У многих организмов судьбы клеток предопределяется, когда они 'рождаются', т.к. они наследуют цитоплазматические факторы, которые пространственно локализованы в ооците или оплодотворенной яйцеклетке. Такие факторы действуют как DETERMINANTS, если они гарантируют специфическую клеточную судьбу. Различия в наследовании детерминант ведут к клеткам, обладающими самостоятельными свойствами, а эксперименты могут показать, что неправильная локализация или удаление такиех детерминирующих факторов изменяют судьбы клеток. Напр., деструкция пространственно распределенной РНК в полярной плазме насекомых или зародышевой плазме яиц амфибий, генерирует стерильных животных^1-2. Однако, развитие эмбрионов является разным: оно регуляционное. Доказательства этому получены в экспериментах, в которых мышиные эмрионы оказывались реорганизованными при изменении аранжемента или количества клеток, после чего они могли восстанавливаться или завершать развитие^3-7. Даже удаление ANIMAL или VEGETAL POLES эмбриона не останавливает развития, это говорит против локализованных детерминант^8-9, и возникают вопросы о том, как разворачивается судьба клеток в отсутствие таких факторов. Являются ли первые решения судьбы клеток, принятые полностью случайно ничем не связанные с регулирующим развитием эмбрионов млекопитающих? Или имеется некий не-ригидный паттерн, который ведет развитие и который делает возможной гибкость?

Pre-implantation events. Имеются три основных события в преимплантационном развитии. Первым является переход от материнского к зиготическому контролю экспрессии генов. По сравнению с др. филетическими типами это происходит намного раньше у мышей: основная волна транскрипционной активации инициируется на 2-клеточной стадии¹⁰. Второе событие заключается в апикально-базальной поляризации BLASTOMERES на 8-клеточной стадии^11-13. После поляризации бластомеров создаются условия для генерации клеточного разнообразия - последующие асимметричные деления ведут к образованию двух самостоятельных типов клеток, INNER CELL MASS (ICM) и TROPHECTODERM. Третье событие заключается в формировании BLASTOCYST с его самостоятельной эмбрионально--вне-эмбриональной осью; ICM в основном оказывается в эмбриональной части, тогда как полость оказывается вне-эмбриональной частью, но обе части окружены трофэктодермой (BOX 1). Но на какой же стадии во время этих процессов клетки впервые начинают отличаться др. от друга? И как эти решения клеточных судеб скоординированы?

Establishing apical-basal polarity. первые клетки мышиного эмбриона сходны по проявлению. Они приблизительно одного размера и в них не выявляется по-разному распределенных молекул, которые бы отличали их одну от др. На 8-клеточной ст., однако, происходит перераспределение компонентов клеточной поверхности и цитоскелета^11-14, a радиально симметричные клетки становятся поляризованными апикально-базальным способом. Клетки, кроме того, уплощаются относительно одна др., когда эмбрион подвергается COMPACTION¹⁵. Затем, может различить три типа клеточных делений: консервативные (симметричные) деления, когда обе дочерние клетки наследуют апикальный и базальный домены; дифференциальные (асимметричные) деления, когда только одна дочерняя клетка остается поляризованной, а др. оказывается неполяризованной; и косые деления, которые нечто среднее между двумя предыдущими^13,16. После асимметричных делений дочерние клетки должны также отличаться по своему положению внутри эмбриона и по своей судьбе - внешние поляризованные клетки развивается во вне-эмбриональный клон трофэктодермы, тогда как внутренние, не-поляризованные клетки развиваются в ICM.

Flexibility, equivalence and commitment. Хотя морфологически и молекулярно отличающиеся, эти 'внутренние' и 'внешние' клетки всё ещё обнаруживают регуляционное (гибкое) развитие, но их судьба может первоначально пере-направляться путем изменения их положения внутри эмбриона^17-22. Изменение позиции inside (не-полярной) клетки на 16-клеточной стадии на outside ведет к её дифференцировке в трофэктодерму. Обратное менее ясно, т.к. некоторое потомство outside (полярных) клеток может давать ICM. тогда как др. 'сегрегируют' наружу^23-25. Меняют ли клетки свое положение во время нормального развития, неясно. Однако, на 32-клеточной стадии наружные клетки, по-видимому, становятся детерминированными к судьбе трофэктодермы²², тогда как внутренние клетки остаются плюрипотентными, по крайней мере, вплоть до стадии бластоциста^18-21.

