Пути передачи сигналов Wnt играют важные роли как в нормальном развитии, так и патогенезе различных болезней, включая рак [1]. Активация пути передачи сигнала Wnt нуждается во взаимодействии между секретируемым glycoprotein, Wnt, и seven раз пронизывающим трансмембранным белком, Frizzled (Fz). Различные комбинации Wnt и Fz пар лиганд-рецептор могут трансдуцировать, по крайней мере три самостоятельных типа внутриклеточных сигнальных путей. "Canonical" Wnt сигнальный путь (Wnt/β-catenin путь) вызывает изменения уровней внутриклеточного β-catenin и вовлекается, как полагают, в спецификацию судеб и пролиферацию клеток. Активация пути Wnt может также приводить к изменениям или внутриклеточных концентрация Ca²⁺ (Wnt/Ca²⁺ путь) или к реорганизациии актинового цитоскелета (Wnt/tissue polarity путь) [2]. Роль(и) этих 'не-канонических' Wnt сигнальных путей в формировании органов в основном неизвестны.

Участие передачи сигналов Wnt предполагается благодаря паттернам экспрессии Wnt и Fz генов во время развития поджелудочной железы эмбрионов мыши [3]. На эмбриональный день E11, Wnt5a и Fz-2 экспрессируются в мезенхиме и эпителии поджелудочной железы. На ст. E17.5, Wnt5a и Fz-2 ко-локализуются с инсулин- и глюкагон-экспрессирующими клетками. Напротив, только Wnt5a экспрессируется в окружающей мезенхиме. Анализ экспрессии генов с помощью in situ гибридизации и RT-PCR показал, что Wnt5a и Fz-2 экспрессируются в эмбриональной поджелудочной железе с E11 и вплоть до конца беременности, а также после рождения. Наивысший уровень экспрессии приходится на E12 для Wnt5a, и на E12-E13 для Fz-2. Избыточная экспрессия Wnt5a в поджелудочной железе вызывает образование множественных небольших и разбросанных островков, но механизм такой аномалии не охарактеризован [3].

Мы изучали роль передачи сигналов Wnt в миграции insulin-позитивных клеток, чтобы сформировать панкреатические островки. У эмбрионов мышей примерно на E9.5, примитивные панкреатические эпителиальные клетки экспрессируют транскрипционный фактор, pdx-1. Glucagon-позитивные клетки впервые выявляются около E10.5, a insulin-позитивные клетки около E11.5 внутри эпителия панкреатических протоков [4]. На ст. E15.5 обнаруживаются кластеры перемешанных insulin-позитивных и glucagon-позитивных клеток в панкреатическом интерстиции, в основном в ассоциации с протоками [4,5]. В течение последних 4 дней беременности и постнатально эндокринные клетки отсоединяются от протоков, увеличиваются в количестве и на ст. E17.5-E18.5 реорганизуются, чтобы сформировать зрелые островки с сердцевиной из insulin-эспрессирующих клеток, окруженных glucagon-экспрессирующими клетками [6]. Образование зрелых островков, как полагают, нуждается в миграции эндокринных клеток из эпителия панкреатических протоков в панкреатическую мезенхиму. Эти процессы частично контролируются с помощью matrix metalloproteinases (MMPs), семейства энзимов, которые деградируют белки внеклеточного матрикса [7]. Передача сигналов TGF-β необходима для активации MMP-2, которая затрагивает морфогенез островков in vitro [8]. Установлено, что передача сигналов EGF также регулирует активацию MMP-2 и затрагивает миграцию insulin-позитивных клеток [6]. У мышей, лишенных EGF рецепторов, большинство insulin-позитивных клеток остаются ассоциированными с панкреатическими протоками в период новорожденности.

Поджелудочная железа рыбок данио функционирует сходным с позвоночными образом, секретируя гормоны и экзокринные энзимы, чтобы регулировать в крови уровень глюкозы и участвовать в переваривании, соотв. [9,10]. Как и у др. позвоночных синтез и секреция эндокринных гормонов у рыбок данио происходит в островках, называемых тельцами Brockmann, но в отличие от др. позвоночных, первоначально образуется только один островок [11]. Т.о., островок рыбок данио представляет собой модель простейшей эндокринной поджелудочной железы с такой же сложностью как и у др. позвоночных. Insulin-позитивные клетки специфицируются в виде билатеральных участков примерно на ст. 14-сомитов и постепенно формируют один островок по срединной линии [12]. Иммуногистохимические исследования с использованием антител против инсулина и глюкагона показали, что островок рыбок данио состоит из сердцевины insulin-экспрессирующих клеток, окруженных glucagon-экспрессирующими клетками, т.е. структурная организация сходна с той, что наблюдается у мышей и людей [11,12]. Однако, паттерн клеточной миграции и молекулярные механизмы морфогенеза островка у рыбок данио ранее не были изучены.

