В делящихся клетках эукариот микротрубочки, как полагают, участвуют во всех аспектах сборки веретена (1). В профазе длинные интерфазные микротрубочки деполимеризуются (3,4), а центросомы формируют (nucleate) M-фазные звезды из коротких и динамичных микротрубочек. После nuclear envelope breakdown (NEBD), астральные микротрубочки проникают в ядерную область, "выискивают и отлавливают" хромосомы и затем располагают из на веретене (4,5), но их максимальная длина составляет около 20 µm (7,8). Значит залавливание хромосом неэффективно если они на расстоянии более 40 µm от центросом (9). Хромосомны не полностью пассивны во время этого процесса, но могут облегчать свое отлавливание генерацией высокийх локальных концентраций RanGTP (10) и/или с помощью непосредсвенной закладки (нуклеации) микротрубочек на своей поверхности (11). Компьютерное моделирование показало, что с такой склонностью в отношениие "поиска и отлавливания" хромосом это может функционировать в соматических клетках (12). Однако модель также предсказывает, что отлавливание с помощью микротрубочек неэффективно в клетках с ядерами больше 30 µm в диаметре (12).
Ооциты животных накапливают большие количества ядерных белков и РНК для ранних эмбриональных делений и поэтому имеют очень большие ядра. Ооциты морских звезд являются типичным примером и прекрасной моделью для прижизненной конфокальной микроскопии благоаря прозрачности и быстрому созреванию. Ооциты арестовываются в мейотической профазе I имеют в диаметре 170 µm и содержат крупное в 80 µm ядро на анимальном полюсе клетки. Обычные для ооцитов конденсированные хромосомы (размером 1-2 µm) случано распределены по нуклеоплазме. Две центросомы располагаются на анимальном полюсе в виде сендвича между кортексом клетки и ядерной облочкой (13). После добавления гормона созревания 1-methyladenine ооциты посторно вступают в мейоз, приводя к NEBD в течение 20 мин (14). После NEBD хромосомы движутся в направлении центросом и формируют первое мейотическое веретено под клеточным кортексом, спустя 40 мин после добавления гормона. Выбрасывание первого полярного тельца спустя 1 ч. после воздействия гормона и затем мейоз I завершается (13).
Во время мейоза I хромосомы в ооцитах морских звезд и многих др. животных перемещаются на довольно длинные расстояния к веретену, чем у соматических клеток. Следовательно, "поиск и отлавливание" микротрубочками здесь довольно неэффективно. Было установлено, что в ооцитах морских звезд конгрессия хромосом управляется контрактильной сетью актина. Эта сеть формируется и заполняет область ядра после NEBD и с помощью её контракций внедренные хромосомы высвобождаются внутри пределов ~ в 30 µm микротубулярных звезд. Было показано, что этот механизм существенен, т.к. актин-деполимеризующие или стабилизирующие лекарства вызывают потери хромосом и ведут к образованию анеуплоидных яиц.
перед NEBD удается разглядеть крупные наборы цитоплазматических микротрубочек, прикрепленные к анимальному полюсу ядра (15)(Рис. 1а, время 3:24 и Suppl.Video S1). Эти микротрубочки быстро деполимеризуются во время ТВУИВ и центросомы начинают образовывать (nucleate) короткие М-фазные звезды с максимальной длиной в 15-20 µm. Тем не менее все хромосомы, включая и те, что удалены более чем на 40 µm от ближайших концов микротрубочек, движутся к направлении анимального полюса сразу же после NEBD. Это движение происходит за 5-10 мин. до контакта с микротрубочками с этими дистальными хромосомами, как это видно на живых клетках или с помощью иммунофлюоресценции. Это указывает на то. что мех анизм иной, нежели ловля микротрубочками ответственен за конгрессию хромосом в мейозе I. Мы деполимеризовали микротрубочки, используя nocodazole (Suppl. Fig. S1a). Мы установили, что конгрессия хромосом при этом протекает почти нормально. Все хромосомы оказывались в компактной группе под клеточным кортексом на анимальном полюсе (Fig. 2a,b).
