В настоящее время хорошо известно, что нейроны, глия и микрососуды мозга организованы в хорошо структурированные единицы, называемые neurovascular units, участвующими в регуляции кровяного тока. В пределах этой структуры можно выделить ее подразделения – например, пока еще предполагаемые gliovascular units, в которых астроцитарная глия поддерживает функции особых популяций и территорий нейронов, а также связь с ассоциированными сегментами капилляров (2,3). В недавно проведенных исследованиях была показана важность эндотелиальных клеток мозга, формирующих гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в такой модульной организации, изучена физиология и фармакология передачи сигналов между глией и эндотелием, т.е участие эндотелиальных клеток в регуляции ГЭБ. В данном обзоре авторы представили данные о свойствах эндотелия мозга, вносящих существенный вклад в в его барьерные функции. Обсуждается также вопрос о том, каким образом межклеточные взаимодействия ведут к индукции специализированных признаков ГЭБ и ассоциированным клеточным типам. В обзоре рассматриваются работы, в которых ГЭБ рассматривается как динамическая система, обсуждаются также пути, с помощью которых может быть модулирована проницаемость ГЭБ, описана важная роль астроцитов и ГЭБ в регуляции ионного потока и объема. Рассматриваются патологические состояния, при которых нарушены функции ГЭБ, а также разработка защитных мер для эндотелия мозга, редуцирующих вторичные повреждения нейронов при острых и хронических расстройствах.

Барьеры ЦНС

Желудочки мозга и субарахноидальное пространство содержат спинномозговую жидкость (cerebrospinal fluid – CSF), которая секретируется хориоидным сплетением* в латеральном, третьем и четвертом желудочке (4). Три барьерных слоя ограничивают и регулируют молекулярный обмен в пространстве между тканью кровеносных сосудов и нервной тканью или их жидкостными пространствами (РИС.1). Это: 1) ГЭБ, сформированный церебрально-васкулярными эндотелиальными клетками между кровью и интерстициальной жидкостью ткани мозга (interstitial fluid – ISF); 2) эпителий хориоидного сплетения между кровью и вентрикулярной CSF и 3) арахноидальный эпителий между кровью и субарахноидальной CSF (5). Отдельные нейроны размером более 8-20 μm встречаются редко в капиллярах мозга, но они могут достигать миллиметров и даже сантиметров в CSF компартменте (6). Среди этих барьеров ЦНС ГЭБ осуществляет наиболее мощный контроль над непосредственным микроокружением клеток мозга.

Гематоэнцефалический барьер

ГЭБ сформирован эндотелиальными клетками, граничащими с микрососудами мозга (7-10) ( РИС.2). Он действует как «физический барьер», поскольку сложные tight junctions ( плотные контакты или непроницаемые перегородки) между соседними эндотелиальными клетками заставляют большинство молекулярных перемещений осуществлять transcellular (через клетки) путь через ГЭБ, а не paracellularly передвижение через соединения, как в эндотелии (11, 12) ( РИС.3). Небольшие молекулы газа (кислорода или углекислого газа) могут диффундировать свободно через липидные мембраны. Таким же путем проходят небольшие липофильные вещества, включая лекарственные препараты – такие как барбитураты и этанол. Наличие специфических транспортных систем на люминальной и аблюминальной (см. словарь терминов – abluminal membrane) мембранах регулирует transcellular перемещение небольших гидрофильных молекул, которые обеспечивают селективный «транспортный барьер», разрешая или облегчая прохождение необходимых питательных веществ в мозг и исключая попадание в него потенциально вредных соединений (10). И, наконец, комбинация внутриклеточных и внеклеточных ферментов обеспечивает «метаболический барьер» - эктоэнзимы, такие как пептидазы и нуклеотидазы способны метаболизировать пептиды и АТФ соответственно, а внутриклеточные ферменты - моноаминоксидаза и цитохром Р450 (1А и 2В) могут инактивировать многие нейроактивные и токсические соединения (13). Крупные гидрофильные молекулы (пептиды и протеины) в целом не пропускаются, однако они могут быть перемещены с помощью специфического receptor-mediated transcytosis (см. словарь терминов) или менее специфического adsorptive-mediated transcytosis (см. словарь терминов) (14). Однако эндотелий мозга имеет гораздо более низкую степень endocytosis/transcytosis активности, чем периферический эндотелий. Следовательно, термин «гемато-энцефалический барьер» подразумевает как активные, так и пассивные свойства эндотелия мозга. Т.к. прочные межклеточные контакты значительно ограничивают поступление гидрофильных соединений и имеется ограниченное поступление крупных молекул (пептиды), то нужно принимать во внимание эти обстоятельства при доставке лекарственных препаратов в ЦНС.

Большинство исследований по ГЭБ направлено на изучение мозгового капиллярного эндотелия, наиболее крупной поверхности обмена «кровь-мозг». Сходные свойства найдены в эндотелии артериол и венул мозга, хотя эти сегменты микрососудистой системы могут быть более нестабильными и подвержены более сильным модуляциям (см ниже).

Функции ГЭБ. ГЭБ играет несколько ролей (8, 10, 16). 1) Он питает мозг необходимыми питательными веществами и опосредует выход многих продуктов обмена.

2) Он ограничивает передвижения ионов и жидкости между кровью и мозгом, позволяя специфическим ионным транспортерам и каналам регулировать перемещения ионов, чтобы продуцировать мозговую интерстициальную жидкость (ISF), обеспечивающую оптимальную среду для нейральных функций (5). ISF сходна по составу в плазмой крови, но имеет более низкое содержание белков и более низкие концентрации K+ и Са2+, и более высокие концентрации Mg 2+. Более важно то, что ГЭБ защищает мозг от флуктуаций в составе ионов ( они могут встречаться после приема пищи или упражнений), что может нарушать синаптическую или аксональную передачу сигналов (17). Барьер помогает удерживать пул нейротрансмиттеров и нейроактивных веществ, которые действуют в центральной и периферической нервной системах, так, что сходные агенты могут быть использованы двумя системам без «перекреста». Из-за такой большой поверхности (примерно 20 кв.м на 1. 3 кг мозга) и короткого расстояния диффузии между нейронами и капиллярами, эндотелий имеет преимущество в регуляции микроокружения мозга. Эпителий choroid plexus ( РИС.1) также вносит определенный вклад в этот процесс (18) как и в другие процессы (например, в секреции ростовых факторов) (19). И, наконец, постоянные превращения и отток CSF и ISF помогают высвобождать крупные молекулы и метаболиты мозга, способствуя гомеостазу микроокружения мозга. (5).

Фенотип ГЭБ. В настоящее время много известно о специфических свойствах эндотелия мозга, способствующих его барьерным свойствам (физическим или химическим) и об отличиях между эндотелием мозга и эндотелием периферических тканей.

Плотные контакты более сложно устроены в эндотелии мозга и выглядят при freeze–fracture images как сеть нитей (полосок), сформированных внутримембранными частицами. Смыкание межклеточных щелей у них более эффективное (11. 20). Такие соединения значительно ограничивают даже передвижение небольших ионов, таких как Na+ и Cl- так что transendothelial electrical resistance (TEER), которая обычно составляет 2-20 ohm.cm2 в периферических капиллярах может быть более 1, 000 ohm.cm2 в эндотелии мозга (21).

Молекулярный состав плотных клеточных контактов (перегородок) был изучен в эпителии и эндотелии ( РИС.4). Наиболее важными молекулами этих плотных контактов являются трансмембранные белки occluding и claudin (см. словарь терминов). Окклюдин - это 60-65 kDa белок с карбокси (С)-терминальным доменом, способный связываться с белком zonula occludens protein 1 >(ZO-1). Оказалось, что основной функцией окклюдина является регуляция плотных контактов (12, 22). В ГЭБ экспрессия белков claudin 3 (изначально обозначаемого как claudin 1), claudin 5 и, возможно, claudin 12 способствуют высокому TEER (11, 20). Молекулы адгезии - JAM-A, JAM-B и JAM-C присутствуют в эндотелиальных клетках мозга и участвуют в формировании и поддержании плотных контактов. Трансмембранный белки соединены со стороны цитоплазмы со сложным (комплексным) массивом белков периферической мембраны, которые формируют крупные белковые комплексы – цитоплазматические бляшки (plaques). Внутри бляшек находится адаптерные белки с множеством доменов межбелкового взаимодействия, включая ZO-1, ZO-2 и ZO-3, Ca2+-dependent serine protein kinase CASK; MAGI-1, MAGI-2 и MAGI-3 ((membrane-associated guanylate kinase with inverted orientation of protein–protein interaction domains); partitioning defective proteins - PAR3 и PAR6; и MUPP1 ((multi-PDZ-protein 1). Эти белки способствуют организации второго класса белков бляшек – регуляторных и сигнальных молекул (включая небольшие GTPases) и их регуляторов, таких как регулятор G-protein signalling 5 (RGS5 и транскрипционный регулятор ZO-1-associated nucleic acid-binding protein (ZONAB. Недавно идентифицированный белок junction-associated coiled-coil protein JACOP может скреплять junctional complex с актиновым цитоскелетом. Межклеточные взаимодействия в зоне соединения стабилизируются с помощью adherens junctions (см. словарь терминов). (РИС.4).