Мы охарактеризовали процесс миграции insulin-позитивных клеток у рыбок данио и изучили роль передачи сигналов Wnt в формировании панкреатического островка. Мы показали, что передача сигналов wnt-5/fz-2 необходима для формирования собственно островка у рыбок данио и мы продемонстрировали, что передача сигналов Wnt5a необходима для отделения островков от протоков у мышей. Фенотипы у рыбок данио и у мышей, согласующиеся с дефектами миграции insulin-позитивных клеток, демонстрируют новую и консервативную роль передачи сигналов Wnt при формировании эндокринной части поджелудочной железы у позвоночных.

Чтобы изучить функцию fz-2, мы использовали morpholino-modified oligonucleotides (MOs) в качестве сиквенс-специфических ингибиторов трансляции у рыбок данио [13]. Инъекции fz-2 MOs [14] трансгенным эмбрионам рыбок данио ('morphants'), несущих репортерный ген GFP под контролем промотора insulin (insulin:GFP трансгенные рыбки: [15]) давалди в результате разбросанные GFP-позитивные клетки по сравнению с одиночным островком, наблюдаемым у эмбрионов дикого типа (wild-type (WT)) (Рис. 1A,B). Чтобы определить причину аномальной экспрессии insulin у FZ-2 morphants, проводили time-lapse imaging анализ. У эмбрионов дикого типа билатеральные insulin-позитивные клетки впервые появлялись приблизительно на ст. 14 сомитов. Эти клетки делились и активно мигрировали кзади, собираясь на срединной линии. midline. На ст. 24 hours-post-fertilization (hpf) все insulin-позитивные клетки ассоциируют, чтобы сформировать одиночный островок по срединной линии (Рис.1C-H [см. также additional file 1]). Мы также осущществили time-lapse анализ insulin:GFP трансгенных эмбрионов после инъекции rhodamine-conjugated dextran (Molecular Probe, D-1841). Это давало эмбрионов с экспрессией GFP в insulin-позитивных клетках, а rhodamine локализовался в случайных клетках мозаичным образом. Мы нашли, что GFP-негативные клетки, меченные родамином не меняют своего относительного положения и не обнаруживают каких-либо морфологических изменений, характерных для мигрирующих клеток, тогда как GFP-позитивные клетки перемещались кзади и медиально, подтверждая, что GFP позитивные клетки движутся относительно соседних клеток [см additional file 2]. Суммирование траекторий GFP-позитивных клеток показывает, что паттерн клеточной миграции в основном вдоль строго прямой линии от инициальной к финальной позиции (Рис. 1O). Соедняя скорость миграции GFP позитивных клеток была 0.3 ± 0.12 µm/minute а средняя A-P progression составляла 0.3 ± 0.04 µm/minute (n = 10).

У трансгенных insulin:GFP эмбрионов рыбок данио, которым был инъецирован fz-2 MO, билатеральные insulin-позитивные клетки также появлялись на ст. 14 сомитов. Однако, эти клетки были неспособны мигрировать кзади. Спустя 24 hpf, insulin-позитивыные клетки оставались разбросанными у fz-2 morphants (Рис. 1I-N [additional file 3]). Средняя скорость миграции GFP-позитивных клеток составляла 0.3 ± 0.08 µm/minute, сходной с не инъецированными трансгенными эмбрионами, демонстрируя, что GFP-позитивные клетки способны к движению с нормальной скоростью. Однако, траектории insulin-позитивных клеток у fz-2 MO-инъецированных эмбрионов показывали, что клетки движутся случайно (Рис. 1P). Средняя A-P прогрессия insulin-экспрессирующих клеток у fz-2 morphant эмбрионов составляла -0.02 ± 0.07 µm/minute (n = 10). Эти данные говорят, что GFP-позитивные клетки всё ещё могут двигаться нормально, но теряют информацию о направлении движения у fz-2 MO-injected трансгенных эмбрионов.

Как сообщалось ранее fz-2 ограничивается сомитной мезодермой и задней частью параксиальной мезодермы, начиная со ст. одного сомита. Этот паттерн экспрессии остается таким во время сомитогенеза, хотя уровень экспрессии fz-2 в сомитной мезодерме постепенно снижается после ст. 12-14 сомитов. (Рис. 2A, [14]). Двойная гибридизация in situ insulin и fz-2 эмбрионов показала, что экспрессия- fz-2 концентрируется на поверхности соматической мезодермы и всей энтодермы, соседствующей с insulin-экспрессирующими клетками (Рис. 2A,B). Чтобы определить, экспрессируется ли fz-2 в insulin-позитивных клетках, мы сортировали GFP-позитивные и -негативные клетки из трансгенных эмбрионов insulin:GFP рыбок данио на ст. 20 сомитов, используя Fluorescent Automated Cell Sorting (FACS), выделяя общую РНК из каждой выборки, синтезировали кДНК и осуществляли RT-PCR анализ на присутствие fz-2 транскриптов в GFP-позитивных клетках. Как и ожидалось, EF-1α, позитивный контроль, но не insulin выявлялся в GFP-негативных клетках (Рис. 2C). Напротив, и EF1-α и insulin транскрипты обнаруживались в выборке GFP-позитивных клеток (Рис. 2C), указывая, что процедура сортировки клеток оказалась эффективной. Два разных набора праймеров разработаны для амплификации fz-2 транскриптов, продуцируемых полосами от GFP-негативных клеток, но не от GFP-позитивных клеток (Рис. 2C). Наш анализ показал, что fz-2 и insulin экспрессируются в соседних клетках, как показывает гибридизация in situ , они не ко-экспрессируются в одних и тех же клетках. co-expressed in the same cells.

