регуляция сигнальных молекул может создавать общую парадигму понимания того, как они само-регулируются после экспериментальных пертурбаций, чтобы сформировать нормальные структуры. В гаструле амфибий дорсальный и вентральный сигнальные центры служат в качестве источников Bmps и их антагонистов. Интересно, что ключевой ступенью, которая контролирует начало общения между дорсальными и вентральными клетками в развивающемся эмбрионе, является регуляция активности Xlr metalloproteinase, которая деградирует chordin. Др. удивительной характеристикой этой сети само-регулирующих белков является то, что она работает в основном путем прямых межбелковых взаимодействий во внеклеточной среде (Fig. 3). Future prospects The field of experimental embryology has a long and distinguished history. For most of the twentieth century, its guiding light was the Spemann's organizer experiment. The discipline hit a snag with the spurious discovery of heterologous inducers, and became dormant for about 40 years, during which time the genetics approach of T. H. Morgan dominated research50. The advent of gene cloning has revived experimental embryology. So much so, that we now have a molecular framework for one of the most mysterious problems in developmental biology: how do hundreds (or thousands) of cells in a morphogenetic field communicate to each other their relative positions, so that a perfect identical twin can be formed?
The African clawed frog embryo is a favourable biological model because the three main techniques of experimental biology can be applied to it. First, transplantation of cells to a new environment is possible, which allows their full regulatory potential to be challenged. Second, biochemistry with purified proteins can easily be applied in this system, which allows chemical affinities to be determined and components to be quantified in the embryo. Third, the loss of function of individual genes, which can presently be achieved by non-genetic means, can be applied to many genes simultaneously. The beauty of Spemann's experimental legacy has permeated all model systems. Together with the genetic approaches that are possible in zebrafish and mice, and the manipulations that are feasible in the chick embryo, we can expect much progress in the coming years. The problem of how cells communicate with each other over long ranges to regulate a field of differentiating cells is largely unsolved and still remains in its infancy.
Another avenue that is worth exploring is to use computer modelling to understand, in quantitative terms, how a network of proteins that interact with each other self-regulates. The mathematician Alan Turing proposed in 1952 that the formation of stable patterns during development might arise from an activator and an inhibitor that originate from the same source but that diffuse at different rates51. It seems possible that such activator–inhibitor pairs are provided dorsally by Admp–chordin and ventrally by Xrl–sizzled42,45. Understanding how the regulatory circuit shown in Fig. 3a works in detail will challenge systems biology. However, each component can be obtained as a pure recombinant protein, its binding affinities determined, and its gene products specifically depleted in the embryo of the African clawed frog. It appears that the discipline of experimental embryology is not quite dead yet, and that its rich heritage will continue to guide investigations into the molecular mechanisms by which cells communicate with each other for a long time into the future.
|