Плотные контакты имеют жизненно важные функции не только в ограничении параклеточной проницаемости (gate function), но и в сегрегации апикального и базального доменов клеточной мембраны (fence function), поэтому эндотелий может приобретать поляризационные свойства (apical–basal), которые обнаружены в эпителии желудочно-кишечного тракта и почках (20). PAR3–atypical protein kinase C (aPKC)–PAR6 complex участвует в регуляции формирования плотных контактов и установлении полярности клеток.

Эндотелиальные транспортеры мозга, которые поддерживают питание мозга включают GLUT1 переносчики глюкозы, несколько аминокислотных переносчиков (включая LAT1, L-систему для крупных нейтральных аминокислот) и транспортеры для нуклеозидов, нуклеооснований и многих других веществ (10).. В других тканях идентифицировано несколько транспортеров органических анионов и катионов. Там где веществам нужно перемещаться против градиента концентрации, энергия может поступать от АТФ (как в семействе АВС транспортеров, включая P-glycoprotein (Pgp) и multidrug resistance-related proteins – MRPs) или Na + градиент создается действием аблюминальной Na+,K+-ATPase. Некоторые транспортеры (например, GLUT1 и LAT1) являются двунаправленными, перемещая вещества по градиенту концентрации, и они могут присутствовать как в люминальной так и в аблюминальной мембранах или только в одной из них.

Определение экспрессии GLUT1 на люминальной и аблюминальной мембранах осложняется тем, что некоторые антитела не распознают транспортеры, когда маскируется С-терминаль - как это наблюдали в люминальной мембране (23). Среди эффлюксных транспортеров (осуществляющих обратный транспорт) Pgp концентрируется на люминальной мемебране (24), а Na+ зависимые транспортеры в целом являются аблюминальными, специализированными для передвижения растворимых веществ из мозга (25, 26). Среди них несколько Na+ зависимых глутаматовых транспортеров (excitatory amino acid transporters 1–3 – EAAT1-3 (27)/ которые перемещают глутамат из мозга против мощного оппозитного грандиента концентрации (<1 μM в ISF по сравнению с ~100 μM в плазме) (РИС.2). Четкая апикально-базальная полярность эндотелиальных клеток мозга, о которых говорилось ранее, отражается, следовательно, в их поляризованных транспортных функциях (20, 28).

Индукция свойств ГЭБ

Почему кровеносные сосуды эндотелия, растущие в мозге во время развития, столь специализированы? Еще первые гистологические исследования показали, что капилляры мозга окружены или связаны с клетками самого разного типа, включая периваскулярные концевые ножки (perivascular endfeet – см. словарь терминов) астроцитарной глии, перициты (pericytes – см. словарь терминов), микроглию и отростки нейронов (РИС.2). В самых крупных сосудах (артериолах, артериях и венах) гладкие мышцы формируют непрерывный слой, замещая перициты (1). Обычно тела нейронов находятся на расстоянии не более ~10 μm от капилляров (6). Такие тесные межклеточные связи, особенно между астроцитами и капиллярами мозга, привели к предположению о том, что они могут опосредовать индукцию специфических признаков барьерного фенотипа в эндотелии капилляров мозга (29).

Астроциты имеют крайне разнообразную морфологию в зависимости от их локализации и связи с другими типами клеток. Из примерно 11 разных фенотипов, которые достаточно легко распознаются, 8 имеют специфические взаимодействия с кровеносными сосудами (30). Имеются убедительные доказательства, особенно при исследованиях в культуре клеток, что астроциты могут апрегулировать многие признаки ГЭБ, приводя к образованию плотных контактов (физический барьер) (31,32), экспрессии и поляризированной локализации транспортеров, включающих Pgp (24) и GLUT1 (33) (транспортная функция) (9,34-36). Недавно описано еще несколько типов клеток в ГЭБ – перициты, периваскулярные макрофаги и нейроны, которые также способствуют барьерной индукции (37-43). Учитывая сложность барьерных свойств ГЭБ и анатомические связи ассоциированных с ним клеток, неудивительно обнаружить синергические индуктивные функции, в которых задействован не один тип клеток. Например, астроциты нужны для правильной связи эндотелиальных клеток и перицитов в tube-like структуре in vitro (38), что подтверждает тот факт, что связь между тремя типами клеток также необходима для правильной дифференцировки капилляров мозга in vivo.

Была также обнаружена обратная индукции, при которой эндотелий мозга усиливает рост и дифференцировку ассоциированных астроцитов (44, 45). Апрегуляция эндотелиального фермента γ glutamyl transpeptidase (γ GTP) включает двухстороннюю индукцию с астроцитами (46). А совместное культивирование приводит к апрегуляции антиоксидантных ферментов как в эндотелиальных клетках, так и в астроцитах (47).

Специализация периваскулярных концевых ножек астроцитов. Астроциты происходят из эпендимоглии (ependymoglia) развивающейся нервной трубки и сохраняют некоторые признаки своей оригинальной апикально-базальной полярности (28, 30). Периваскулярные концевые ножки астроцитов, тесно прилегающие к стенкам микрососудов, имеют несколько признаков – высокую плотность orthogonal arrays of particles (OAPs) (см. словарь терминов), содержащих водный канал aquaporin 4 (AQP4) и Kir 4 K+ канал, участвующие в регуляции ионного обмена и объема (см. ниже). OAPs/AQP4 полярность астроцитов коррелирует с экспрессией agrin (heparin sulphate proteoglycan) на basal lamina (см. словарь терминов) (48). Agrin аккумулирует микрососуды мозга в ГЭБ во время его уплотнения, что важно для целостности ГЭБ (20). Сплайс-вариант агрина Y0Z0 является специфическим компонентом эндотелиальной базальной мембраны капилляров ЦНС. Агрин необходим для сегрегации AQP4 в периваскулярные концевые ножки посредством связывания агрина с α -dystroglycan (член dystrophin–dystroglycan complex - DDC), которые соединяется с AQP через α1-syntrophin (другой член DDC). α -Syntrophin также связывает Kir4.1, что объясняет ко-локализацию Kir4.1 и AQP4. Точная локализация этого сложного массива мембранных белков в концевых ножках астроцитов закрепляется аргином в базальной мембране, что отчасти доказывает то, что внеклеточный матрикс вносит важный вклад в индуктивное воздействие между эндотелием и астроцитами.

Индуцирующие факторы. Астроциты способны секретировать широкий спектр химических агентов (9, 28, 36,49). Некоторые из этих глия-производных факторов, включая transforming growth factor-β (TGFβ), glial-derived neurotrophic factor (GDNF) (50), basic fibroblast growth factor (bFGF) и angiopoetin 1 (ANG1, действующий на TIE2endothelium-specific receptor tyrosine kinase 2) могут индуцировать фенотип ГЭБ в эндотелиальных клетках in vitro (51). И, напротив, было показано, что endothelium-derived leukaemia inhibitory factor (LIF) индуцирует дифференцировку астроцитов (45). Дефекты в функциях ГЭБ при некоторых нейропатологиях, особенно те, в которые вовлечена глия (см. ниже), подтверждают, что продолжающаяся индукции во время взрослой жизни необходима для нормальной функции.