Чтобы подтвердить идентичность разбросанных GFP-позитивных клеток у fz-2 MO-injected insulin:GFP эмбрионов, fz-2 morphant эмбрионы фиксировались спустя 24 hpf и анализировались в отношении экспрессии insulin с помощью гибридизации in situ . На ст. 24 hpf, эмбрионы рыбок данио дикого типа имеют одиночный островок, состоящий из 15-20 клеток по срединной линии. Напротив, insulin-экспрессирующие клетки у fz-2 morphant эмбрионов были разбросаны вдоль A-P оси одинаково с паттерном GFP-экспрессирующих клеток у fz-2 MO-injected трансгенных эмбрионов (Рис. 2F). Количество insulin-позитивных клеток у fz-2 morphants не существенно отличалось от контрольных эмбрионов несмотря на аномальную морфологию островка, указывая тем самым, что пролиферация клеток измененна несущественно (средние: 12 ± 2 клеток в диком типе и 10 ± 2 клеток в MO-injected, n = 25 в каждой группе).

Инъекции двух разных, ранее опубликованных MOs, нацеленных на не перекрывающиеся 5' области fz-2 мРНК, дают сходные эффекты на миграцию инсулин-экспрессирующих клеток. Более того, ко-инъекции двух fz-2 MOs давали в результате синергичное повышение процента эмбрионов с разбросанной экспрессией инсулина, указывая на специфическую роль fz-2 в образовании собственно островка (Рис. 2D). Чтобы оценить, является ли разбросанная экспрессия insulin , наблюдаемая у fz-2 MO-injected эмбрионов, специфической по отноешению к потере функции fz-2 , мы инъецировали также с 5 основаниями mismatch fz-2 MO, которые не оказали эффекта на миграцию insulin-экспрессирующих клеток (Рис.2E,G). Чтобы проверить специфичность наблюдаемого фенотипа у fz-2 MO-injected эмбрионов, мы проверяли способность синтетической fz-2 мРНК обращать наблюдаемые дефекты на миграцию insulin-позитивных клеток. Инъецируемая синтетическая fz-2 мРНК содержит β-globin 5' лидерную последовательность и не содержит последовательность fz-2 MO target-site. Инъекции fz-2 MO давали в результате 84% эмбрионов (n = 77) с разбросанной экспрессией insulin (Рис. 2E,F). Ни один из эмбрионов после инъекции fz-2 мРНК (n = 81) не обнаруживал разбросанной экспрессии insulin (Рис. 2E,H). Напротив, одновременные инъекции fz-2 MO и fz-2 мРНК давали значительно более низкие частоты эмбрионов (n = 112, p value = 0.001) с разбросанной экспрессией insulin по сравнению с эмбрионами, которым инъецировали только fz-2 MO (Рис.2E,I). Эти результаты демонстрируют, что разбросанная экспрессия insulin , наблюдаемая у fz-2 morphant эмбрионов является специфической для потери функции fz-2.

Т.к. семейство Fz белков функционирует в качестве рецепторов для Wnt белков, поэтому мы решили протестировать, не оказывает ли какой-нибудь Wnt белок сходный эффект на миграцию insulin-позитивных клеток. Потеря функции трех Wnts - wnt-5, -8, и -11 - вызывает онтогенетические аномалии, довольно сходные с наблюдаемыми у fz-2 morphants [16,17]. Среди них wnt-5 обладает наиболее сходным паттерном экспрессии с fz-2 во время сомитогенеза. У рыбок данио wnt-5 слабо экспрессируется в задней половине сомитной и латеральной мехзодермы и строго в хвостовой почке во время сомитогенеза [18]. Интересно, что двойная гибридизация in situ против wnt-5 и pdx-1 показала. что wnt-5 экспрессируется в ви де градиента РНК от задней границы экспрессии pdx-1 до хвостовой почки на ст. 10 сомитов, когда pdx-1 обнаруживается впервые (Рис. 3A). Однако, мы не обнаружили wnt-5 в GFP-позитивных клетках, выделенных от insulin:GFP трансгенных эмбрионов рыбок данио, это указывает на то, что wnt-5 не ко-экспрессируется с insulin (Рис. 2C, lane 10: compare to wnt-5 band from GFP-negative cells in lane 5).

