The ARP2/3 complex: an actin nucleator comes of age
Erin D. Goley and Matthew D. Welch Nature Reviews Molecular Cell Biology 7, 713-726 (October 2006) | doi:10.1038/nrm2026
The cellular functions of the actin cytoskeleton require precise regulation of both the initiation of actin polymerization and the organization of the resulting filaments. The actin-related protein-2/3 (ARP2/3) complex is a central player in this regulation. A decade of study has begun to shed light on the molecular mechanisms by which this powerful machine controls the polymerization, organization and recycling of actin-filament networks, both in vitro and in the living cell.
Рис.1. | Structure and function of the ARP2/3 complex.
Рис.2. | Model for activation and recycling of the ARP2/3 complex.
Рис.3. | Domain organization of nucleation-promoting factors.
Рис.4. | Cellular functions of the ARP2/3 complex.
Рис.5. | Pathogens use ARP2/3 complex activities during infection.
Wiskott–Aldrich syndrome protein (WASP) и WASP-family verprolin-homologous protein (WAVE) семейство белков являются каркасными, которые связывают вышестоящие сигналы, чтобы активировать комплекс ARP2/3 complex, что ведет к взрыву полимеризации актина. Обусловленная ARP2/3-комплексом полимеризация актина является критической для реорганизации актинового цитоскелета в кортексе клеток для таких процессов, как клеточное движение, везикулярный перенос и патогенная инфекция. Найдены крупные семейства белков, связанных с мембранами, которые взаимодействуют с белками семейств WASP и WAVE, тем самым выявляется новый слой зависимой от мембран регуляции полимеризации актина.
Рис.1. | Domains and basic binding partners of N-WASP and WAVE2.
Эукариотический актиновый цитоскелет играет важную роль в различных процессах, включая миграцию клеток, эндоцитоз, трафик пузырьков и цитокинез, многие из которых существенны для выживания клеток. Основным составляющим актинового цитоскелета является мономерный globular (G)-актин, 43-kDa ATPase, которая может собирать себя в ансамбли filamentous (F)-актина. Каждая асимметричная филамента обладает быстро растущим и медленно растущим , которые отличаются своими структурными характеристиками и кинетическими свойствами. Гидролиз АТФ в филаменте тесно связан с полимеризацией и регулирует кинетику сборки и разборки, а также ассоциации взаимодействующих белков. Эти биохимические свойства являются интегральными ждя клеточных активностей актина1
В клетках актиновых филаменты функционируют в качестве генерирующих силу моторов, структурных каркасов и треков для моторных белков. Динамика сборки и разборки филамент и образования крупно масштабных филаментозных структур являются критическими аспектами функции актина и, следовательно, находятся под скрупулезным контролем с помощью сотен актин-связывающих белков. Эти белки соединяются непосредственно с филаментами или мономерами и контролируют структуру и динамику актина с помощью: nucleating; capping; stabilizing; severing; depolymerizing; crosslinking; bundling; sequestering или delivering мономеров; или путем обеспечения нуклеотидных обменов мономеров. Скоординированные действия субнаборов актин-связывающих белков регулируют динамику различных наборов актиновых филамент в специфическом месте в специфическое время в клетке1.
Важный набор актиновых регуляторов инициирует формирование новых актиновых филамент с помощью процесса, который называется nucleation (Box 1). Спонтанная нуклеация является кинетическим препятствием в процессе полимеризации актина и поэтому факторы, которые могут ускорять или обходить эту ступень важны для эффективной сборки актина в клетке. Так, идентифицированы 3 класса белков, которые инициируют полимеризацию новых филамент: actin-related protein-2/3 (ARP2/3) комплекс, formins и spire (Box 1). Formins и spire были рассмотрены в деталях ранее2,3 и не будут тут рассматриваться. Внимание будет уделено ARP2/3 комплексу, который играет критическую роль в формировании сети разветвленных актиновых филамент во время разнообразных процессов от клеточной подвижности до эндоцитоза.