Модуляция функции ГЭБM

Уже сам термин «барьер» свидетельствует о фиксированной структуре, однако сейчас известно, что многие (и возможно большинство) признаков фенотипа ГЭБ могут быть модулированы, т.е. могут претерпевать некоторые изменения (16). Одни из первых примеров модуляции были обнаружены при экстремальных и патологических состояниях. Например, раскрытие плотных контактов ГЭБ наблюдали при воспалительных процессах, способствующих появлению отеков (52), а апрегуляцию экспрессии GLUT1 транспортера в ГЭБ наблюдали при голодании и гипоксии (53, 54). Белок лептин (leptin) может усиливать трансцитоз (трансцитоз - перенос макромолекул через интактные клеточные барьеры) пептида урокортина через ГЭБ, участвуя в регуляции питания (55). Некоторые из воспалительных медиаторов, которые усиливают проницаемость капилляров на периферии (например, гистамин и брадикинин) также действуют на эндотелий (56). Имеются доказательства, что посткапиллярные венулы особенно уязвимы к раскрыванию при воздействии медиаторов воспаления (57,58) значимых при таких патологиях как, например, рассеянный склероз. ГЭБ Pgp функция изменяется при некоторых заболеваниях (59). Например, апрегуляция Pgp больше часа в день может наблюдаться при оксидативном стрессе (60) и при воздействии глутамата (61). Оказалось, что стероидная апрегуляция вовлекает транскрипционную регуляцию через ядерный pregnane X receptor (PXR) (62). Более быстрая модуляция (по шкале времени в секундах) может быть достигнута c помощью специфических Pgp ингибиторов и конкурентов (59), в то время как эндотелин 1 (endothelin 1) может вызывать функциональное подавление (63).

Эти наблюдения напоминают свойства рецепторов присутствующих в эндотелии мозга, которые способны опосредовать модулирование ГЭБ. Культивируемые эндотелиальные клетки мозга и астроциты экспессируют функциональные рецепторы для большого числа агентов, действующих как нейротрансмиттеры и модуляторы в мозге (56, 64). (BOX 1). Т.к. многие из них также высвобождались астроцитами и эндотелием, то существует возможность передачи сигналов между клетками в нейророваскулярной единице, включая микроглию и олигодендроциты (65-67) ( РИС. 5). Такая быстрая передача сигналов (от секунды до минут) часто опосредованная агентами с коротким периодом полураспада, отличается от долгосрочного процесса индукции, о котором говорилось ранее (от часов до нескольких дней), который включает регуляцию генной транскрипции и требует белкового синтезе.

Тот факт, что агенты, высвобождаемые во время нормальной нейральной активности, могут потенциально влиять на астроциты и эндотелий также дает возможность предположить, что сигнализирование, вовлекающее эндотелий мозга и глию, может встречаться физиологически. Например, гистамин, высвобождаемый из терминалей нейронов, позволяет проникать ростовым факторам и антителам в мозг из плазмы или «просеивать» состав плазмы (9). И, напротив, механизмы уплотнения барьера могут быть важны при стрессах или гипоксии. Известно, что заболевания, при которых повышены концентрации внутриклеточного циклического АМФ, могут сопровождаться увеличением TEER и апрегуляцией активности Pgp (68). Транскрипционный фактор NF-κB может изменять экспрессию белков плотных контактов и т.о. регулировать проницаемость ГЭБ (6). Несколько регуляторных механизмов влияют на транспорт глюкозы и аминокислот через эндотелий мозга (70). В культивируемых эндотелиальных клетках мозга транспорт глюкозы может быть увеличен гистамином и АТФ, что может быть частью механизма, посредством которого астроциты воспринимают нейральное firing и передают сигналы капиллярам для поддержания уровня глюкозы (71-73). Было показано, что поглощение глюкозы эндотелием увеличивается при действии факторов, высвобождаемых из астроцитов при гипогликемии (74).

Пути сигнальной трансдукции, участвующие в модуляции ГЭБ были изучены достаточно подробно. Некоторые из рецепторов, найденные в эндотелии мозга, и астроциты вызывают увеличение концентрации Са+ во время активирования (75, 76), а Са+ опосредованная передача сигналов является одним из механизмов, посредством которого клетки ЦНС взаимодействуют с соседними клетками и меняют их активность (77) ( РИС.5). Распространение волны Са через синцитиум астроцитов со скоростью примерно 100 μm s-1 может быть запущено активированием 5-hydroxytryptamine (5-HT, serotonin) или рецепторами глутамата, или механической стимуляцией (78,79). Inositol-1,4,5-trisphosphate – достаточно небольшая молекулы, может диффундировать через плотные контакты и может опосредовать межклеточное распространение волны (80), тогда как локальное высвобождение глутамата или АТФ может передавать сигнал соседним клеткам (81). Исследования культивируемых клеток показали, что эндотелиальные клетки могут также соединяться с межклеточными gap junctions и высвобождать и реагировать на АТФ, давая возможность распространения сигнала по капилляру in situ (82). Т.о., такой механизм может координировать активность нейронов, астроцитов и эндотелия в и между нейромышечными микродоменами. Сигнальное взаимодействие между микроглией, астроцитами и нейронами также наблюдали в культуре (66, 83) и это может быть важным при различных патологиях.

Каковы downstream последствия такого сигнализирования? Увеличение внутриклеточной концентрации Са+ может вызвать изменения в числе эффекторных белков эндотелия мозга посредством нескольких путей сигнальной трансдукции, включая фосфорилирование цитоскелетных белков и раскрывания плотных контактов (11, 52). Учитывая огромный репертуар агентов высвобождаемых астроцитами (9, 49), многие из которых имеют соответствующие рецепторы в эндотелии мозга, можно предположить широкий спектр разных и сложных реакций эндотелия. Активация нейронов может передавать сигналы в эндотелий либо прямо, либо через астроциты, приводя к модулированию эндотелия мозга для усиления его эффективности как источника питания и метаболического аппарата (71-73). Недавно появилась возможность исследования передачи сигналов в нейромышечной единице на срезах мозга, что дает возможность проверки гипотез, высказанных на основании исследований в культуре (BOX 2).

Регуляция ионов и объема в ГЭБ

Астроциты занимают стратегическое положение между капиллярами и нейронами. Gap junctions между отростками астроцитов позволяют им осуществлять связь друг с другом. Другие отростки астроцитов находятся в контакте с эндотелиальными клетками капилляров, формирующими ГЭБ (30) РИС.2). При нормальной мозговой активности нейроны высвобождают нейротрансмиттеры и K+ и поглощают Na+, тогда как метаболизм глюкозы генерирует воду со скоростью примерно 28 nl g-1 min-1 (84). Обычно нейротрансмиттеры и ионы рециркулируют, тогда как вода должна удаляться из мозга. Астроциты способствуют ионному, аминокислотному, нейротрансмитерному и водному гомеостазу мозга неколькими путями, а астроциты, которые формируют периваскулярные концевые ножки в ГЭБ, играют особую роль (85) в этих процессах.

Увеличение внеклеточного K+ вокруг астроглиальных отростков ведет к входу K+ и мембранной деполяризации, а электрохимический градиент может вести к утечке K+ в отдаленных отростках (86).

Нейротрансмиттерный рециклинг может вести к локальным изменениям ионов и воды. Глутамат является основным возбудительным нейротрансмиттером мозга, а отростки астроцитов, окружающие синапсы, могут поглощать глутамат через транспортные белки (особенно через EAAT1 and 2). Этот транспорт является Na+ зависимым и сопровождается поглощением ионов и воды, способствуя водному клиренсу ГЭБ (85). Глутамат превращается в глутамин в астроцитах и возвращается в нейроны. Небольшие вздутия на асроцитах, которые появляются во время нейрональной активности, возникают в результате активации глутаматом или поглощения ионов, ведя к клеточным механизмам, способствующим восстановлению ионного баланса и клеточного объема, некоторые из которых вовлекают повышенную концентрацию Ca2+ (66, 91, 92). Следовательно, имеется множество связей между процессами передачи сигналов и иррегуляторными процессами, которые имеются в нейроваскулярной единице.

Изменения ГЭБ при патологических состояниях

При некоторых расстройствах функции ГЭБ могут быть изменены ( BOX 3).

Некоторые из них связаны с нарушениями эндотелиально-глиального взаимодействия. Т.о., капилляры многих глиальных опухолей являются более проницаемыми по сравнению с нормальной мозговой тканью. Это может быть результатом или отсутствия индуктивных факторов, или результатом высвобождения факторов проницаемости – например, vascular endothelial growth factor (VEGF). Кроме того, белок плотного контакта claudin 1/3 даунрегулируется при некоторых опухолях мозга (93, 94).

При нарушениях ГЭБ агрин исчезает из аблюминальной поверхности мозговых эндотелиальных клеток, находящихся рядом с концевыми ножками астроцитов (11). Это может вносить определенный вклад в повреждение ГЭБ при болезни Альцгеймера (95) и перераспределение астроцитарного AQP4 в глиобластомах (96). Экспрессия астроцитарного AQP4 апрегулируется при отеке мозга, индуцируемого нарушениями ГЭБ. Такая апрегуляция может носить адаптивный характер помогая удалить накопившуюся жидкость. AQP4 -/- мыши имеют защиту против ишемического отека мозга (48).

