Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis
 Nature V. 441, 8 June 2006, P. 746-749 | nature04829 | |
|
Трахейная система дрозофилы развивается из эпителиальных мешков примерно из 80 клеток, из которых вырастают первичные, вторичные и терминальные веточки без клеточных делений и клеточной гибели8,9 . Вырастание первичных веточек индуцируется Branchless (Bnl) FGF, хемоаттрактантом, секретируемым кластером клеток, окружающих каждый мешок4 (Fig. 1a), который активирует Breathless (Btl) FGF receptor (FGFR), рецепторную тирозин киназу, экспрессируемую на клетках трахей10. Первичные веточки содержат 3-20 клеток, которые организуются в трубочки, когда они мигрируют от мешка (Fig.1b). Bnl индуцирует также экспрессию генов вторичного ветвления, таких как pointed (pnt), и специфицирует терминальные клетки на концах отрастающих веточек4,8. Терминальные клетки разветвляются у личинок в ответ на действие Bnlбчтобы сформировать тонкие терминальные веточки12. Др. клеточки на концах первичных веточек становятся сливающимися клетками, которые соединяются с соседними веточками, чтобы сформировать непрерывную сеть трахей. Предопределение судьбы терминальных и сливающихся клеток также зависит от влияния Notch, Dpp и Wingless сигнальных путей13-17. Дорсальные веточки первичных браншей, на которых мы здесь сконцентрировались, обычно состоят из 5-6 клеток: двух клеток вблизи кончика веточки, одной (DB1), которая становится терминальной клеткой и др. DB2, которая становится сливающейся клетокой и 3-4-х клеток (DB3-DB6), которые формируют стебель веточки (Fig.1a,b).
В генетическом мозаичном скрининге было идентифицировано 6 мутаций (724, 788, 1118, 1187, 1476 и 1684) с трудно уловимым фенотипом: мозаичные веточки (+/+, +/-, -/- клетки) выглядели в основном нормальными, но гомозиготные мутантные клоны (-/- клетки) редко, если вообще включались в терминальные клетки (Fig. 1c-e, Suppl.Tabl. S1-S4: данные не показаны для др. первичных веточек). Это не были летальные мутации ни клеток вообще, ни специфические для терминальных клеток, т.к. гомозиготные мутантные клетки легко обнаруживались во всех др. позициях в трахеях и не выявлялось уменьшения общего количества клеток в мозаичных дорсальных веточках или количества терминальных клеток. Mhelyj представить, как мутации могут блокировать генерацию клонов в специфических клетках. Скорее всего, мутации вызывают переключение судеб клеток, предназначенных стать терминальными клетками.
6 мутаций составляют одну летальную комплементационную группу, которая картируется в левом плече хромосомы 3 и неспособна комплементировать с brethlessLG18. Секвенирование дНК выявило изменения одиночного нуклеотида в каждой мутации, ведущее к нонсенс или миссенс мутациям в btl (Fig.2a). Мутации 724, 788, 1118, 1476 и 1684, по-видимому, являются нулевыми btl мутациями, тогда как 1187 вызывает частичную потерю функции (Fif.2b). Т.о, btl является геном 'no mutant terminal cells'.
Определяли распределение клеток, гомозиготных по btl нулевым мутациям (724 и 788) в мозаичных дорсальных веточках. Контрольные клоны случайно распределялись по всей веточке с ожидаемой частотой. Напротив btl-/- клетки обнаруживали почти полную склонность против DB1 позиции: соотношение клонов в клетках стебля к терминальным клеткам составляло 51:1 (вместо 3:1 в контроле). Были выявлены сотни мозаичных веточек с одной или более btl-/- клетками в позициях DB2-DB6 без нарушения морфологии веточек (Fig. 2с). Т.о., хотя все клетки трахей обычно экспрессируют btl и рецептор активируется с помощью Bnl в большинстве или во всех клетках отпочковывающихся веточек8,18, рецептор, по-видимому, необходим только в одиночной ведущей клетке (DB1). Хотя все др. клетки могут мигрировать нормально и формировать трубочки в отсутствие btl. Следовательно, имеются два функционально самостоятельных класса клеток в почкующихся первичных веточках: ведущие клетки, которые нуждаются в Btl АПАК и непосредственно реагирующие на Bnl FGF, и ведомые клетки, которые не нуждаются в Btl, но следуют за ведущей клеткой и формируют стебель.
Ведущая клетка (DB1) специфицируется, чтобы стать терминальной клеткой с помощью передачи сигналов Bnl-Btl4,8. Если необходима спецификация терминальной клетки, то нулевые мутации в нижестоящем гене pnt, которые устраняют эту функцию8, д. оказывать одинаковый эффект с мутациями btl, что и было подтверждено. Однако, в отличие от btl мозаичных веточек pnt мозаичные веточки часто лишены терминальной клетки (26% мозаичных браншей). Когда терминальная клетка отсутствовала, то обычно pnt-/- клетка в стебле вблизи кончика (Fig.2d) оказывалась преимущественно DB1 клеткой, которая была неспособна дифференцироваться в терминальную клетку. Это указывает на то что pnt-/- клетки способны достигать ведущей позиции, но не способны дифференцироваться в терминальные клетки и эта склонность в отличие от btl мутантных терминальных клеток обусловлена более ранней не зависимой от pnt функцией Btl в отпочковании и выросте первичной веточки. Если клетки, лишенные Btl не могут мигрировать в ответ на Bnl во время почкования8,10,19, то они не д.б. способны перемещаться в ведущую позицию, что необходима для выбора их в качестве терминальной клетки. В соответствие с этим генетический мозаичный анализ stumps (dofiheart-broken), который кодирует Btl адаптор, необходимый для миграции клеток20,21, показал? что нехватка клонов терминальных клеток сходна с btl.