Но являются ли внутренние и внешние клетки первыми, отличающимися др. от др. или различия между ними возникают раньше? Решить этот вопрос можно, выделив клетки и проследив их развитие. Хотя такие эксперименты предпринимались с целью, могут ли клетки замещаться другими, не было выявлено, действительно ли они эквивалентны. Это возможно из-за наличия важных молекулярных различий между клетками, таких как те, что имеются между внутренними и внешними клетками у 16-32-клеточных эмбрионов^26-29, но клетки всё ещё могут изменять свою судьбу, если изменены условия. Бластомеры на 2-клеточной стадии эмбрионов мышей тотипотентны: если один из них разрушен, то др. поддерживает развитие до рождения³ и хотя относительно редко, но разделение бластомеров на 2-клеточной стадии может давать близнецов⁷. Несмотря на значительные усилия четверня никогда не возникала из бластомеров 4-клеточной стадии^30-31. Однако, это может быть объяснено малыми размерами возникающих в результате эмбрионов скорее, чем различиями в потенции между бластомерами 4-клеточного эмбриона. Их способность вносить вклад в разные типы клеток у химер^32-34 привела к общему предположению, что 4-клеточные и вообще-то даже 8-клеточные бластомеры эквивалентны относительно др. др. в отношении своих онтогенетических свойств. Но действительно ли это так? Чтобы проверить эту идею необходим метод для отличия индивидуальных клеток у ранних эмбрионов. В отсутствие природных маркеров, идентификация индивидуальных клеток могла бы стать возможной при наблюдении из какой части яйца они возникают и могут ли они следовать специфической судьбе. Чтобы этого достичь важно понять паттерны дробления, которые дают бластомеры, и важно проследить судьбу их потомков.

Оплодотворенное мышиное яйцо выглядит униформным, являясь продуктом предыдущих мейотических делений, второе POLAR BODY, является асимметричным признаком, который обычно предопределяет анимальный полюс^35-36 (FIG. 1). Др. признаком асимметрии является FERTILIZATION CONE, который указывает на sperm entry position (SEP)^37-38. Кроме того, после оплодотворения яйцо изменяет свои очертания, становясь уплощенным, так что SEP д. маркировать короткую ось яйца³⁷ (FIG. 1b). Первое деление дробления не происходит случайно по отношению к этим признакам.

The animal pole. Ориентация первого деления дробления обычно является меридиональной, вдоль анимально-вегетативной оси, с анимальным полюсом, маркированным вторым полярным тельцем^35-36,39-41.Однако, из-за того что полярное тельце может перемещаться, чтобы занять расщелину между бластомерами после деления, то позиция полярного тельца перед началом дробления было недавно изучено. Многочисленные доказательства показывают, что первое деление дробления и в самом деле обычно инициируется вблизи сайта предыдущего мейоза (сайта полярного тела)^42-44 - начало проникновения борозды происходит внутри 30^o от полярного тельца в 10 раз чаще, чем в перпендикулярном положении⁴⁵. Интересно, что даже когда дробление не инициируется в его близи, то полярное тельце, и возможно ассоциированная с ним мембрана, инкорпорируются в борозду дробления^37,44-46. Подобное взаимоотношение веретена и ориентации дробления с сайтом предыдущего мейоза может быть большим. чем простая корреляция, т.к. удвоение анимального полюса (но не противоположного полюса) часто арестовывает развитие из-за аномалий в разделении хроматина⁴³.