Некоторые хронические заболевания – например, рассеянный склероз, могут сопровождаться нарушениями ГЭБ (11), которые появляются значительно раньше нейрональных повреждений. А это свидетельствует о том, что сосудистые нарушения могут вести к вторичным нейрональным нарушениям (97).

При эпилепсии нормальный паттерн экспрессии ABC транспортера может быть изменен, затрагивая апрегуляцию Pgp в астроцитах и эндотелии (98, 99). Это может быть адаптивной реакцией на ослабление барьера, что часто наблюдают во время припадка.

У моделей болезни Альцгеймера накопления амилоида (Аβ) часто встречаются вблизи сосудов, что оказывает токсическое действие на эндотелий и астроциты, и наблюдается еще до утраты нейронов (1). Нарушения гомеостаза в ЦНС, возникшее в результате неполноценности ГЭБ, может способствовать развитию и обострению более поздней патологии (100). Недавно Kortekaas et al (101) показали повышенное поглощение Pgp субстрата (11С) verapamil используя positron emission tomography (PET) в среднем мозге больного с болезнью Паркинсона, что согласуется с нарушением функции Pgp в ГЭБ.

Способность агентов, высвобождаемых во время воспаления, увеличивать проницаемость мозгового эндотелия, может зависеть от ассоциативных клеточных типов ( РИС.6). Bradykinin может активировать NF- B в астроцитах, приводя к высвобождению interleukin-6 (IL-6), который может амплифицировать эффект, действуя на эндотелий (102). Фактор некроза опухолей (tumour necrosis factor-α -TNFα) может увеличивать проницаемость ГЭБ, путем прямого действия на эндотелий (103) и непрямыми действиями, включая образование эндотелиального endothelin 1 и высвобождение IL-1β из астроцитов в сложном иммуннорегуляторном цикле (104).

Системные инфекции могут обострять воспалительную патологию ЦНС (например, рассеянный склероз) несколькими механизмами, включая активирование уже заполненных центральных макрофагов (105). Способность ГЭБ транспортировать цитокины может способствовать связи между заболеваниями центральной и периферической нервными системами (106).

Недавно было высказано предположение, что активирование астроцитов и клеток микроглии может поддерживать нейропатическую боль (107). Т.к. астроциты имеют обширные gap junctiona соединения и формируют глиальные сети, то предположили, что глия может участвовать в распространении болевых ощущений. При повреждении некоторые вещества высвобождаются из центральных и периферических нейронов, соединительнотканных клеток и кровяных клеток. Многие из этих веществ, такие как субстанция Р, calcitonin gene-related peptide (CGRP), serotonin, histamine и АТФ могут воздействовать на ГЭБ как из крови, так и из нервной ткани. Например, высвобождение IL-1 β ведет к снижению концентрации или изменению локализации белка плотных контактов occludi и увеличивает проницаемость ГЭБ. TNFα, гистамин и интерферон- γ , высвобождаемые при воспалении, могут также вызывать изменения в проницаемости эндотелия мозга (108).

Об участии микроглии в передаче сигналов в патологической нейроваскулярной единице уже говорилось выше (66, 67). Возможно, что повреждение эндотелия и базальной мембраны ведет к экспрессии эндотельальных рецепторов, которые в норме даунрегулированы (например, рецепторы для таких нуклеотидов как АТФ), что дает возможность образования новым коммуникационным связям между эндотелием, перицитами, астроцитами и микроглией, которые крайне важны для репарации ГЭБ.

Targeting the BBB to fight disease

ГЭБ как терапевтическая мишень. На рис.3 показано каким образом информацию, проходящую через ГЭБ, необходимо принимать во внимание при разработке стратегии доставки лекарственных препаратов в мозг при лечении неврологических расстройств. Учитывая то, что повреждения ГЭБ могут проявляться достаточно рано при многих расстройствах, неудивителен растущий интерес к ГЭБ как к терапевтической мишени (109-112). Логика заключается в том, что если дисфункции ГЭБ могут быть устранены, то терапия может быть применена при тех болезнях, при которых нейрональные повреждения являются вторичными по отношению к нарушениям ГЭБ. Стероиды, такие как дексаметазон, широко используются для уменьшения воспаления и являются обычными средствами при лечении отеков мозга (113). Сейчас известно, что дексаметазон может улучшать барьерные функции, не только усиливая плотность эндотелиальных плотных контактов (114), но и регулируя Pgp ГЭБ (59).Блокаторы Ca2+ канала могут уменьшать повреждение мозга при гипоксии (115) и гипертонии (116), снижая Ca2+-опосредованное увеличение проницаемости ГЭБ. Локальная гипотермия мозга снижает повреждение ГЭБ и отек после внутримозгового кровоизлияния, уменьшая т.о. тяжесть мозгового повреждения (117, 118). Ингибитор pancaspase снижает проницаемость эндотелия мозга и отек после субарахноидального кровоизлияния (119). Такое смещение акцента - от спасения нейронов к лечению ГЭБ – означает, что сам эндотелий мозга становится мишенью для действия лекарственных препаратов.

Сейчас известно, экспрессия каких генов в эндотелии апрегулирована при заболеваниях (120). Некоторые из них могут быть мишенями для генотерапии. Однако здесь нужна осторожность, т.к. многие из изменений могут играть защитную функцию в эндотелии и одни и те же агенты, которые деструктивны на одних стадиях болезни (например, некоторые цитокины) могут иметь важное защитное действие на более ранних стадиях болезни или при более низких концентрациях. Более того, взаимодействие между агентами, как ингибиторными, так и потенцирующими, затрудняют разработку стратегии для отдельных веществ или рецепторов.

VEGF который увеличивает проницаемость эндотелия мозга при внутривенном введении, обладает нейрозащитными свойствами и уменьшает проницаемость ГЭБ после ишемии при введении интравентрикулярно (121). Это свидетельствует о том, что он оказывает или дифференциальное действие on the apical versus the basal side эндотелия мозга или способен действовать через другие клетки со стороны мозга. Т.к. роль межклеточного взаимодействия в нейроваскулярной единице становится понятнее, другие клетки, ассоциированные с ГЭБ, могут также быть значимыми терапевтическими мишенями (122).

Ослабление ГЭБ с терапевтическими целями.Большинство методов лечениz, о которых говорилось выше, были связаны с улучшение транспортной функции ГЭБ. Противоположный подход – специальное ослабление плотных контактов эндотелия мозга – является предметов активного обсуждения в литературе (123). Известно, что ослабление ГЭБ в целях терапии (для перфузии гиперосмолярного раствора) имело некоторый положительный эффект при доставке веществ к опухолям (123, 124). Механизм ослабления может включать фосфорилирование adherens junction protein β- catenin (125). Попытки вызвать контролируемое ослабление ГЭБ, используя аналоги воспалительных медиаторов, таких как брадикинин (Cereport, also called RMP-7) дали обещающие результаты при исследованиях на животных, но не воспроизводились при клинических испытаниях (126).

Перспективные стратегии для ГЭБ. Появилось достаточно много исследований, где показано, что поддержание эндотелия в должном состоянии может снижать тяжесть системных сосудистых заболеваний и предотвращать их появление у лиц из группы риска. К таким заболеваниям можно отнести атеросклероз, волчанку и диабет (127-130). Умеренные упражнения (131, 132) и диета, обогащенная рыбьим жиром (133, 134), фруктами (135. 136), соей (137, 138), витаминами С и Е (139-141), чесноком (127) и красным вином (142) может быть очень полезной (143).

Защита ГЭБ задерживает или предупреждает развитие хронической нейродегенерации. Многие вещества, полученные из растений – флавониды и др. полифенольные агенты, которые изучаются как нейропротекторы (144), также положительно влияют на эндотелий мозга (145, 146). Цитокин эритропоэтин, главный регулятор эритропоэза, обладает защитным действием против мозговых нарушений in vivo и защищает культивируемые нейроны от токсического действия (147). Более того, он защищает эндотелий мозга от VEGF-индуцированной проницаемости путем снижения уровня эндотелиальной nitric oxidase synthase (eNOS) и восстановления белков плотных контактов (148).