ARP2/3 complex 101
Интактный комплекс ARP2/3 впервые был очищен из Acanthamoeba castellanii на базе его сродства с актин-связывающим белком profilin4, и как было установлено, состоит из стабильного ансамбля из 7 полипептидов (Fig. 1a-c). Две из субъединиц оказались родственными актину белками и подсемейств, дав комплексу название. Эти белки ранее уже были идентифицированы у Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe5,6, Drosophila melanogaster7 и Caenorhabditis elegans8. Остальные 5 субъединиц были первоначально названы по размеру, но теперь обозначаются как ARPC1 (actin-related protein complex-1), , , и . ARPC1 (который присутствует в двух изоформах у людей, и ) является WD-повторы-содержащим белком, тогда как др. 4 ARPC субъединицы не содержат общих мотивов последовательностей. С момента его выделений из A. castellanii, весь комплекс был очищен из дрожжей9,10 и позвоночных11,12. Более того, большинство эукариот, геномы которых были секвенированы, содержат гены, которые как предполагается, кодируют все 7 субъединиц, за исключением некоторых protistan паразитов, включая Apicomplexa13 и Leishmania major14.
Комплекс ARP2/3 обладает низкой биохимической активностью сам по себе. Однако, если он задействован nucleation-promoting factor (NPF) белками. то он активируется, чтобы инициировать формирование новой (дочерней) филаменты, которая возникают из существующей (материнской) филаменты в виде y-branch конфигурации под регулярным в 70° углом ответвления15,16 (Fig. 1d). Эта связь нуклеации и разветвления с помощью комплекса ARP2/3 обозначается как аутокаталитическое ветвление или дендритная нуклеация и является центральной из его функций in vivo.
Subunit organization and structure. Ранние попытки пролить свет на структуру комплекса ARP2/3 покоились на генетической и биохимической реконструкции и химическом поперечном связывании in vitro17-21. Эти техники привели к незрелой картине взаимодействий между субъединицами, которые сохранились в свете более недавних структурных исследований. Детали организации комплекса ARP2/3 были установлены, когда кристаллическая структура телячьего комплекса была установлена при разрешении 2.0-Å22 (Fig. 1b). В этой структуре, ARP2 и ARP3 структурно сходны с актином, что и предсказывалось на основании их последовательностей23. Однако, их нуклеотиды соединяющие расщепы (clefts) пусты и открыты по сравнению с ATФ-связанным актином, результат того факта, что комплекс был очищен в отсутствие АТФ. Нуклеотид-связывающая структура также была установлена24. Что касается др. субъединиц, ARPC2 и ARPC4 формируют структурную сердцевину комплекса, тогда как остальные субъединицы организованы вокруг них, что согласуется с информацией по генетической и биохимической реконструкции18,20,21. ARPC1 является seven-bladed beta-propeller белком, тогда как ARPC3 и ARPC5 являются прежде всего alpha-спиралями и являются наиболее периферическими субъединицами.
ARP2/3 комплекс в кристаллическом виде, как полагают, находится в неактивной конформации, т.к., т.к. ни один из партнеров по связыванию, необходимых для активности, не присутствует. Более того, ARP2 and ARP3 повернуты наружу (splayed) врозь в структуре, что не согласуется с ведущей гипотезой, что они функционируют как актин-подобный гетеродимер, чтобы создать матрицу для нуклеации дочерней филаменты. Следовательно, активация комплекса, как полагают, нуждается в существенном конформационном изменении22 (Fig. 1b,c). Итак, отсутствуют высокого разрешения структуры активации промежуточных образований, поэтому необходимы дальнейшие исследования для выяснения переходов, которые происходят во время активации.