Chromosome congression is actin-dependet
Т.к. микротрубочки не пригодны для перемещения на длинные расстояния хромосом, то мы исследовали др. компоненты цитосклета. Когда разрушался актиновый цитоскелет во время созревания с помощью latrunculin B (Suppl. Fig. S1b), то конгрессия отсутствовала у 75% клеток (Fig. 2a,b). Очевидно, что микротрубочки улавливают только ближайшие к ним хромосомы, тогда как более дистальные терядются (Fig. 2a). Т.к. хромосомы расположены случайно в ядре, то у оставшихся 25% клеток они, по-видимому, находились в непосредственной близости к центросомам перед NEBD и поэтому были все отловлены микротрубочками. Комбинированное воздействия nocodazole и latrunculin B вызывало полну неспособность к конгрессии хромосом (Fig. 2a,b).
На живых клетках получали трехмерные time-lapse (4-х-мерные) данные (Fig. 2c, Suppl.Videos S2-S5). В необработанных клетках отслеживание выявило две самостоятельные фазы движения. Во время NEBD хромосомы начинат двигаться синхронно со скоростью ~ 3 µm мин-1 в направлении анимального полюса, как будто связанные др. с др. (Fig.2d,e). C пустя 5-15 мин после NEBD, когда хромосомы вступают в пределы коротких астральных микротрубочек на расстоянии 20-40 µm от анимального полюса, то они индивидуально переходят на более высокую скоровть перемещения (более 12 µm мин-1) меняя направление и двигаяь прямо в направлении центросом (Fig. 2d,e; Suppl.Video S2) . Nocodazole полностью устраняет это второе быстрое перемещение, которое т. обр. соответсвует отлавливаюнию хромосом микртрубочками. В отсутствие микротрубочек хромосомы тем не менее продолжают двигаться с медленной скоростью, в конечном итоге достигая анимального полюса.
Инициальная медленная фаза существнно нарушается при деполимеризации актина. Высокие концентрации latrunculin B (2 µM), которые полнростью предупреждают полимеризацию актина, д. использоваться
за несколько мин. до NEBD. Это полностью устраняет пермещение дистальных хромосом (Fig. 2d,e) , которые не достигают анимального полюса (Suppl. Video S4). Несмотря на потерю хромосом анафаза инициируется без задержки, указывая тем самым, что checkpoint веретена легко обходится или не активен в мейзое I ооцитов морских звезд. Образуются анеуплоидные яйцеклетки. Результаты сходные с latrunculin B получаются и при использовании цитохолазина D (17,18).
NEBD triggers nuclear actin polymerization
Было показано, что зависимый от актина механизм необходим для высвобождения удаленных хромосом в пределах, где они могут быть отловлены микротрубочками. Перед NEBD значитальная фракция флюоресцентно меченного актина локализовалась около ядра, но не выявлялось каких-либо ядерных актиновых структур (Fig.3) и не наблюдалось окраски на полимеризующийся актин в ядрах фиксированных клеток. Кроме того, перед NEBD полимеризация не индуцировалась перфорацией ядра микроиглой, инъекциями phalloidin в ядра ооцитов или избыточной экспрессиией GFP-меченного актина, искусственно введенного в ядро, это указывает на то, что необходимо прохождение М-фазы для полимеризации актина в области ядра.
Напротив, в точности скоррелированое в пространстве и времени с NEBD наблюдается массивная полимеризация актина по краям ядра, непосредственно под ядерной оболочкой (Fig. 3c,d). Волна поляризации инициируется в течениеи 30-60 сек. перед фрагментацией ядерной мембраны (14). На этой стадии комплексы ядерных пор в основном разобраны и ядерная оболочка становится проницаемой для небольших dextrans, сходных по размеру с актином, а также белков в несколько сотен kDa. Поэтому мы полагаем, что после инициации хода М-фазы происходит cмешивание ядерного и цитоплазматического компартментов в результате NEBD, что индуцирует полимеризацию актина.
An F-actin network moves chromosomes
Инициальная полимеризация актина на месте разрушения ядерной оболочки быстро преобразуется в оболочку, заключающюю всё ядро (Fig. 3a, 4a). Актинова яоболочка затем деполимеризуется снова в течение 1-2 мин за исключением плотных участков актина вокруu хромосом (Fig.4a,b)/ Мы наблюдали филаменты, связывающие эти участки, но контраст был низким из-за большого пула растворенного флюоресцентного G-актина. Поэтому м экспрессировали усиленный (E)GFP-tagged F-actin-связывающий домен белка, связывающего актин, ABP-120 (EGFP-ABD)(19). Это позволило нам увидеть сеть актиновых филамент в области нуклеоплазмы, связанную с участками вокруг хромосом (Fig.4b,c; Suppl. Video S6,S7). Мы подтвердили идентичность структуры с той, что окрашивается phalloidin на фиксированных ооцитах (Fig. 4e) (20) или при микроинъекция phalloidin в живые ооциты (Fig. 4f). Было показано, что контракции актиновой сети передают внедренные хромосомы в анимальный полюс (Suppl.Videos S6, S7). Актиновые участки сохраняются вокруг хромосом во время движения с медленнрой скоростью (Fig. 4d) и исчезают вскоре после захватывания хромосом микротрубочками (Fig. 4a; Suppl. Video S6). Это предоставляет прямое объяснение для актин-зависимой фазы конгрессии хромосом. Более того, кусочки, покрытые плазмидной ДНК и инъецированные в ядра ооцитов, запускали образование актиновых участков, сходных с хромосомными, чего не происходило с просто кусочками. Следовательно, существует хроматин-специфический механизм nucleation актина (Fig. 4g; Suppl. Fig, S3 и Suppl. Videos S10, S11).