Чтобы идентифицировать кандидата Wnt лиганда, мы использовали инъекции MOs против wnt-5, -8, и -11, которые эффективно давали мутантные фенокопии [17,19]. Мы получили Wnt-5, -8, и -11 morphants и проанализировали экспрессию insulin с помощью in situ гибридизации на ст. 24 hpf [17,19]. Образование островка осуществлялось нормально у Wnt-8 и -11 morphant эмбрионов, судя по экспрессии insulin, pdx-1, glucagon и somatostatin (Рис. 3B-D, data not shown). Напротив, анализ экспрессии insulin на 24 hpf у Wnt-5 morphant эмбрионов выявил разбросанную экспрессию insulin вдоль A-P оси, сходную с таковой у fz-2 morphant эмбрионов (Рис. 3E).

Для выяснения специфичности функции wnt-5 в формировании панкреатического островка мы создали второй MO, нацеленный на 3' splice-сайт экзона 3. Инъекции этого MO дает в результате эффективный пропуск экзонов 2 и 3, что ведет к проукции транскрипта длиной всего в 200 п.н. (Рис. 3M). Когда мы инъецировали этот MO, то эмбрионы обнаруживали разбросанную экспрессию insulin , сходную с таковой у эмбрионов, которым инъецировали блокирующие трансляцию wnt-5 MO (Рис.3I), это говорит о том, что зиготическая функция wnt-5 участвует в миграции insulin-позитивных клеток. Кроме того, инъекции five-base-mismatch wnt-5 MO давали эмбрионов с нормальной экспрессией insulin (Рис. 3F,I). Более того, наблюдаемый разбросанный паттерн экспрессии insulin у Wnt-5 morphant эмбрионов улучшается при добавлении wnt-5* мРНК, которая кодирует измененную wnt5 открытую рамку считывания, полученную в результате degenerate нуклеотидов в области вокруг точки старта трансляции, чтобы устранить targeting с помощью wnt-5 MO. Когда блокирующие трансляцию wnt-5 MO инъецировались только одни, то 65% эмбрионов (n = 75) обнаруживали разбросанную экспрессию insulin (Рис. 3E,I). Эмбрионы, инъецированные только нормальной wnt-5* мРНК давали 94% эмбрионов (n = 55) с нормальной экспрессией insulin (Рис. 3G,I). Процент эмбрионов с аномальной экспрессией insulin снижался до 12% (n = 53, p value = 0.003), когда эмбрионам ко-инъецировали wnt-5* мРНК (Рис. 3H,I).

Анализировали также экспрессию insulin при двух разных опубликованных мутантных аллелях wnt-5 (аллели мутантного локуса pipetail; kind gifts of Dr. M. Hammerschmidt (ppt^ti265) [20] и Dr. N. Hopkins(ppt^hi1780b) [21">21]). In situ анализ с использованием insulin маркера не выявил достоверного эффекта на развитие поджелудочной железы у эмбрионов, гомозиготных по любому из тестированных аллелей pipetail (data not shown). Морфологическое обследование эмбрионов от любого pipetail аллеля продемонстрировало существенную изменчивость между эмбрионами в отношении проявления pipetail эмбрионального фенотипа, с инсерционным аллелем (ppt^hi1780b) , обладающим в общем более тяжелым фенотипом. Аллель ppt^hi1780b обнаруживает фенотип, который менее экстремальный, чем эффекты, отмеченные для wnt-5 morphants (Рис.3J-L). Чтобы исследовать, может ли разбросанная экспрессия insulin , наблюдаемая у WNT-5 morphant эмбрионов, быть специфической относительно функции WNT-5, мы проверяли. чтобы посмотреть, не являются ли носители ppt^hi1780b аллеля более чувствительными к инъекциям wnt-5 MO (Table 1). Инъекция 2 ng или блокирующего трансляцию или нацеленного на экзон-интронное соединение wnt-5 morpholinos у эмбрионов дикого типа давали менее 5% эмбрионов с разбросанной экспрессией insulin . Мы инъецировали те же самые низкие дозы wnt-5 MOs в эмбрионы. полученные от скрещиваний между носителями аллеля wnt-5 ppt^hi1780b и рыбками дикого типа. При этом приблизительно 50% ожидалось носителей ppt^hi1780b аллеля. Это исследование выявило примерно 50% эмбрионов с разбросанной экспрессией insulin (Table 1). Более того, генотипирование индивидуальных эмбрионов показало, что 90% эмбрионов с аномальной экспрессией инсулина были носителями ppt^hi1780b (n = 20), тогда как 100% с нормальной экспрессией инсулина были дикого типа (n = 20), это говорит о том, что носители ppt^hi1780b аллеля более чувствительны к инъекциям wnt-5 MO [additional file 4]. Эти данные указывают на то, что наблюдаемый wnt-5 MO фенотип является специфическим для нарушенного wnt-5 гена и что зиготическая функция wnt-5 необходима для образования нормальных панкреатических островков.