Два результата демонстрируют, что способность ощущать Bnl и мигрировать в ответ на него недостаточна, чтобы стать ведущей клеткой, конкурентноспособной за лидирующую позицию. Первый связан с btlBN (Е796К мутация в киназном домене), слабым аллелем btl. В отличие от btl-/- животных, которые погибают на первой личиночной стадии и лишены действительно всех веточек10 (Fig.2b), btlBN гомозиготы доживают до 3-й личиночной стадии или далее и имеют нормальную картину трахейной системы с полным комплектом терминальных клеток. Выявляется единственный дефект в виде редукции количества и измененной морфологии терминальных частей веточек преимущественно из-за функции чувствительности к дозе btl в выростах терминальных веточек13 (Fig.3a-c). Поздний и слабый фенотип демонстрирует, что mtkjr BtlBN сохраняет достаточную активность для ранней миграции и спецификации терминальных клеток. Однако, мы установили, что у генетически мозаичных животных, у который btlBN/BN клетки д.конкурировать с btlBN/+ и btl+/+ трахейными клетками, клетки btlBN/BN редко достигают ведущей позиции (DB1) и развиваются как терминальные клетки (Fig.3d-f). Т.о., Btl активность выше порога, необходимого для миграции и спецификации терминальных клеток, не достаточна для приобретения ведущей позиции и превращения в терминальные клетки: клетка д.б. более Btl активна, чем др. клетки веточки.
К сходному заключению приводит второй эксперимент, в котором анализировали маркированные клетки дикого типа у гетерозигот по btl. Клоны btl+/+ у гетерозигот btl788/+ преимущественно локализовались на кончике (Fig.3g). Клетки, которые не оккупировали ведущей (DB1) позиции, занимали положение близкое к кончику. Сходные результаты получены у гетерозигот по btl11878, по аллелю с частичной потерей функции (Fig.3h). Клоны по мутантному sprouty, FGF feedback ингибитору22,23 также преимущественно занимали кончик. Всё это указывает на то, что существует конкуренция за ведущую позицию: клетка с наивысшей btl активностью достигает позиции вблизи кончика веточки.
Из-за незначительных различий в дозе или активности btl , затрагивающей способность клетки конкурировать за лидерство, мы исследовали, могут ли механизмы латеральной ингибиции, который умножают небольшие отличия в передаче сигналов, быть эффективными. Считается, что путь Notch участвует в событиях спецификации клеток, включая детерминацию клеточных судеб на кончиках веточек трахей, влияет и на расположение клеток15-17. Эмбрионы Nts подвергались воздействию рестриктивной температуры во время почкования веточек, при этом большинство DB клеток вело себя подобно ведущим клеткам, образуя большие кластеры клеток, скапливающиеся на ведущей позиции17, тогда как экспрессия постоянно активного NACT во всем трахейном эпителии ведеть к противоположному эффекту, арестовывая рост и останавливая клетки вблиз основания веточки (Fig.4a-c). Мы полагаем, что обусловленная Notch латеральная ингибиция среди трахейных клеток предупреждает появление дополнительных клеток, достигающих ведущей позиции.
Полученные результаты указывают на социальную стратификацию и динамические социальные взаимодействия между эпителиальными клетками во время морфогенеза ветвления (Fig.4d). Во-первых результаты показывают, что почкующиеся клетки функционально специализированы. Клетка на кончике веточки нуждается в btl и ведет к выросту в направлении центра передачи сигналов Bnl. Ведомые клетки не нуждаются в btl, но тем не менее следуют за ведущей клеткой в направлении источника Bnl. Т.к. трахейные клетки не мигрируют и не образуют трубки у btl-/- животных, то ведомые клетки д. воспринимать вторично сигнал, генерируемый ведущей клеткой, чтобы заставить их мигрировать и активировать их программу тубулогенеза. Это д.б. секретируемая молекула или физический стимул, такой как тяга или натяжение ведомых клеток.
Во-вторых, эти роли не предопределены. Скорее имеется конкуренция между клетками, так что те, которые с высокой активность Btl FGFR, становятся ведущими клетками, а те, которые с меньшей или без Btl FGFR активности становятся ведомыми и формируют стебель веточки. Конкуренция, по-видимому, затрагивает Notch-обусловленную латеральную ингибицию сигналов между трахейными клетками и она может также испытывать влияние со стороны механизмов позитивной петли, таких как повышенная активация и экспрессия Btl по мере приближения клеток к источнику Bnl24. В-третьих, может быть кооперация между клетками, т.к. в генетически мозаичном эпителии трахейные клетки с меньшей активность Btl позволяют тем, что с большей активностью, опережать себя.
Могут существовать сходные социальные взаимодействия между почкующимися клетками у др. организмов. Исследования др. процессов ветвления идентифицировали гены, селективно экспрессирующиеся на кончиках клеток почкующихся веточек и в некоторых случаях эти клетки обладают морфологическими специализациями, указывающими на то, что они могут активно вести за собой рост25. Недавний анализ химерных Ret+/Ret- почечных уретрических зачатков у мышей в культуре26 и в btl мозаичных воздушных мешках27 показал, что клетки, лишенные этих рецепторных тирозин киназ удаляются с кончиков веточек, указывая тем самым, что RTK-зависимые взаимодействия сходны с теми, что описаны здесь и могут оперировать в более сложных событиях ветвления.
| |