Заключительные замечания и перспективы

Авторы показали, что специфические взаимодействия между эндотелием и астроцитами в нейроваскулярной единице могут влиять на ГЭБ при физиологических и патологических состояниях. Взаимная индукция помогает установить дифференцированный фенотип клеток, участвующих в этих связях, апрегулирующих барьерные свойства в эндотелии, а также специфические признаки астроцитарных концевых ножек, включая те, которые необходимы для регуляции ионного и водного обмена. При некоторых патологических состояниях нервной системы на самых ранних стадиях могут быть выявлены нарушения ГЭБ, еще до нейрональных нарушений. В связи с этим ранние терапевтические воздействия на ГЭБ могут уменьшить тяжесть нейропатологических симптомов и способствовать восстановлению функций мозга. Даже профилактическое лечение для поддержания ГЭБ в нормальном состоянии имеет важное значение для предупреждения или отсрочки нейродегенерации. В будущем подробные исследования механизмов, участвующих в эндотелиально-астроцитарном взаимодействии, могут способствовать терапии, мишенью которой будет ГЭБ. Улучшение методов исследования необходимо для того, чтобы заполнить пробел между исследованиями в культуре клеток и на экспериментальных моделях. Необходимо также улучшать методы изображения живого мозга и мониторинга его функций, чтобы рано распознавать заболевание у человека. И, наконец, различия в генетическом статусе, половые и возрастные различия, и различия в средовых воздействиях могут влиять на ГЭБ. Поэтому успешность лечения может зависеть от индивидуальных качеств и развития «персонифицированной медицины».

Литература

1

Iadecola, C. Neurovascular regulation in the normal brain and in Alzheimer's disease. Nature Rev. Neurosci. 5, 347–360 (2004). 2

Anderson, C. M. & Nedergaard, M. Astrocyte-mediated control of cerebral microcirculation. Trends Neurosci. 26, 340–344 (2003). 3

Nedergaard, M. , Ransom, B. & Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523–530 (2003). 4

Davson, H. & Segal, M. B. Physiology of the CSF and Blood–Brain Barriers (CRC, Boca Raton, USA, 1995). 5

Abbott, N. J. Evidence for bulk flow of brain interstitial fluid: significance for physiology and pathology. Neurochem. Int. 45, 545–552 (2004). 6

Schlageter, K. E. , Molnar, P. , Lapin, G. D. & Groothuis, D. R. Microvessel organization and structure in experimental brain tumors: microvessel populations with distinctive structural and functional properties. Microvasc. Res. 58, 312–328 (1999). 7

Risau, W. & Wolburg, H. Development of blood–brain barrier. Trends Neurosci. 13, 174–178 (1990). 8

Abbott, N. J. & Romero, I. A. Transporting therapeutics across the blood–brain barrier. Mol. Med. Today 2, 106–113 (1996). o 9

Abbott, N. J. Astrocyte–endothelial interactions and blood–brain barrier permeability. J. Anat. 200, 629–638 (2002). o 10

Begley, D. J. & Brightman, M. W. Structural and functional aspects of the blood–brain barrier. Prog. Drug Res. 61, 40–78 (2003). 11

Wolburg, H. & Lippoldt, A. Tight junctions of the blood–brain barrier: development, composition and regulation. Vasc. Pharmacol. 38, 323–337 (2002). 12

Hawkins, B. T. & Davis, T. P. The blood–brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol. Rev. 57, 173–185 (2005). o 13

El-Bacha, R. S. & Minn, A. Drug metabolizing enzymes in cerebrovascular endothelial cells afford a metabolic protection to the brain. Cell. Mol. Biol. 45, 15–23 (1999). o 14

Pardridge, W. M. Blood–brain barrier drug targeting: the future of brain drug development. Mol. Interv. 3, 90–105 (2003). o 15

Ge, S. , Song, L. & Pachter, J. S. Where is the blood–brain barrier...really? J. Neurosci. Res. 79, 421–427 (2005). o 16

Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation and modulation. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 5–23 (2005). 17

Cserr, H. F. & Bundgaard, M. Blood–brain interfaces in vertebrates: a comparative approach. Am. J. Physiol. 246, R277–R288 (1984). 18

Brown, P. D. , Davies, S. L. , Speake, T. & Millar, I. D. Molecular mechanisms of cerebrospinal fluid production. Neuroscience 129, 957–970 (2004). 19

Chodobski, A. & Szmydynger-Chodobska, J. Choroid plexus: target for polypeptides and site of their synthesis. Microsc. Res. Tech. 52, 65–82 (2001). 20

Wolburg, H. in Blood–Brain Interfaces — from Ontogeny to Artificial Barriers (eds Dermietzel, R., Spray, D. & Nedergaard, M.) 77–107 (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, in the press). 21

Butt, A. M. , Jones, H. C. & Abbott, N. J. Electrical resistance across the blood–brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study. J. Physiol. (Lond.) 429, 47–62 (1990). 22

Simpson, I. A. , Vanucci, S. , DeJoseph, M. R. & Hawkins, R. A. Glucose transporter asymmetries in the bovine blood–brain barrier. J. Biol. Chem. 276, 12725–12729 (2001). 23

Schinkel, A. H. P-glycoprotein, a gatekeeper in the blood–brain barrier. Adv. Drug Deliv. Rev. 36, 179–194 (1999). 24

Hawkins, R. A. , Peterson, D. R. & Vina, J. R. The complementary membranes forming the blood–brain barrier. IUBMB Life 54, 101–107 (2002). 25

O'Kane, R. & Hawkins, R. A. Na+-dependent transport of large neutral amino acids occurs at the abluminal membrane of the blood–brain barrier. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 285, E1167–E1173 (2003). 26

O'Kane, R. L. , Martinez-Lopez, I. , DeJoseph, M. R. , Vina, J. R. & Hawkins, R. A. Na+-dependent glutamate transporters (EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood–brain barrier. J. Biol. Chem. 274, 31891–31895 (1999). 27

Abbott, N. J. in Blood–Brain Interfaces — From Ontology to Artificial Barriers (eds Dermietzel, R., Spray, D. & Nedergaard, M.) 189–208 (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, in the press). 28

Davson, H. & Oldendorf, W. H. Transport in the central nervous system. Proc. R. Soc. Med. 60, 326–328 (1967). 29

Reichenbach, A. & Wolburg, H. in Neuroglia 2nd edn (eds Kettemann, H. & Ransom, B. R.) 19–35 (Oxford Univ. Press, New York, 2004). 30

Dehouck, M. -P. , Meresse, S. , Delorme, P. , Fruchart, J. C. & Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood–brain barrier in vitro. J. Neurochem. 54, 1798–1801 (1990). One of the first papers to describe a reliable method for generating an endothelial–astrocyte co-culture model of the BBB tight enough for study of permeability and transport. The model has since been successful in functional and mechanistic studies. 31

Rubin, L. L. et al. A cell culture model of the blood–brain barrier. J. Cell Biol. 115, 1725–1735 (1991). 32

McAllister, M. S. et al. Mechanisms of glucose transport at the blood–brain barrier: an in vitro study. Brain Res. 904, 20–30 (2001). Uses high-resolution confocal microscopy and permeability studies to show how perivascular astrocytes influence glucose transport by the brain endothelium. 33

Hayashi, Y. et al. Induction of various blood–brain barrier properties in non-neuronal endothelial cells by close apposition to co-cultured astrocytes. Glia 19, 13–26 (1997). 34

Sobue, K. et al. Induction of blood–brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci. Res. 35, 155–164 (1999). 35

Haseloff, R. F. , Blasig, I. E. , Bauer, H. -C. & Bauer, H. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood–brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro. Cell. Mol. Neurobiol. 25, 25–39 (2005). 36

Duport, S. et al. An in vitro blood–brain barrier model: cocultures between endothelial cells and organotypic brain slice cultures. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 1840–1845 (1998). 37

Ramsauer, M. , Krause, D. & Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood–brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB J. 16, 1274–1276 (2002). One of the first papers to study the complex interactions between endothelium, astrocytes and pericytes in vitro, giving insights into the development and maintenance of the neurovascular unit. 38

Zenker, D. , Begley, D. J. , Bratzke, H. , R?bsamen-Waigmann, H. & von Briesen, H. Human blood-derived macrophages enhance barrier function of cultured primary bovine and human brain capillary endothelial cells. J. Physiol. (Lond.) 551, 1023–1032 (2003). 39

Schiera, G. et al. Synergistic effects of neurons and astrocytes on the differentation of brain capillary endothelial cells in culture. J. Cell. Mol. Med. 7, 165–170 (2003). 40