Чтобы определить, какая ступень развития поджелудочной железы нарушается, мы анализировали паттерны экспрессии разных маркеров у fz-2 и wnt-5 morphant эмбрионов. Мы изучали ранние энтодермальные маркеры, mixer на 50% epiboly стадии и sox-17 на 90% epiboly стадии у fz-2 и wnt-5 morphant эмбрионов и нашли, что экспрессия mixer и sox-17 была нормальной у этих эмбрионов (Рис.4A-C,4D-F). Мы также изучали передний энтодермальный маркер, fox-A2 и задний энтодермальный маркер, gata-6, на ст. 24 hpf у дикого типа, fz-2 и wnt-5 morphant эмбрионов. Экспрессия fox-A2 и gata-6 была нормальной у fz-2 и wnt-5 morphant эмбрионов (Рис.4G-I, 4J-L). Эти результаты показывают, что аномальная экспрессия инсулина, обнаруживаемая у fz-2 и wnt-5 morphant эмбрионов, не обусловлена вторичными дефектами из-за аномальной спецификации и миграции энтодермы.

На ст. 24 hpf, somatostatin, маркер зрелых панкреатических δ-rktnjr, разбросан как и insulin у fz-2 и wnt-5 morphant эмбрионов (Рис.5A-C). Glucagon,который экспрессируется в панкреатических эндокринных α-клетках, разбросан вдоль A-P оси, но всё ещё экспрессируется по краю островка у fz-2 и wnt-5 morphants (Рис. 5D-F). Др. эндокринные панкреатические маркеры, islet-1 и fspondin-2b, также были разбросаны вдоль A-P оси (Рис. 5G-I, 5J-L).

На 3dpf ст., insulin-позитивные клетки остаются разбросанными у wnt-5 и fz-2 morphants (Рис.6A-C). Экспрессия экзокринного панкреатического маркера, carboxypeptidase-A, и печеночного маркера, ceruloplasmin, была снижена у fz-2 и wnt-5 morphant эмбрионов (Рис. 5D-I соотв.). Островков внутри экзокринной части панкреас не наблюдается ни у wnt-5 ни у fz-2 morphants (Рис. 5D-F). Это указывает на то, что панкреатические островки у wnt-5 и fz-2 morphants не полностью внедрены в экзокринную ткань, как это наблюдается у эмбрионов дикого типа. Однако, разбросанная экспрессия insulin скорее всего не затрагивается уменьшением экзокринной части поджелудочной железы, т.к. экзокринная часть у рыбок данио не развивается вплоть до завершения миграции insulin-позитивных клеток.

Наши результаты указывают на то, что fz-2 и wnt-5 имеют одинаковую функцию в развитии панкреатических островков. Интересно, что проверка профиля экспрессии транскрипционного фактора pdx-1выявила неожиданный фенотип у таких эмбрионов. Pdx-1 является одним из самых ранних известных маркеров для всей поджелудочной железы и является важным для раннего панкреатического развития и функции взрослых β-клеток [22]. Область экспрессии pdx-1 расширяется у fz-2 и wnt-5 morphants при анализе с помощью гибридизации in situ на ст. 24 hpf (Рис. 6J-L). На ст. 3dpf, pdx-1 экспрессия ограничивается панкреатическими островками, протоками и частично кишечником (Рис. 6M). Pdx-1-экспрессирующие клетки у fz-2 и wnt-5 morphant эмбрионов остаются разбросанными и не сливаются в один островок вплоть до ст. 3dpf (Рис. 6K,L) одинаково с insulin-экспрессирующими клетками. Кроме того, область экспрессии pdx-1 в кишечнике становится редуцированной у fz-2 и wnt-5 morphant эмбрионов по сравнению с эмбрионами дикого типа на 3dpf (Рис. 6M-O). расширение экспрессии pdx-1 на ст. 24 hpf и неправильная экспрессия на ст. 3dpf у fz-2 и wnt-5 morphants требует дальнейшего исследования.

Затем мы определяли могут ли wnt-5 и fz-2 взаимодействовать генетически. Во-первых, мы ко-инъецировали низкие дозы wnt-5 и fz-2 MOs. Если wnt-5 и fz-2 принадлежали бы к двум независимым сигнальным путям, то ко-инъекции MOs против этих генов давали бы аддитивное усиление аномальной экспрессии insulin . Напротив, синергичное увеличение эмбрионов с аномальной экспрессией insulin д. указывать, что wnt-5 и fz-2 или участвуют в одном и том же сигнальном пути или в двух путях, которые могут взаимодействовать в нормальных insulin-позитивных клетках. Инъекции низких доз wnt-5 MO дали 10% эмбрионов (n = 60) с аномальной экспрессией insulin . Инъекции низких доз fz-2 MOs дали 12% эмбрионов (n = 48) с аномальной экспрессией insulin . Совместные инъекции wnt-5 MO и fz-2 MOs, дали 55% эмбрионов (n = 59) с аномальной экспрессией insulin , синергичное увеличение процента эмбрионов с аномальной экспрессией insulin (Рис. 7A). Этот результат указывает на то, что wnt-5 и fz-2 могут взаимодействовать генетически в одном и том же сигнальном пути во время образования островков.