Имеется также ограниченная структурная информация о том, как ARP2/3 комплекс соединяется с актиновыми филаментами в соединении y-разветвления. Тем не менее, появляются новые данные и недавно предложены две модели25,26 (Fig. 1e). Одна базируется на картировании законсервированных поверхностных остатков на комплексе вместе с данными по cryo-electron microscopy (EM), кристаллической структуре и биохимии25. Др. базируется на недавней cryo-EM активированных ARP2/3-содержащих bulky tags, которые были использованы для картирования положения индивидуальных субъединиц в точке ответвления26. Эти две модели отличаются в деталях, но каждая предполагает след. общие принципы: ARP2 и ARP3 взаимодействуют с заостренным концом дочерней филаменты, а ARPC2 и ARPC4 осуществляют важные контакты с материнской филаментой (Fig. 1e). Однако, EM разрешение всё ещё слишком низкое, чтобы составить ясную картину этих взаимодействий на атомном уровне. Необходимы дальнейшие структурные исследования, чтобы включить активирующие факторы, такие как NPFs, актиновые филаменты и G-actin в картину активации ARP2/3 комплекса и ветвления.
Regulation of ARP2/3 complex activity by ATP
Механизмы перехода ARP2/3 комплекса из неактиного состояния в активную форму, которая обнаруживается в точке ветвления, и обратный переход, являются предметом интенсивных исследований. Как и в случае актина, связывание нуклеотидов и гидролиз их с помощью ARP2 и ARP3 влияет на структуру и функцию комплекса. ARP2 и ARP3 каждый связывают АТФ с микромолярным сродством27-30, a мутации, которые понижают сродство любого из ARP к АТФ вызывают сильное снижение активности29,30, указывая тем самым, что связывание нуклеотида с обоими ARPs является важным. Кристаллическая структура комплекса, связанного с АТФ24, и эксперименты с fluorescence resonance energy transfer (FRET)29 показывают, что соединение АТФ с ARP3 закрывает его нуклеотид-связывающую расщелину и вызывает глобальное конформационное изменение в комплексе. Однако, АТФ-связавшая структура всё ещё не напоминает предсказанную активную конформацию. Безусловно, субдомен-1 и -2 в ARP2 являются флексибельными и расстроенными в присутствии и отсутствии АТФ24. Дизорганизованная структура ARP2 может возникать в результате принуждения, которое вносится методом кристаллизации, который использует смачивание лишенных нуклеотида кристаллов в АТФ скорее, чем кристаллизацию в присутствии АТФ. С др. стороны, структура может отражать физиологическую роль NPFs или актина в связывании АТФ. В согласии с этой идеей связывание NPF с комплексом увеличивает его сродство к нуклеотиду27,28, а соединение нуклеотида с комплексом влияет на его сродство к NPF27.
В дополнение к связыванию нуклеотида, гидролиз нуклеотида также играет роль в функционировании комплекса ARP2/3. Гидролиз АТФ на ARP2 наблюдали, используя очищенный ARP2/3 комплекс in vitro, но только в присутствии актина и NPF31-33. Курьёзно, но гидролиз не наблюдался на ARP3, хотя его ATPase активность может нуждаться в ещё неизвестных кофакторах. Гидролиз нуклеотида с помощью ARP2 и/или ARP3, как первоначально полагали, существенен для активности ARP2/3, т.к. нуклеация и ветвление ингибировались с помощью не-гидролизуемого аналога АТФ, AMP-PNP27,28. Однако, недавно охарактеризованные Arp2 и Arp3 у дрожжевых мутантов, которые были неспособны гидролизовать АТФ, были активными как и белки дикого типа по обеспечению сборки актина in vitro33.
Роль гидролиза с помощью ARP2 дискуссионна, т.к. она связана по времени с событием нуклеации32 или по времени и функционально с разборкой веточек и рециклингом комплекса ARP2/331 (Fig. 2). Недавние доказательства от мутантов, дефектных по гидролизу, у дрожжей показали, что обе идеи скорее всего правильны33, т.к. гидролиз обнаруживается по времени связанным с нуклеацией и функционально важен для обеспечения разборки веточек33. Как гидролиз связан с разборкой веточек ещё предстоит определить, но он может быть связан с ослаблением контактов ARP-actin contacts, подобно роли гидролиза АТФ и высвобождению фосфата в актиновых филаментах.