Качественные особенности потенциальных взаимодействующих с веретеном молекул, которые ассоциированы с сайтом предыдущего асимметричного мейотического деления, неизвестны. Возможно, что со временем они теряют свою ассоциацию с местом полярного тельца и это вносит вклад в обнаруживаемые различия^41-46. Интересно, что члены семейства PAR (partitioning), такие как PAR6 (REFS 37,47) и PAR3 (REF. 48), которые в др. модельной системе контролируют ориентацию клеточного деления^49-52, ассоциированы с анимальным полюсом у мышей. Но др., такие как PAR1, располагаются симметрично и ассоциируют с мейотическим и первым митотическим веретенами⁵³. Играют ли роль PAR молекулы в ориентации первого митотического веретена у мышей, остается неизвестным.

Cell shape and SEP. Др. фактор, который влияет на ориентацию дробления ZYGOTE является форма клетки³⁷. Это очевидно связано с позицией проникновения спермия в яйцо при оплодотворении. Спермий может проникать в мышиное яйцо в любом месте, за исключением анимального полюса^54-55. Маркируя конус фертилизации кусочком или с помощью задержанной съёмки без мечения SEP, было установлено, что обычно SEP маркирует место, где д. пройти первая борозда дробления^55-57. Изменения в геометрии яйца после оплодотворения могут лежать в основе этого взаимоотношения, т.к. SEP часто коррелирует с короткой осью зиготы и оно находится вдоль этой оси, по которой д. произойти деление³⁷ (FIGS 1,2). Корреляция между очертаниями зиготы и дроблением может объяснить, почему компоненты проникшего внутрь спермия не обязательно видны, чтобы локализовать место дробления⁵⁸. Очевидно, что форма клетки перекрывает влияние др. позиционной информации. Эксперименты по сдавливанию зигот, чтобы удлинить их в любой желательной ориентации, показали, что деление происходит через их новую короткую ось и в основном игнорирует др. потенциальные сигналы³⁷ (FIG. 2).

Этот доминирующий эффект клеточной формы может объяснить сообщение, в котором пришли к заключению, что дробление не коррелирует с анимальным полюсом⁴⁶. В этом сообщении Hiiragi и Solter предложили правило, которое устанавливает, что первое деление дробления 'всегда' происходит перпендикулярно плоскости расположения пронуклеусов⁴⁶. Это привело их к заключению, что женский и мужской хроматин 'смешаны' в первой метафазной пластинке, неожиданное заключение, которое находится в разладе с наблюдениями др. авт.^59-60. Однако, в своих экспериментах Hiiragi and Solter или выбросили более 50% зигот или манипулировали и выравнивали зиготы так, что они располагались на чашке с обоими пронуклеусами в одной плоскости, чтобы облегчить их наблюдение⁴⁶. Это привело к смещенному конечному результату, т.к. такие манипуляции скорее всего или отбирали или продуцировали удлиненные эмбрионы с пронуклеусами, имеющими тенденцию расположиться вдоль длинной оси. Т.к. дробление происходит через короткую ось зиготы, то д. возникнуть тенденция его позиционирования между пронуклеусами в большинстве удлиненных зигот⁴⁵ (FIG. 2). Тем не менее, в удлиненных зиготах, в которых пронуклеусы случайно располагались по короткой оси, то деления происходили через короткую ось, выравниваясь по пронуклеусам. Наиболее важно, когда нормальные (non-elongated и non-preselected) зиготы наблюдаются во множественных фокальных планах, то деления происходят в одной плоскости с пронуклеусами, а не между ними⁴⁵. Трехмерные time-lapse картины также подтверждают взаимосвязь между положением борозды дробления и анимальным полюсом. Следовательно, важно влияние формы клетки, которая может перекрывать др. позиционную информацию, и может давать объяснение для некоторых расхождений во мнении о том, как в точности делятся мышиные зиготы - на форму эмбриона могут влиять разные факторы, напр., культуральные условия.

Всё это демонстрирует, что не имеется строго правила ориентации первого деления дробления, но что в большинстве зигот оно коррелирует с анимальным полюсом и формой клетки, последняя часто связана с позицией внедрения спермия в яйцо.