Чтобы проверить возможное прямое взаимодействие у рыбок данио wnt-5 и fz-2 мы использовали подход по индукции вторичной оси у Xenopus [23]. В такой системе Fz-зависимая индукция вторичной оси у Xenopus , как было установлено, является результатом непосредственной активации рецепторов (Fz) с помощью лиганда Wnt. Этот эффект может быть обусловлен с помощью Wnt лигандов и Fz рецепторов, которые обычно функционируют посредством или канонического или не-канонического сигнальных процессов. В этом эксперименте мы инъецировали или wnt-5 мРНК или fz-2 мРНК в два вентральных бластомера на ст. 4 клеток эмбрионов Xenopus . Инъекциии рыбкам данио wnt-5 РНК или fz-2 РНК вызывали укорочение и слегка изогнутое тело на ст. хвостовой почки без индукции какой-либо второй оси (Рис. 7B,E,F). Если же инъецировали совместно РНК в эмбрионы Xenopus , то более 50% эмбрионов обнаруживали вторую ось на ст. хвостовой почки (Рис. 7B,D). Это указывает на то, что у рыбок данио белки Wnt-5 и Fz-2 могут взаимодействовать функционально и передавать сигналы, если помещены в соотв. клеточные условия.

Чтобы определить, находится ли wnt-5 иерархически выше fz-2, мы удаляли Wnt-5 mtkjr путем инъекции wnt-5 MO и проверяли, может ли fz-2 мРНК устранять возникшие дефекты миграции. Когда только wnt-5 MO инъецировались, то 56% эмбрионов (n = 42) обнаруживали разбросанную экспрессию insulin (Рис. 8A,B). Инъекция только fz-2 РНК не вызывали существенных аномалий в экспрессии insulin (3% эмбрионов, Рис. 8A,C). Процент эмбрионов с разбросанной экспрессией insulin достоверно снижался до 20% (n = 50, p value = 0.019), когда fz-2 РНК ко-инъецировалась с wnt-5 MO (Рис. 8A,D). В контрольном эксперименте совместная инъекция wnt-5 MO и GFP РНК не снижала процента эмбрионов с аномальной экспрессией insulin (Рис. 8A).

Напротив, инъекции wnt-5 РНК не могут улучшать дефекты у fz-2 morphant эмбрионов (Рис. 8E). Инъекции fz-2 MO дают 80% эмбрионов (n = 106) с разбросанной экспрессией insulin . Инъекции wnt-5 РНК вызывают 5% эмбрионов (n = 42) с разбросанной экспрессией insulin . Совместные инъекции fz-2 MO и wnt-5 РНК давали 88% эмбрионов (n = 84) с разбросанной экспрессией insulin . Эти результаты демонстрируют, что fz-2 РНК может устранять аномальную морфологию островка, вызываемую wnt-5 MO, тогда как wnt-5 РНК не может устранять аномальную морфологию островка, вызванную fz-2 MO, это помещает fz-2 генетически ниже wnt-5 в этом процессе.

Чтобы проверить, что роль передачи сигналов Wnt-5 в развитии поджелудочной железы законсервирована у разных позвоночных, мы получали мышей, гетерозиготных по уже описанному Wnt5a нулевому аллелю [24]. Дикого типа и Wnt5a^-/- эмбрионы были собраны на ст. E16.5, E17.5 и E18.5. Хотя Wnt5a^-/- эмбрионы имели дефекты во многих структурах, размер и микроскопическая морфология поджелудочной железы были нормальными с характерным рыхлым лобулярным проявлением и нормальным анатомическим положением: с головкой панкреас, расположенной в изгибе двенадцатиперстной кишки и телом, ассоциированным с вентро-задней поверхностью большого сальника, и суживающейся хвостовой областью в направлении hilum селезенки (data not shown). Затем мы провели иммуногистохимический анализ последовательных срезов панкреас с антителами против insulin и glucagon на E16.5, E 17.5 и E18.5. В дикого типа и мутантной поджелудочной железе на E16.5, insulin-позитивные клетки были перемешаны с glucagon-позитивными клетками, как было описано ранее [4] и не обнаруживалось типичного зрелого распределения с инсулиновыми клетками, расположенными центрально, а glucagon клетками по периферии (Рис.9A-D). На E17.5, insulin-окрашивающиеся клетки становились более компактными, а glucagon-окрашивающиеся клетки начинали занимать периферическое распределение у мутантных и дикого типа мышей (Рис. 9E-H). Т.к. эта характерная клеточная архитектура не наблюдалась у мышей дикого типа до E17.5 [4,25], то появление периферического расположения glucagon-позитивных клеток в мутантных островках на ст. E17.5 говорит против задержки созревания.

Сходный паттерн наблюдался в островках на E18.5 с insulin-продуцирующими β-клетками в центре островков (Рис. 9I,K) и glucagon-продуцирующими α-клетками на периферии островков (Рис. 9J,L). Однако, если сравнивать с компактными и округлыми островками у эмбрионов дикого типа, то мутантные островки были выглядели полосами (streaked) вдоль панкреатических протоков (Рис.10C), одинаково как у мышей, лишенных EGF рецептора [6]. Этот фенотип также очень сходен с таковым у рыбок данио wnt-5 и fz-2 morphants, у которых glucagon позитивные клетки рассеяны вдоль A-P оси, хотя и позиционированы по периферии insulin-позитивных клеток (Рис. 5E,F).