Berezowski, V. , Landry, C. , Dehouck, M. P. , Cecchelli, R. & Fenart, L. Contribution of glial cells and pericytes to the mRNA profiles of P-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins in an in vitro model of the blood–brain barrier. Brain Res. 1018, 1–9 (2004). 41

Hori, S. , Ohtsuki, S. , Hosoya, K. , Nakashima, E. & Terasaki, T. A pericyte-derived angiopoietin-1 multimeric complex induces occludin gene expression in brain capillary endothelial cells through Tie-2 activation in vitro. J. Neurochem. 89, 503–513 (2004). 42

Dohgu, S. et al. Brain pericytes contribute to the induction and up-regulation of blood–brain barrier functions through transforming growth factor- production. Brain Res. 1038, 208–215 (2005). 43

Estrada, C. , Bready, J. V. , Berliner, J. A. , Pardridge, W. M. & Cancilla, P. A. Astrocyte growth stimulation by a soluble factor produced by cerebral endothelial cells in vitro. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 49, 539–549 (1990). 44

Mi, H. , Haeberle, H. & Barres, B. A. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells. J. Neurosci. 21, 1538–1547 (2001). An elegant study that used 'panning' to separate cell types from the optic nerve, showing convincingly that endothelium-derived LIF induces astrocyte differentiation. 45

Mizuguchi, H. , Utoguchi, N. & Mayumi, T. Preparation of glial cell extracellular matrix: a novel method to analyze glial–endothelial interaction. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 339–343 (1997). 46

Schroeter, M. L. et al. Astrocytes enhance radical defence in capillary endothelial cells constituting the blood–brain barrier. FEBS Lett. 449, 241–244 (1999). This co-culture study shows clearly the 'mutual induction' that astrocytes and endothelial cells exert on each other — free radical defence enzymes are upregulated in both cell types when they are grown together. 47

Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. J. Anat. 200, 617–627 (2002). 48

Garcia-Segura, L. M. & McCarthy, M. M. Minireview: role of glia in neuroendocrine function. Endocrinology 145, 1082–1086 (2004). 49

Igarashi, Y. et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood–brain barrier. Biochem. Biophys. Res. Commun. 261, 108–112 (1999). 50

Lee, S. -W. et al. SSeCKS regulates angiogenesis and tight junction formation in blood–brain barrier. Nature Med. 9, 900–906 (2003). One of the most elegant and comprehensive studies of astrocyte–endothelial induction in vitro, revealing the novel role of Src-suppressor C-kinase substrate (SSeCKs) and angiopoetin 1. 51

Huber, J. D. , Egleton, R. D. & Davis, T. P. Molecular physiology and pathophysiology of tight junctions in the blood–brain barrier. Trends Neurosci. 24, 719–725 (2001). 52

Drewes, L. R. in Introduction to the Blood–Brain Barrier — Methodology, Biology and Pathology (ed. Pardridge, W. M.) 165–174 (Cambridge Univ. Press, Cambridge, UK, 1998). 53

Boado, R. J. & Pardridge, W. M. Glucose deprivation and hypoxia increase the expression of the GLUT-1 glucose transporter via a specific mRNA cis-acting regulatory element. J. Neurochem. 80, 552–554 (2002). 54

Pan, W. , Akerstrom, V. , Zhang, J. , Pejovic, V. & Kastin, A. J. Modulation of feeding-related peptide/protein signals by the blood–brain barrier. J. Neurochem. 90, 455–461 (2004). 55

Abbott, N. J. Inflammatory mediators and modulation of blood–brain barrier permeability. Cell. Mol. Neurobiol. 20, 131–147 (2000). 56

Webb, A. A. & Muir, G. D. The blood–brain barrier and its role in inflammation. J. Vet. Intern. Med. 14, 399–411 (2000). 57

Tonra, J. R. Cerebellar susceptibility to experimental autoimmune encephalomyelitis in SJL/J mice: potential interaction of immunology with vascular anatomy. Cerebellum 1, 57–68 (2002). 58

Bauer, B. , Hartz, A. M. , Fricker, G. & Miller, D. S. Modulation of p-glycoprotein transport function at the blood–brain barrier. Exp. Biol. Med. 230, 118–127 (2005). 59

Nwaozuzu, O. M. , Sellers, L. A. & Barrand, M. A. Signalling pathways influencing basal and H2O2-induced P-glycoprotein expression in endothelial cells derived from the blood–brain barrier. J. Neurochem. 87, 1043–1051 (2003). 60

Zhu, H. J. & Liu, G. Q. Glutamate up-regulates P-glycoprotein expression in rat brain microvessel endothelial cells by an NMDA receptor-mediated mechanism. Life Sci. 75, 1313–1322 (2004). 61

Bauer, B. , Hartz, A. M. S. , Fricker, G. & Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood–brain barrier. Mol. Pharmacol. 66, 413–419 (2004). Evidence that the nuclear PXR can upregulate Pgp function at the BBB, providing a mechanism for a number of long-term modulations of significance in physiology and pathology. 62

Hartz, A. M. S. , Bauer, B. , Fricker, G. & Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood–brain barrier by endothelin-1. Mol. Pharmacol. 66, 387–394 (2004). Complementary to reference 62, this paper shows short-term modulation of Pgp by a signalling molecule released within the neurovascular unit. 63

Hansson, E. & R?nnb?ck, L. Astrocytic receptors and second messenger systems. Adv. Mol. Cell Biol. 31, 475–501 (2004). 64

Hansson, E. & R?nnb?ck, L. Astrocytes in glutamate neurotransmission. FASEB J. 9, 343–350 (1995). 65

Hansson, E. & R?nnb?ck, L. Glial neuronal signalling in the central nervous system. FASEB J. 17, 341–348 (2003). 66

Andersson, A. , R?nnb?ck, L. & Hansson, E. Lactate induces tumour necrosis factor- and interleukin-6 release in microglial and astroglial enriched primary cultures. J. Neurochem. 93, 1327–1333 (2005). 67

Kis, B. et al. Adrenomedullin regulates blood–brain barrier functions in vitro. Neuroreport 12, 4139–4142 (2001). 68

Brown, R. C. , Mark, K. S. , Egleton, R. D. & Davis, T. P. Protection against hypoxia-induced increase in blood–brain barrier permeability: role of tight junction proteins and NF B. J. Cell Sci. 116, 693–700 (2003). 69

Mann, G. E. , Yudilevich, D. L. & Sobrevia, L. Regulation of amino acid and glucose transport in endothelial and smooth muscle cells. Physiol. Rev. 83, 183–252 (2003). 70

Braet, K. , Cabooter, L. , Paemeleire, K. & Leybaert, L. Calcium signal communication in the central nervous system. Biol. Cell 96, 79–91 (2004). 71

Leybaert, L. , Cabooter, L. & Braet, K. Calcium signal communication between glial and vascular brain cells. Acta Neurol. Belg. 104, 51–56 (2004). 72

Leybaert, L. Neurobarrier coupling in the brain: a partner of neurovascular and neurometabolic coupling? J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 2–16 (2005). 73

R?gina, A. et al. Factor(s) released by glucose-deprived astrocytes enhance glucose transporter expression and activity in rat brain endothelial cells. Biochim. Biophys. Acta 1540, 233–242 (2001). One of the first papers to show that the metabolic status of astrocytes affects the way they influence the brain endothelium, which is of relevance in ischaemia and starvation. 74

Abbott, N. J. in Introduction to the Blood–Brain Barrier: Methodology and Biology (ed. Pardridge, W. M.) 345–353 (Cambridge Univ. Press, Cambridge, UK, 1998). 75

Muyderman, H. et al. 1-Adrenergic modulation of metabotropic glutamate receptor-induced calcium oscillations and glutamate release in astrocytes. J. Biol. Chem. 276, 46504–46514 (2001). 76

Pasti, L. , Volterra, A. , Pozzan, T. & Carmignoto, G. Intracellular calcium oscillations in astrocytes: a highly plastic, bidirectional form of communication between neurons and astrocytes in situ. J. Neurosci. 17, 7817–7830 (1997). 77

Cornell-Bell, A. H. , Finkbeiner, S. M. , Cooper, M. S. & Smith, S. J. Glutamate induces calcium waves in cultured astrocytes: long-range glial signalling. Science 247, 470–473 (1990). 78

Blomstrand, F. et al. 5-Hydroxytryptamine and glutamate modulate velocity and extent of intercellular calcium signalling in hippocampal astroglial cells in primary cultures. Neuroscience 88, 1241–1253 (1999). 79

Sneyd, J. et al. A model for the propagation of intercellular calcium waves. Am. J. Physiol. 266, C293–C302 (1994). 80