Activation of the ARP2/3 complex by NPFs
С момента открытия первого NPF почти 10 лет тому назад, их было идентифицировано множество. Эти белки были подразделены на две основные группы, class I и class II, базируясь на механизме, с помощью которого они активируют комплекс ARP2/3 и их эффекта на реакцию y-ветвления. Важно, что активности NPFs регулируются с помощью путей сигнальной трансдукции, которых координируют полимеризацию актина в пространстве и времени. Наиболее изученные из этих путей связаны с активацией class I NPFs с помощью Rho-семейства GTPases CDC42 и Rac (Box 2). Т.к. регуляция NPFs рассматривалась в недавних обзорах34,35, то здесь основное внимание уделено механизмам, с помощью которых NPFs взаимодействуют и активируют ARP2/3 и клеточным процессам, которые управляются NPFs.
Class I NPFs. Первым в class I NPF был идентифицирован 36, белок, который обнаруживается на поверхности бактериального патогена Listeria monocytogenes и который необходим для базирующейся на актине подвижности бактерий в цитоплазме хозяина. Характеристика ActA сопровождалась идентификацией двух эукариотических белков class I NPFs: Wiskott-Aldrich syndrome protein (WASP) и suppressor of cyclic AMP repressor (SCAR; называемый также как WASP-family verprolin-homologous protein (WAVE))18,37-40. Др. члены class I NPFs, которые были недавно идентифицированы, включают грибкового типа I myosins41,42, metazoan CARMIL (capping protein ARP2/3 and myosin-I linker)43 и патогенные белки, такие как RickA из Rickettsia44,45. Величина и разнообразие class I NPFs варьирует от одного организма к др.; S. cerevisiae и S. pombe имеют по одному WASP гомологу; D. melanogaster и C. elegans имеют WASP и SCAR/WAVE; растения имеют только SCAR/WAVE; а млекопитающие имеют WASP, близко родственную neural и три SCAR/WAVE изоформы.
Члены класса I NPFs разнообразны в отношении их общей доменовой организации (Fig. 3). Они обладают одним общим WCA доменом, который состоит из WASP-homology-2 (WH2 или W; называемого также verprolin-homology) домена, который соединяется с G-actin способом, который делает возможным полимеризацию на barbed конце растущей филаменты46, и центральной (C; также наз. cofilin-homology or connector) и acidic (A; обе области вместе известны как CA) областью, которые обеспечивают связывание с ARP2/3 (Refs 47, 48) (CARMIL и type I myosins могут быть лишены некоторых элементов WCA). Домен WCA достаточен для активации комплекса ARP2/3 in vitro, чтобы полимеризовать разветвленные актиновые филаменты.
Простейшая модель действия WCA домена заключается в доставке актиновых мономеров в комплекс, формировании тримера из ARP2, ARP3 и actin, который функционирует в качестве ядра для новой филаменты. Однако, некоторые линии доказательств указывают на то, что действительный механизм более сложен. Напр., NPFs отличаются по своей способности активировать ARP2/3, но активность NPF не коррелирует непосредственно со сродством NPFs к ARP2/3 комплексу или G-actin48,49. Более того, кинетическое моделирование ARP2/3-обусловленной нуклеации указывает на существование самостоятельной ступени активации, которая происходит вслед за образованием NPF-ARP2/3-actin ансамбля49. По крайней мере, прикрепление WH2 домена к ARP2/3 комплексу недостаточно, чтобы обеспечить активацию; ARP2/3-связывающая CA область необходима также в транс-положении29. Следовательно, CA область, по-видимому, имеет более сложную функцию, чем просто поставка G-actin.