Чтобы проверить, могут ли дефекты миграции эндокринных клеток во время образования островков вызывать streaked остроки у Wnt5a^-/- эмбрионов, мы использовали ранее описанный метод морфометрии [6]. Т.к. insulin-позитивные клетки отсоединялись и мигрировали прочь от панкреатических протоков, чтобы сформировать зрелые островки, то измерением миграции клеток островков может служить степень, с которой insulin-позитивные клетки остаются в прямом контакте с эпителием протоков. Чтобы оценить миграцию эндокринных клеток у Wnt5a нулевых эмбрионов, мы сконцентрировали наш анализ на ст. E18.5, чтобы оценить отделение insulin позитивных клеток от протоков. По сравнению с эмбрионами дикого типа количество островков, отделенных от протоков, было существнно снижено в поджелудочной железе Wnt5a^-/-эмбрионов (Рис. 10A). Только 15% небольших островков и 6% крупных островков были отдлены от протоков у мутантов, по сравнению с 56% (P < 0.001) и 40% (P < 0.05) соотв. у мышей дикого типа (Рис. 10B,C). Полученные результаты указывают на то, что передача сигналов Wnt5a также важна для процесса миграции insulin-позитивных клеток во время морфогенеза поджелудочной железы и у высших позвоночных. during morphogenesis of the pancreas in higher vertebrates.

The function of a wnt-5/fz-2 pathway in insulin-positive cell migration is most likely to provide the right environment and/or signals for insulin-positive cell migration during islet formation. Our time-lapse analysis of fz-2 MO-injected transgenic embryos shows that the insulin-positive cells still migrate, but their direction of migration is random indicating these cells have lost key positional information in the absence of the wnt5/fz2 signal (Рис. 1). In addition, our cell sorting analysis shows that wnt-5 RNA is expressed in a posterior-anterior gradient, potentially serving as a key step in establishing the positional information required by these migrating cells. Analysis of the receptor, fz-2, however, reveals a further complexity. Fz-2 RNA is detected in the cells immediately adjacent to the mis-migrating insulin-positive cells, suggesting that the function of wnt-5/fz-2 pathway activation in islet cell formation is a cell-non-autonomous and/or cell-cell instructive function in the transmission of this positional information (Рис. 2B). Interestingly, non-autonomous fz-mediated signaling has been observed during Drosophila development [51], but this process of information exchange does not require any cell migration movements or, apparently, any wnt ligand [52]. Further study is required to determine how the wnt-5/fz-2 signaling produces the right environment that allows normal insulin-positive cell migration during islet formation.

The activation of Wnt-5 signaling can change intracellular Ca²⁺ concentration [26]. One hypothesized function of the Wnt/Ca²⁺ pathway is to antagonize a second and simultaneously active Wnt/β-catenin pathway [27,28]. Wnt/β-catenin signaling is known to specify cell fate directly [2]. For example, reduction of maternal and zygotic wnt-5 activity using genetic approaches results in hyperdorsalized embryos [27]. Further investigation is required to determine whether wnt-5/fz-2 signaling provides the right environment and/or signals for normal insulin-positive cell migration by antagonizing the Wnt/β-catenin pathway or by another novel mechanism.

We observed an altered expression pattern of pdx-1 transcript in both wnt-5 and fz-2 morphant embryos. In our time-lapse imaging analysis, however, we observed that the initial specification of insulin-expressing cells was normal, and we observed no ectopic insulin-positive cells in spite of expanded pdx-1 expression in fz-2 or wnt-5 morphant embryos. Furthermore, the number of insulin-expressing cells is not increased in either fz-2 or wnt-5 morphant embryos even though these embryos displayed two or more insulin expression domains, sometimes with single cell patches, as observed in our time-lapse imaging analyses. These data suggest that the scattered insulin-expression is not due to ectopic islet formation. Future work will be required to detail the role (if any) for this expanded pdx-1 expression in abnormal insulin-positive cell migration.

Vertebrate pancreatic development is described here in one of its simplest forms in zebrafish (represented by a single islet at 24 hours of development) and by a more complex vertebrate system in mouse. Certain processes of pancreatic islet formation in zebrafish and mouse appear to be incongruent. For example, sonic hedgehog (shh), which is expressed in the entire endoderm except for the pancreatic endoderm, was shown to be a negative regulator of the adoption of pancreatic endoderm fate in mice [29,30]. In zebrafish, however, shh and other hh proteins are not expressed in the endoderm [31]. In addition, ectopic expression of shh induces a pancreatic cell fate rather than represses it, a result opposite to what was observed in mammalian models [31,32]. Despite these differences, the initial specification of insulin-expressing cells occurs before an islet is formed in both animals, and these insulin-positive cells migrate and form an islet at a distance from where they are initially specified. Even though a comparable structure to a duct does not exist in zebrafish at the stage when islet formation occurs, previous studies in mouse and our time-lapse imaging analysis show that this migration process of islet formation is similarly required to form normal islets in both mouse and zebrafish. The final disorganized islet phenotypes were observed as a result of abnormal migration of insulin-positive cells in both zebrafish and mouse embryos with disrupted Wnt5 signaling. These results argue that Wnt5 signaling is required in pancreatic islet formation of both mouse and zebrafish, a role most likely shared throughout the vertebrate lineage.