Если существует паттерн в первые дни эмбрионального развития мыши, то он д. следовать скорее 'рекомендациям', чем 'командам'. Если правила не являются строгими, то и паттерн не может быть строгим и может быть просмотрен или нарушен, так что любой метод, используемый для отслеживания, д. быть не инвазивным. Т.к. не существует естественных маркеров для отличия между клетками эмбриона, то идентификация первых закономерностей была связана с разработкой не-инвазивного мечения и трехмерной imaging техники, которые позволили определить происхождение и судьбу индивидуальных эмбриональных клеток.

Predicting the embryonic-abembryonic axis. Такие не-инвазивные техники показали, что при любой ориентации первого деления дробления его плоскость часто позволяет предсказать ориентацию эмбриональной--вне-эмбриональной оси бластоциста. Gardner нашел, что прикрепленное полярное тельце не только метит первое деление дробления, но и также метит границу между эмбриональной и вне-эмбриональной частью бластоциста³⁶. Это привело к предположению, что анимально-вегетативная ось зиготы сохраняется в течение пред-имплантационного развития и коррелирует с полярностью бластоциста. Затем было установлено, что полярное тельце и кусочек, помещенный на SEP, вместе стремятся маркировать плоскость между двух-клеточными бластомерами, а в бластоцисте границу между эмбриональной и вне-эмбриональной частью⁵⁵. Эти наблюдения выявили тенденции, которые не были ожидаемы, если формирование паттерна бластоциста происходит полностью случайно и является следствием клеточной реакции на внешние условия.

Bias at the 2-cell stage. В согласии с предсказаниями этих находок, три группы, используя различные методы мечения, показали, что бластомеры 2-клеточной стадии обнаруживают тенденциозные различия в своей судьбе^61-63. Оба 2-клеточных бластомера вносят вклад и в ICM и трофэктодерму, но один вкладывает больше клеток в эмбриональную (содержащую POLAR TROPHECTODERM), а др. во вне-эмбриональную (содержащую MURAL TROPHECTODERM) часть бластоциста (FIG. 3a). Эти находки в согласии с рядом более ранних исследований, показавших, что один из 2-клеточных бластомеров (the earlier to divide) вносит значительно больше клеток в ICM, большинство из которых окажутся во вне-эмбриональной части^33,64-67. Как может объяснить такую склонность? Было предположено, что более рано начинающий делиться бластомер создает больше клеточных контактов, они могут также удлиняться раньше^68,14. Предположено, что форма 8-клеточного бластомера также влияет на ориентацию делений, и это д. способствовать асимметричным делениям, которые генерируют ICM.

Взаимоотношение между плоскостью, которая делит 2-клеточные бластомеры (что отражает плоскость дробления), и эмбриональной--вне-эмбриональной границей бластоциста трудно для определения количества и это может приводить к разным заключениям^61-63,69-71. Этому есть две причины. Первая, плоскость, которая возникает в результате первого деления дробления, часто искажена после деления на 4-клеточной стадии, так что один из бластомеров, который является результатом второго экваториального деления, занимает сам наиболее дистальное положение по отношению к трем остальным (известен как tetrahedral form of the embryo)⁷². Следовательно, некоторые угловые смещения ожидаемы между первым делением дробления и embryonic-abembryonic границей. Вторая, угловые измерения плоскости, которая разделяет клональное потомство каждого из 2-клеточных бластомеров на стадии бластоциста имеют ограниченные значения и могут вводить в заблуждение (FIG. 3a). Это из-за того, что невозможно определить одиночную плоскость, которая проходит по сильно изогнутой (convoluted) клональной границе на confocal срезах бластоциста при трехмерной реконструкции. Даже в наиболее связанных клонах⁷¹, одиночная клетка выпячивается из одного клона в направлении др. и может существенно менять оценку плоскости между клонами. По этим причинам и чтобы позволить сделать объективные и количественные измерения позиций клонов, Piotrowska-Nitsche с коллегами недавно использовали репортерную линию^44,73-74. Отслеживание меченных green fluorescence protein (GFP) ядер облегчает количественные оценки клеток в оптически разрезанных бластоцистах (FIG. 3b-c) - что было трудно проделать в предыдущих исследованиях, т.к. целые клетки были мечены и границы между ними не были видны. Этот эксперимент показал, пропорцию эмбриональной и не-эмбриональной частей, оккупируемых потомством специфических бластомеров, это подтвердило склонность 2-клеточных бластомеров вносить больше клеток или в эмбриональную или вне-эмбриональную часть. Было также продемонстрировано, что эта склонность зависит паттерна вторых делений дробления⁴⁴.