Cotrina, M. L. et al. Connexins regulate calcium signaling by controlling ATP release. Proc. Natl Acad. Sci. USA 95, 15735–15740 (1998). 81

Paemeleire, K. & Leybaert, L. ATP-dependent astrocyte–endothelial calcium signalling following mechanical damage to a single astrocyte in astrocyte–endothelial co-cultures. J. Neurotrauma 17, 345–358 (2000). One of the first papers to investigate the mechanisms that underlie rapid astrocyte–endothelial signalling, using cultured cells. It is now becoming possible to do this kind of experiment in brain slices. 82

Bezzi, P. et al. CXCR4-activated astrocyte glutamate release via TNF : amplification by microglia triggers neurotoxicity. Nature Neurosci. 4, 702–710 (2001). 83

Rapoport, S. I. Blood–Brain Barrier in Physiology and Medicine (Raven, New York, USA, 1976). 84

Simard, M. & Nedergaard, M. The neurobiology of glia in the context of water and ion homeostasis. Neuroscience 129, 877–896 (2004). 85

Kofuji, P. & Newman, E. A. Potassium buffering in the central nervous system. Neuroscience 129, 1045–1056 (2004). 86

Price, D. L. , Ludwig, J. W. , Mi, H. , Schwarz, T. L. & Ellisman, M. H. Distribution of rSlo Ca2+-activated K+ channels in rat astrocyte perivascular endfeet. Brain Res. 956, 183–193 (2002). 87

Simard, M. , Arcuino, G. , Takano, T. , Liu, Q. S. & Nedergaard, M. Signaling at the gliovascular interface. J. Neurosci. 23, 9254–9262 (2003). 88

Amiry-Moghaddam, M. & Ottersen, O. P. The molecular basis of water transport in the brain. Nature Rev. Neurosci. 4, 991–1001 (2003). 89

Dolman, D. , Drndarski, S. , Abbott, N. J. & Rattray, M. Induction of aquaporin 1 but not aquaporin 4 messenger RNA in rat primary brain microvessel endothelial cells in culture. J. Neurochem. 93, 825–833 (2005). 90

Hansson, E. Metabotropic glutamate receptor activation induces astroglial swelling. J. Biol. Chem. 269, 21955–21961 (1994). 91

Hansson, E. , Johansson, B. B. , Westergren, I. & R?nnb?ck, L. Glutamate-induced swelling of single astroglial cells in primary culture. Neuroscience 63, 1057–1066 (1994). 92

Liebner, S. et al. Claudin-1 and claudin-5 expression and tight junction morphology are altered in blood vessels of human glioblastoma multiforme. Acta Neuropathol. 100, 323–331 (2000). 93

Wolburg, H. et al. Localization of claudin-3 in tight junctions of the blood–brain barrier is selectively lost during experimental autoimmune encephalomyelitis and human glioblastoma multiforme. Acta Neuropathol. 105, 586–592 (2003). 94

Berzin, T. M. et al. Agrin and microvascular damage in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging 21, 349–355 (2000). 95

Warth, A. , Kr?ger, S. & Wolburg, H. Redistribution of aquaporin-4 in human glioblastoma correlates with loss of agrin immunoreactivity from brain capillary basal laminae. Acta Neuropathol. 107, 311–318 (2004). Shows clearly the importance of the extracellular matrix in providing the scaffold for the ordering of proteins important in the function of astrocytic perivascular endfeet, and its disruption in pathology. 96

Minagar, A. & Alexander, J. S. Blood–brain barrier disruption in multiple sclerosis. Mult. Scler. 9, 540–549 (2003). 97

Abbott, N. J. et al. in Mechanisms of Drug Resistance in Epilepsy: Lessons from Oncology (ed. Ling, V.) Novartis Foundation Symposium No. 243, 38–47 (John Wiley, Chichester, UK, 2002). 98

Marroni, M. et al. Vascular and parenchymal mechanisms in multiple drug resistance: a lesson from human epilepsy. Curr. Drug Targets 4, 297–304 (2003). 99

Zlokovic, B. V. Neurovascular mechanisms of Alzheimer's neurodegeneration. Trends Neurosci. 28, 202–208 (2005). 100

Kortekaas, R. et al. Blood–brain barrier dysfunction in parkinsonian midbrain in vivo. Ann. Neurol. 57, 176–179 (2005). An important but controversial paper showing how modern imaging techniques can be used to investigate BBB transport function in humans, and the insight this may give into disease states. 101

Schwaninger, M. et al. Bradykinin induces interleukin-6 expression in astrocytes through activation of nuclear factor- B. J. Neurochem. 73, 1461–1466 (1999). 102

Deli, M. A. et al. Exposure of tumor necrosis factor- to luminal membrane of bovine capillary endothelial cells cocultured with astrocytes induces a delayed increase of permeability and cytoplasmic stress formation of actine. J. Neurosci. Res. 41, 717–726 (1995). 103

Didier, N. et al. Secretion of interleukin-1 by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor- effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J. Neurochem. 86, 246–254 (2003). Illustrates the potential complexities of signalling between cells at the BBB — even apparently direct actions may involve indirect loops and potentiating (and inhibitory) modulation. 104

Perry, V. H. , Newman, T. A. & Cunningham, C. The impact of systemic infection on the progression of neurodegenerative disease. Nature Rev. Neurosci. 4, 103–112 (2003). 105

Banks, W. A. Blood–brain barrier transport of cytokines: a mechanism for neuropathology. Curr. Pharm. Des. 11, 973–984 (2005). 106

Watkins, L. R. & Maier, S. F. Glia: a novel drug discovery target for clinical pain. Nature Rev. Drug Discov. 2, 973–985 (2003). 107

Huber, J. D. et al. Inflammatory pain alters blood–brain barrier permeability and tight junctional protein expression. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, H1241–H1248 (2001). Recent work has shown, rather surprisingly, that even peripheral stimuli such as inflammatory pain can open the BBB. 108

Abbott, N. J. Prediction of blood–brain barrier permeation in drug discovery, from in vivo, in vitro and in silico models. Drug Discov. Today: Technologies 1, 407–416 (2004). 109

Dietrich, J. B. Endothelial cells of the blood–brain barrier: a target for glucocorticoids and estrogens? Front. Biosci. 9, 684–693 (2004). 110

Krizanac-Bengez, L. , Mayberg, M. R. & Janigro, D. The cerebral vasculature as a therapeutic target for neurological disorders and the role of shear stress in vascular homeostasis and pathophysiology. Neurol. Res. 26, 846–853 (2004). 111

Demeule, M. et al. Brain endothelial cells as pharmacological targets in brain tumors. Mol. Neurobiol. 30, 157–183 (2004). 112

Kaal, E. C. & Vecht, C. J. The management of brain edema in brain tumors. Curr. Opin. Oncol. 16, 593–600 (2004). 113

Cucullo, L. , Hallene, K. , Dini, G. , Dal Toso, R. & Janigro, D. Glycerophosphoinositol and dexamethasone improve transendothelial electrical resistance in an in vitro study of the blood–brain barrier. Brain Res. 997, 147–151 (2004). 114

Brown, R. C. , Mark, K. S. , Egleton, R. D. & Davis, T. P. Protection against hypoxia-induced blood–brain barrier disruption: changes in intracellular calcium. Am. J. Cell Physiol. 286, C1045–C1052 (2004). 115

Turkel, N. A. & Ziylan, Z. Y. Protection of blood–brain barrier breakdown by nifedipine in adrenaline-induced hypertension. Int. J. Neurosci. 114, 517–528 (2004). 116

Preston, E. & Webster, J. A two-hour window for hypothermic modulation of early events that impact delayed opening of the rat blood–brain barrier after ischemia. Acta Neuropathol. (Berl.) 108, 406–412 (2004). 117

Wagner, K. R. & Zuccarello, M. Local brain hypothermia for neuroprotection in stroke treatment and aneurysm repair. Neurol. Res. 27, 238–245 (2005). 118

Park, S. et al. Neurovascular protection reduces early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Stroke 35, 2412–2417 (2004). 119

Franz?n, B. et al. Gene and protein expression profiling of human cerebral endothelial cells activated with tumor necrosis factor- . Mol. Brain Res. 115, 130–146 (2003). With the human genome now fully sequenced, efforts are being made to identify genes and proteins of the brain endothelium that are activated in inflammation and disease, and that could therefore be useful targets for therapy and drug delivery to the brain. This is one of the first reports. 120