>Our results suggest that wnt-5 is upstream of fz-2 in the same genetic pathway and show that Fz-2 functions as a receptor for Wnt-5 when placed in the right environment, as assayed using the Xenopus secondary axis assay system. In mouse, fz-2 and wnt-5 transcripts are expressed at the highest level among different wnts and fzs in the developing mouse pancreas, providing evidence that wnt-5 and fz-2 are expressed at the right place and time to be involved in islet formation as a functional ligand and receptor pair [3]. In zebrafish, early fz-2 expression is observed during somitogenesis. This expression pattern coincides with the timing and location of insulin cell migration, indicating that fz-2 is expressed at the right time and place to be involved in normal insulin-positive cell migration in zebrafish. Although wnt-5, wnt-11 and wnt-8 are expressed at the 14-somite stage, only wnt-5 and wnt-11 transcripts are detected at the location close to the presumptive pancreatic endoderm marked by pdx-1. wnt-5 is not expressed in the endoderm, but it is expressed in adjacent mesoderm close to the posterior boundary of early pdx-1 expression. wnt-5 proteins may be secreted from the mesoderm and signal to adjacent endoderm. Furthermore, our data show that wnt-11 morphant embryos have a normal pancreatic islet formation, whereas wnt-5 morphant embryos have similar pancreatic islet formation defects as fz-2 morphant embryos placing wnt-5 as the best candidate ligand for fz-2 in pancreatic islet formation.

In embryos with defects in body axis elongation, some significant secondary effects on other organizing centers may occur. For example, zebrafish wnt-5 [20], wnt-8 [19], wnt-11 [33] and knypek [34] morphant or mutant embryos display undulating notochord, reduced body length and a number of other less apparent abnormalities. These defects could conceivably result in abnormal pancreatic islet formation. However, wnt-8 and wnt-11 morphant embryos display normal islet formation despite body elongation defects. This supports a specific role of Wnt-5 signaling in pancreatic islet formation that is not secondary to body elongation defects. In addition, injection of wnt-5 and fz-2 mRNA ameliorates the pancreatic islet formation defects in wnt-5 and fz-2 morphant embryos, respectively, but not the body elongation defects under the same conditions. These results strongly suggest that pancreatic islet formation is at least partially independent of the body axis elongation process. In addition, the initial specification of insulin-positive cells occurs at the right place and time in zebrafish embryos. The congregation of insulin-positive cells occurs normally, and glucagon cells surround the insulin-positive cells in mouse Wnt5a^-/-knockout embryos and wnt-5 and fz-2 morphant zebrafish embryos. Finally, the development of a grossly normal pancreas in Wnt5a^-/- mouse knockout embryos, and the subsequent defect in islet formation, emphasizes the possible function of Wnt5 signaling during later stages of pancreatic islet morphogenesis.

Мы изучали роль передачи сигналов Wnt-5 в морфогенезе панкреатических островков у эмбрионов рыбок данио и мышей. Time-lapse imaging insulin-позитивных клеток у трансгенных эмбрионов рыбок данио было установлено, что постепенное образование единственного островка у них является результатом активной миграции клеток. Мы продемонстрировали, что wnt-5 и fz-2 morphant эмбрионы имеют дефекты миграции insulin-позитивных клеток, которые доказывают роль передачи сигналов Wnt5 в этом процессе. Сравнительный анализ панкреатической ткани от Wnt5a нокаутных мышей показал, что эндокринные клетки специфицируются нормально в примитивном панкреатическом эпителии. Однако, эти insulin-позитивные клетки не способны мигрировать от протоков и формируют фрагментированные островки вокруг протоков с glucagon-экспрессирующими клетками, расположенными по периферии. Это говорит о том, что Wnt5a необходим для миграции insulin-позитивных клеток, но не для локальной организации внутри формирующегося островка, как у мышей, так и у рыбок данио. Всё это доказывает, что передача сигналов wnt-5/fz-2 необходима для миграции insulin-позитивных клеток во время развития поджелудочной железы и что эта функция законсервирована. Это исследование может помочь лучше понять роль передачи сигналов Wnt во время развития поджелудочной железы у позвоночных и при заболеваниях железы. Пути передачи сигналов Wnt участвуют в патогенезе рака [36,37]. Wnt5b, напр., идентифицирован как ген кандидат, награждающий чувствительностью к диабету типа 2 [38]. Wnt5a может ингибировать канонический Wnt путь путем способствования деградации β-catenin [28]. Интересно, что дисрегуляция β-catenin выявляется при различных формах озлокачествления, включая рак поджелудочной железы [39]. Наше исследование открывает новую роль передачи сигналов Wnt-5 в формировании панкреатических островков и предоставляет пример того, как передача сигналов Wnt функционирует в органогенезе.