The contribution of the second cleavage. Ориентации вторых делений дробления, по-видимому, изменчивы: они происходят или примерно меридианально (M), одинаково с первым делением дробления или экваториально/косо (E)⁴¹. Хотя любая комбинация временной последовательности таких делений возможна, последовательные M и E деления наиболее часты^41,44. Но деления могут происходить в любом порядке, когда они асинхронны. В большинстве случаев, когда более раннее второе деление дробления является M , а более позднее E, то более ранний 2-клеточный бластомер вносит вклад в эмбриональную, а более поздний во вне-эмбриональную часть (FIG.3d). Если более раннее второе деление дробления является E, а более позднее M, то более ранний бластомер дает или эмбриональную или вне-эмбриональную часть. Напротив, ксли оба вторых деления дробления имеют одинаковую ориентацию (MM или EE), то размещение потомства бластомеров, по-видимому, случайно.

Beyond the 2-cell stage. Важно ли, как цитоплазма или кортекс подразделяются в этих ранних делениях? Индивидуальные 4-клеточной стадии бластомеры не могут давать бластоциста с достаточным количеством жизнеспособных клеток. Поэтому, чтобы проверить, идентичны ли все 4-клеточные бластомеры по своим онтогенетическим свойствам, необходимо комбинировать каждую индивидуальную клетки с эквивалентными клетками др. эмбрионов, чтобы получить химеры из одного типа клеток. Предпочтительна группа эмбрионов, у которых более раннее второе деление является M , а более позднее E, для таких исследований, т.к. их 4-клеточные бластомеры имеют предсказуемое происхождение и судьбу внутри бластоциста - это делает возможной идентификацию одного и того же тапа клеток от одного эмбриона в др. Более того, один из бластомеров, который возникает в результате E деления у таких эмбрионов, вносит вклад почти исключительно в mural trophectoderm^44,74 (FIG. 4a-g).

Комбинация клеток одного и того же типа для получения химер из одного типа клеток показала, что бластомеры могут отличаться уже на 4-клеточной стадии. Химеры из бластомеров, которые возникают в результате ранних делений M ('animal-vegetal') заканчивают развитие рождением, тогда как развитие химер из бластомеров, которые возникают из поздних E делений ('animal' или 'vegetal') существенно скомпроментировано. Более того, химеры, которые сконструированы из анимальных бластомеров, могут заканчивать развитие, хотя и менее успешно, чем меридианальные химеры, тогда как вегетативные химеры нет (FIG. 4h). По сравнению с animal-vegetal химерами, animal и vegetal химеры содержат меньше клеток ICM cells и, по-видимому, формируют бластоцист с задержкой. Это может быть связано с уменьшением пролиферативной способности бластомеров, которые возникают в результате более поздних экваториальных делений и было бы интересно понять, как это может происходить. Однако, т.к, as анимальные бластомеры более успешны, чем вегетативные бластомеры, то м.б. др. факторы, которые влияют на их развитие. Если редуцированная популяция ICM вносит вклад в ослабленное развитие, которое приводит в результате к образованию более мелких пост-имплантационных эмбрионов, то м. предположить, что увеличение количества бластомеров д. приводить к улучшению развития. В экспериментах Piotrowska-Nitsche и др. было показано, что вегетативные химеры, созданные комбинацией вместе четырех скорее, чем трех бластомеров, развиваются менее успешно⁷⁴.