Kaya, D. et al. VEGF protects brain against focal ischemia without increasing blood–brain barrier permeability when administered intracerebro-ventricularly. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 1111–1118 (2005). 121

Takahashi, M. & Macdonald, R. L. Vascular aspects of neuroprotection. Neurol. Res. 26, 862–869 (2004). 122

Rapoport, S. I. Advances in osmotic opening of the blood–brain barrier to enhance CNS chemotherapy. Expert Opin. Invest. Drugs 10, 1809–1818 (2001). 123

Kraemer, D. F. , Fortin, D. & Neuwelt, E. A. Chemotherapeutic dose intensification for treatment of malignant brain tumors: recent developments and future directions. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 2, 216–224 (2002). 124

Farkas, A. et al. Hyperosmotic mannitol induces Src kinase-dependent phosphorylation of -catenin in cerebral endothelial cells. J. Neurosci. Res. 80, 855–861 (2005). 125

Prados, M. D. et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, phase 2 study of RMP-7 in combination with carboplatin administered intravenously for the treatment of recurrent malignant glioma. Neuro-oncology 5, 96–103 (2003). 126

Ashraf, M. Z. , Hussain, M. E. & Fahim, M. Antiatherosclerotic effects of dietary supplementations of garlic and turmeric: restoration of endothelial function in rats. Life. Sci. 77, 837–857 (2005). 127

Rohdewald, P. A review of the French maritime pine bark extract (Pycnogenol), a herbal medication with a diverse clinical pharmacology. Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. 40, 158–168 (2002). 128

Bijl, M. Endothelial activation, endothelial dysfunction, and premature atherosclerosis in systemic autoimmune diseases. Neth. J. Med. 61, 273–277 (2003). 129

Calabresi, L. , Gomaraschi, M. & Franceschini, G. Endothelial protection by high-density lipoproteins. From bench to bedside. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23, 1724–1731 (2003). 130

d'Alessio, P. Aging and the endothelium. Exp. Gerontol. 39, 165–171 (2004). 131

Middlebrook, A. R. et al. Does aerobic fitness influence microvascular function in healthy adults at risk of developing type 2 diabetes? Diabet. Med. 22, 483–489 (2005). 132

Abeywardena, M. Y. & Head, R. J. Longchain n-3 polyunsaturated fatty acids and blood vessel function. Cardiovasc. Res. 52, 361–371 (2001). 133

De Caterina, R. , Madonna, R. & Massaro, M. Effects of omega-3 fatty acids on cytokines and adhesion molecules. Curr. Atheroscler. Rep. 6, 485–491 (2004). 134

Harris, H. W. , Rockey, D. C. , Young, D. M. & Welch, W. J. Diet-induced protection against lipopolysaccharide includes increased hepatic NO production. J. Surg. Res. 82, 339–345 (1999). 135

Kamata, K. et al. Effects of chronic administration of fruit extract (Citrus unshiu Marc) on endothelial dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats. Biol. Pharm. Bull. 28, 267–270 (2005). 136

Hwang, J. , Hodis, H. N. & Sevanian, A. Soy and alfafa phytoestrogen extracts become potent low-density lipoprotein antioxidants in the presence of acerola cherry extract. J. Agric. Food Chem. 49, 308–314 (2001). 137

Vera, R. et al. Soy isoflavones improve endothelial function in spontaneously hypertensive rats in an estrogen-independent manner: role of nitric-oxide synthase, superoxide, and cyclooxygenase metabolites. J. Pharmacol. Exp. Ther. 314, 1300–1309 (2005). 138

d'Uscio, L. V. , Milstein, S. , Richardson, D. , Smith, L. & Katusic, Z. S. Long-term vitamin C treatment increases vascular tetrahydrobiopterin levels and nitric oxide synthase activity. Circ. Res. 92, 88–95 (2003). 139

Marsh, S. A. , Laursen, P. B. , Pat, B. K. , Gobe, G. C. & Coombes, J. J. Bcl-2 in endothelial cells is increased by vitamin E and -lipoic acid supplementation but not exercise training. J. Mol. Cell. Cardiol. 38, 445–451 (2005). 140

Pratic?, D. Antioxidants and endothelium protection. Atherosclerosis 181, 215–224 (2005). 141

Rasmussen, S. E. , Frederiksen, H. , Struntze Krogholm, K. & Poulsen, L. Dietary proanthocyanidins: occurrence, dietary intake, bioavailability, and protection aganist cardiovascular disease. Mol. Nutr. Food Res. 49, 159–174 (2005). 142

Fung, T. T. et al. Diet-quality scores and plasma concentrations of markers of inflammation and endothelial dysfunction. Am. J. Clin. Nutr. 82, 163–173 (2005). This study on the effect of diet on systemic endothelial function is a useful indicator of possible ways to maintain a healthy BBB. 143

Youdim, K. A. , Spencer, J. P. , Schroeter, H. & Rice-Evans, C. Dietary flavonoids as potential neuroprotectants. Biol. Chem. 383, 503–519 (2002). 144

Yoshida, H. et al. Inhibitory effect of tea flavonoids on the ability of cells to oxidize low density lipoprotein. Biochem. Pharmacol. 58, 1695–1703 (1999). 145

Stoclet, J. C. et al. Vascular protection by dietary polyphenols. Eur. J. Pharmacol. 500, 299–313 (2004). 146

Kawakami, M. , Sekiguchi, M. , Sato, K. , Kozaki, S. & Takahashi, M. Erythropoietin receptor-mediated inhibition of exocytotic glutamate release confers neuroprotection during chemical ischemia. J. Biol. Chem. 276, 39469–39475 (2001). 147

Mart?nez-Estrada, O. M. et al. Erythropoietin protects the in vitro blood–brain barrier against VEGF-induced permeability. Eur. J. Neurosci. 18, 2538–2544 (2003). 148

Zonta, M. et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nature Neurosci. 6, 43–50 (2003). 149

Tran, N. D. , Correale, J. , Schrieber, S. S. & Fisher, M. Transforming growth factor- mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke 30, 1671–1677 (1999). 150

Lo, E. H. , Dalkara, T. & Moskowitz, M. A. Mechanisms, challenges and opportunities in stroke. Nature Rev. Neurosci. 4, 399–415 (2003). 151

Tomas-Camardiel, M. et al. Blood–brain barrier disruption highly induces aquaporin-4 mRNA and protein in perivascular and parenchymal astrocytes: protective effect by estradiol treatment in ovariectomized animals. J. Neurosci. Res. 80, 235–246 (2005). 152

Vakili, A. , Kataoka, H. & Plesnila, N. Role of arginine vasopressin V1 and V2 receptors for brain damage after transient focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 25, 1012–1019 (2005). 153

Gaillard, P. J. , de Boer, A. B. & Breimer, D. D. Pharmacological investigations on lipopolysaccharide-induced permeability changes in the blood–brain barrier in vitro. Microvasc. Res. 65, 24–31 (2003). 154

Veldhuis, W. B. et al. Interferon- prevents cytokine-induced neutrophil infiltration and attenuates blood–brain barrier disruption. J. Cereb. Blood Flow Metab. 23, 1060–1069 (2003). 155

Oki, T. et al. Increased ability of peripheral blood lymphocytes to degrade laminin in multiple sclerosis. J. Neurol. Sci. 222, 7–11 (2004). 156

Dallasta, L. M. et al. Blood–brain barrier tight junction disruption in human immunodeficiency virus-1 encephalitis. Am. J. Pathol. 155, 1915–1927 (1999). 157

Berger, J. R. & Avison, M. The blood brain barrier in HIV infection. Front. Biosci. 9, 2680–2685 (2004). 158

Kalaria, R. N. The blood–brain barrier and cerebrovascular pathology in Alzheimer's disease. Ann. NY Acad. Sci. 893, 113–125 (1999). 159

Lee, G. & Bendayan, R. Functional expression and localization of P-glycoprotein in the central nervous system: relevance to the pathogenesis and treatment of neurological disorders. Pharm. Res. 21, 1313–1320 (2004). 160

Papadopoulos, M. C. , Saadoun, S. , Davies, D. C. & Bell, B. A. Emerging molecular mechanisms of brain tumour oedema. Br. J. Neurosurg. 15, 101–108 (2001). 161

Davies, D. C. Blood–brain barrier breakdown in septic encephalopathy and brain tumours. J. Anat. 200, 639–646 (2002). Segal, M. B. & Zlokovic, B. V. The Blood–Brain Barrier, Amino Acids and Peptides (Kluwer Academic, Dordrecht, Boston (USA) & London (UK), 199