Depolimerization is required for contraction
F-актиновая сеть collapsed в напралвении анимального полюса со временем, указывая тем самым, что или образование пучков из филамент или деполимеризация д. управлять её контракцией. Изучали эффект двух лекарств (phalloidin и jasplakinolide), которые дестабилизируют актиновые филаменты (21). Клетки, обработанные любым из соединений, обнаруживали серьёзные потери хромосом, как при воздействии latrunculin B (Fig. 5). Важно, что обас соединения были также эффективны и после NEBD, указывая тем самым. что стабилизация актиновых филамент м. препятствовать контракции уже сформированной сети. В контрольных клеткиах сеть полностью демолимеризуется в теение менее 10 мин. Напротив, в клетках с инъецированным rhodamine-phalloidin, сеть всё ещё в основном интактна даже после 20 мин. после NEBD. Т.о., деполимеризация актина необходима для контракции сети. Наблюдения выявили распространение (streaming) тонких филамент в направлении анимального полюса. Мы полагаем, что направленность контракций д.б. обусловлена локальной деполимеризацией актина вокруг центросом и/или закрепления сети ядерного актина на клеточном кортексе анимального полюса (22). Это д. давать в результате механизм, подобный "неводу", при котором трехмерная сеть актина "подтягивается" с анимального полюса, принося её вместе с запутавшимися в ней хромосомами.
Хотя мы не наблюдали утолщений филамент при наблюдении вживую актиновой сети, мы не можем исключить миозином II управляемое образование пучков не вносит вклада, так как описаны морфологически сходные сети актиновых филамент в экстрактах яиц
Xenopus (23). В такой модели нуклеоплазма ооцитов морских звезд д. вести себя сходным образом с
in vitro сформированным контрактильным актомиозиновым гелем (24, 25) Если такой utm закреплен на анимальном полюсе, то миозином управляемые контракции также могут обеспечивать наблюдаемую направленность.
Actin dependence in oocytes of other species
In summary, we have shown that in starfish oocytes, microtubules alone are unable to capture chromosomes more than 40 u.m away from centrosomes. Instead, an actin 'fishnet' is essential for delivering chromosomes within the capture distance of microtubule asters. A similar architectural problem exists in many animal species, as oocytes have large nuclei for storing nuclear proteins and RNA. For example, Xenopus oocytes are morphologically similar to those of starfish and contain a microtubule array of 50-80-µm radius that has to capture chromosomes in a 500-pim diameter nucleus26. Consistent with our observations, disrupting the actin cytoskeleton with cyto-chalasin B has been reported to cause defects in spindle formation in Xenopus oocytes (27,28). Moreover, in meiosis I of mouse oocytes, chromosomes are known to move to the cell cortex in an actin-dependent manner, even in the absence of microtubules (29-31). This strongly suggests that actin nucleation on M-phase chromatin, which we directly visualized for the first time in starfish oocytes, is an evolutionarily conserved mechanism that is also functional in vertebrates and mammals. In starfish oocytes, failure of actin-dependent chromosome congression did not delay anaphase and consequently led to chromosome loss and aneuploidy. Such failure should have similar deleterious effects in Xenopus oocytes, because the spindle checkpoint is inactive in meiosis I (ref. 32), and although the checkpoint is active in mouse, oocytes escape checkpoint arrest after few hours (33). At least 5% of human oocytes are aneuploid, and aneuploidy is the leading cause of pregnancy loss and birth defects (34). It will therefore be important to test whether a similar actin-dependent mechanism is also involved in chromosome congression in humans.
Сайт создан в системе
uCoz