Individual blastomeres and their neighbours. Обнаружение, что некоторые бластомеры более успешны, чем др. явилось неожиданностью, т.к. бластомеры на 4-клеточной стадии считались идентичными. Однако, эта находка д.б. согласована с результатами более ранних экспериментов, показавших, что 4-клеточные бластомеры м. вносить вклад вклад в разные клеточные клоны^32-34. В самом деле, Piotrowska-Nitsche и др. установили, что хотя развитие вегететивного бластомера оказывается скомпроментированным, если он окружен клетками того же самого типа, но он м. вносить вклад во все клоны, если окружен бластомерами др. происхождения⁷⁴. Итак. успешное развитие м. зависеть от окружения, в котором клетка обнаруживает саму себя. Распространен способ создавать quadruplets у мышей путем окружения каждого 4-клеточного бластомера тетраплоидными клетками, которые дают вне-эмбриональные ткани. В таких поддерживающих условиях каждый из 4-клеточных бластомеров м. успешно развиваться и давать мышь.

Важно помнить, что 4-клеточные бластомеры, которые были идентифицированы как разные в выше приведенных исследованиях, были получены в результате специфического, хотя и общего, паттерна делений дробления. Следовательно, эти находки нельзя экстраполировать на эмбрионы, у которых кортекс или цитоплазма сегрегируют по-разному. Это важно, т.к. различия между клетками, , по-видимому, зависят от того, что они 'наследуют' и от того, генерируются ли они от рано или поздно делящихся бластомеров скорее, чем от их положения внутри 4-клеточного эмбриона (FIG. 4b-g). Др. словами, бластомеры 4-клеточной стадии, которые локализованы дистально по отношению к полярному тельцу не обязательно являются бластомерами, которые наследуют вегетативные компоненты или д. иметь иные свойства (FIG. 4f-g). Следовательно, вообще-то только когда природа различий между бластомерами будет установлена, окажется возможным оценить по достоинству эти результаты в их целосности и сравнить потенциалы клеток, которые возникают в результате разных паттернов делений дробления.

События, которые предопределяют морфологические признаки эмбриональной и не-эмбриональной частей, происходят в конце пятого клеточного цикла после оплодотворения. На этой стадии наружные клетки эмбриона созревают в функциональные эпителиальные клетки трофэктодермы и инициируют Na+/K+ каналами обусловленный активный транспорт, который позволяет внутренней жидкости накапливаться и формировать полость бластоциста⁷⁵. Как же специфицируется место cavitation? Гипотеза 'cleavagedriven' пытается объяснить, как паттерн (ориентация и последовательность) клеточных делений на пре-имплантационных стадиях м. влиять на предопределение клеточной судьбы, чтобы установить первые клеточные клоны и повлиять на формирование паттерна ранних эмбрионов мышей^38,76.

Cavitation and pattern of cell divisions. Гипотеза cleavagedriven привлекает внимание к важности паттерна последовательных клеточных делений - первоначально в первом и втором циклах делений, а затем в 4-м и 5-м, когда возникают отдельные популяции внутренних клеток. Напр., популяция внутренних клеток, которые генерируются в 4-м цикле делений (переход от 8-клеточности к 16-клеточности), могут быть распределены более униформно независимо от локализации их сестринских наружных клеток, т.к. они являются единственными внутреними (inside) клетками на этой стадии. Однако, после пятого деления внутренние клетки состоят из двух популяций - той, которая генерируется от делений inside клеток, и той, которая генерируется de novo из outside клеток. Последняя группа скорее всего более тесно прикреплена к своим outer-клеточным сестрам посредством остаточных соединений. (Такие соединений между дочерними клетками ранее были обнаружены после двух циклов^77-78.) Следовательно, ассоциации между внутренними и наружными клетками могут варьировать по силе, создавая условия для образования полости ( или единицы, если инициируется более одной) в областях, где соединения между внутренними и наружными клетками наиболее слабые. Это возможно происходит из-за того, что такое пространство предлагает путь, по крайней мере, резистентности к накоплению жидкости⁷⁹ (FIG. 5a). И как результат д. возникать более значительная тенденция для полости заканчиваться по соседству с областью, в которой внешние клетки подверглись недавно преимущественно симметричным делениям, т.к. они не 'связаны' с внутренними клетками. В этой модели важно окончательное положение полости и не важно, где или в скольких местах происходит инициация образования полости. Эта модель находится в согласии с некоторыми сообщениями, продемонстрировавшими, что потомство 4-клеточных бластомеров вносит вклад преимущественно в mural трофэктодерму, и дают очень мало ICM^44,63,79. Это указывает на то, что полость в самом деле имеет тенденцию формироваться вблизи симметрично делящихся клеток. Это подтверждается и более ранними находками, показавшими, что вдвое больше ICM клеток генерируется при переходе от 16 к 32 клеткам, контактирующим с трофэктодермой скорее, чем с полостью бластоциста, указывая тем самым, что трофэктодермальные сестры таких ICM клеток стремятся стать скорее полярными, чем стеночными⁸⁰. Следовательно, паттерн симметричных в противоположность асимметричным делениям с 8-клеточной стадии может влиять на то, где будет полость и, следовательно, на embryonic-abembryonic ось.

В некотором смысле эта модель сходна с гипотезой Garbutt и др.⁸¹, которые изучали влияние последовательности клеточных делений на установление embryonic-abembryonic оси и подтвердили, что место cavitation предопределяется с помощью области, в которой наружные клетки являются наиболее продвинуты в направлении созревания трофэктодермы. Однако, собственно потребность может быть не ограничена клетками трофэктодермы и она не может отражать просто созревание в терминах возраста развития. Этот механизм образования полости, который зависит от паттерна делений дробления, может также оперировать, когда зиготы уплощены, чтобы изменить ориентацию первого деления дробления; возможность этого только тестируется.

Cavitation in response to zona shape. Др. модель предложена Motosugi и др.⁷¹, которые предположили, что место cavitation предопределяется независимо от паттерна деления клеток, а в ответ на дифференциальное давление на эмбрион, который подвергается действию асимметрии ZONA PELLUCIDA. Для подтверждения своей модели, авт. провели эксперимент, в котором они сдавливали 2-клеточные эмбрионы и наблюдали, что полость 'форсируется' на одном конце длинной оси (FIG. 5c). Такая модель могла бы объяснить, как дифференциальное давление вдоль длинной оси может заставлять накапливать жидкость на одном из его концов в существенно удлиненном эмбрионе. Однако, как эта модель может объяснить позиционирование полости у нормальных эмбрионов, которые не удлинены? Кроме того, эта модель не согласуется с находками, что полость формируется в естественных (несдавленных) эмбрионах вблизи клеток, чьи родоначальники обнаруживают заметную тенденцию испытывать симметричные скорее, чем асимметричные деления. Ранее поставленные эксперименты со сдавливанием зигот показали, что дробление происходит через короткую ось, давая в результате бластомеры, которые занимают соответственно эмбриональную и не-эмбриональную части, с полостью, формируемой преимущественно внутри потомства одного из двух 2-клеточных бластомеров на одном конце длинной оси^37,45 (FIG. 5b). К сожалению, эти исследования не могут быть сравнены полностью, т.к. Motosugi и др. не отслеживали клоны бластомеров в своих экспреиментах по 'сдавливанию'⁷¹ - их утверждение, что образование полости указывает на отсутствие взаимосвязи с клональной границей между потомками 2-клеточных бластомеров, базируется на их не сдавливаемом контроле.

Общим свойством представленных моделей является то, что полость д. формироваться в положении, которое отражает различия между или клетками или частями эмбриона - не в ответ на детерминирующий сигнал. Сleavage-driven гипотеза дает объяснение того, как мышиные эмбрионы могут обнаруживать паттерны (regularities) несмотря на то, что подвержены регуляционному развитию. Если порядок и ориентация делений на любой из стадий дробления нарушены (рандомизированы), тогда не будет специфической области в эмбрионе, дающей внутренние клетки с предпочтительными соединениями с наружной трофэктодермой. В таком случае полость может возникать в случайном положении. Эффекты изменения общей формы эмбриона оценить труднее. Могут ли изменения паттерна дроблений, которые возникают в результате изменения формы, быть достаточны для создания различий между клетками? Может ли также оказывать др. вклад формы клеток на создание давления внутри возникающей полости? Вполне возможно, что механизмы, которые контролирует формирование полости, разные у нормальных и уплощенных эмбрионов.

Cellular polarity and cell fate. Подвергаются ли бластомеры симметричным или асимметричным делениям, а, следовательно, и степень их вклада в ICM или трофэктодерму, по-видимому, находятся под контролем PAR белков. Установлено, что PAR3, atypical protein kinase C (aPKC) и junctional adhesion molecule-1 (JAM1), оказываются распределенными асимметрично, если бластомеры подвергаются поляризации на стадии 8-клеток^79,82. Если или PAR3 или aPKC подавлены 4-клеточных бластомерах, то потомство обнаруживает тенденцию давать больше асимметричных делений по сравнению с их сестринскими бластомерами⁷⁹. Это указывает на то, что ориентация клеточных делений может быть связана со степенью поляризации клеток: максимум клеточной полярности д. способствовать симметричным клеточным делениям, которые дают потомство наружных клеток; средняя степень полярности д. способствовать асимметричным делениям, которые будут давать наружные клетки и сестринские не-полярные внутренние клетки; а минимальная полярность д.б. недостаточной в клетках для поддержания внешнего положения, приводя к их интернализации. Следовательно, возможно, что вегетативные бластомеры из ME эмбрионов вносят вклад преимущественно в трофэктодерму т.к. их потомство оказывается поляризованным более сильно, чем соседние клетки? Если это так, то различия в поляризации клеток могут, в свою очередь, иметь связь с экспрессией генов и влиять на судьбу клеток. Некоторые молекулярные различия между бластомерами 4-клеточной и 8-клеточной стадии известны^83-84, но возникают ли они в связи с паттерном клеточных делений, пока неясно. Пока может только предложить теорию, как различные паттерны делений могут влиять на онтогенетические свойства бластомеров. Любой потенциальный фактор(ы), который будет дифференциально распределен между бластомерами, д. обязательно учитываться как детерминант. Это из-за того, что судьба клеток остается флексибельной, а развитие регуляционным. Такой фактор может быть специфической молекулой, но он может одинаково отражать и склонность в конституции клеток, которая затрагивает её ‘cellular fitness’.

The patterning of the mouse embryo, as with embryos of other species, is an emerging process that is built on successive asymmetries that gather as the egg develops after fertilization. But in the mouse, in contrast to many organisms, cell fate and patterning do not seem to be directed by determinants. Rather, cells ‘learn’ which fate to adopt from cues they meet on their way. This piecemeal acquisition of information, no single part of which could alone determine patterning but which together could do so, is compatible with regulative development.

Therefore the embryo is not a plain canvas to be painted only when cells adopt definitive positions in the implanting blastocyst. Even at the 4-cell or 8-cell stage, some blastomeres might have a ‘colour’ of their own, but these are pastel shades and are not fixed. The colours gradually become more intense so that, by the 16-cell stage, inside and outside cells have distinct molecular signatures. Even at this stage, cells can be repositioned and their signature will then change. This is not ‘painting by numbers’ but art inspired by the settings. This has been the main reason why it has been so difficult to identify any regularities in cell paths, which has led to disagreements about the extent to which development can be anticipated. We now have a new avenue of research to identify the cues that influence cell fate and how they lead to molecular differences between cells. Most of the studies that have been carried out so far on gene expression patterns in the pre-implantation mouse embryo have surveyed their temporal dynamics in development85–86. These studies should be extended to also examine differences in the spatial dynamics of gene expression, as we still need to understand how undetermined cells decide their fate and how they communicate these fate decisions to each other. Then we should be able to answer the fascinating question of how the embryo regulates its development when it becomes perturbed.