Недавние доказательства показывают, что CA способствует конформационным изменениям ARP2/3 комплекса, которые зависят от законсервированных остатков в центральной области NPF. Эта структурная перестройка в комплексе, которая сводит ARP2 и ARP3 вместе, наблюдалась как при FRET29Ю так и cryo-EM50. Согласуется с этой идеей и то, что NPF связывание закрывает щель между ARP2 и ARP3, при этом WCA фрагменты химически поперечно связываются с ARP2, ARP3 и соседними ARPC1 и ARPC3 субъединицами51-53. Более того, cryo-EM помещает WCA домен рядом с интерфейсами этих субъединиц50. Как только достигается модулирующая конформация ARP2/3, то центральная область домена WCA, как было установлено, взаимодействует с актиновым мономером способом, который действительно эксклюзивный в отношении своего связывания с комплексом ARP2/3, это указывает на то, что она подвергается серии динамических взаимодействий с G-actin и ARP2/3 (Ref. 54).
Всё это показывает модель функционирования class I NPF, в которой (Fig. 2) acidic область обеспечивает связь ARP2/3, центральный регион инициирует активирующее конформационное изменение в комплексе, а WH2 и центральная области презентируют актиновый мономер комплексу, облегчая формирование ядра для полимеризации дочерней филаменты. После инициации y-веточки, class I NPFs диссоциирует с комплекса ARP2/326 и может действовать каталитически во множественных раундах активации ARP2/3. Точная природа и время динамических взаимодействий между членами класса I NPFs, G-actin и комплексом ARP2/3, которые приводят к нуклеации актина, всё ещё неизвестны.
Class II NPFs. Class II NPFs включает S. cerevisiae actin-binding protein-1 ()55 и (Ref. 56), а также metazoan 57-59. Подоббно class I NPFs, эти белки содержат ARP2/3-связывающую acidic область, но они лишены G-actin-связывающей области. Вместо этого, они содержат F-actin-связывающую область, которая необходима для активации ARP2/3 (Fig. 3). Это функционально важное отличие, т.к. Abp1, Pan1 и cortactin являются менее мощными активаторами комплекса ARP2/3 in vitro, чем class I NPFs.
Механизм активации ARP2/3 с помощью class II NPFs не совсем ясен. Cortactin лишен центральной области и неспособен обеспечивать активирующее конформационное изменение в комплексе ARP2/329, что вообще-то объясняется его слабой NPF активностью. Механизм, с помощью которого class II NPFs активирует ARP2/3 может использовать способность обеспечивать ассоциацию ARP2/3 с F-actin55,58,59, который сам по себе является активатором комплекса. Cortactin и N-WASP могут соединяться одновременно с ARP2/3 комплексом52; N-WASP высвобождается после образования y-ответвления, тогда как cortactin остается ассоциированным с комплексом в точке ветвления26 и ингибирует диссоциацию веточки59. Следовательно, скорее действуя не как активаторы комплекса ARP2/3 class II NPFs может выполнять более важную функцию стабилизации организации y-разветвленной актиновой сети, которая генерируется комплексом ARP2/3 и class I NPFs. Остается установить как, активности class I и class II NPFs координируются, чтобы регулировать динамику актиновых сетей в клетках.
Actin branching and debranching
Пресформированные актиновые филаменты также являются активаторами ARP2/3-обеспечиваемой нуклеации in vitro37,60. Кинетические модели показали, что полимеризация актина с помощью ARP2/3 комплекса является аутокаталитической со скоростью реакции повышающейся по мере генерации полимера61. Это заключение согласуется с др. функциональным доказательством, напр., anti-ARP2/3 антитела, которые предупреждают связывание филамент, снижают активность нуклеации62. Эти наблюдения указывают на то, что нуклеация филамент и y-ветвление тесно связанные и вообще-то неразделимые активности.
Как в точности активности по нуклеации и ветвлению связаны является предметом споров и предложены две конкурирующие модели. Первая предполагает, что ветвление происходит от боковой стороны существующей филаменты, а вторая предполагает, что оно возникает на barbed концах филамент. Наиболее убедительные экспериментальные доказательства подтверждают модель бокового ответвления, т.к. ответвление от боковой поверхности филаменты можно наблюдать непосредственно с очищенными белками in vitro, используя флюоресцентную микроскопию16,63,64. Др. экспериментальные результаты более двухсмысленны. Напр., в некоторых исследованиях делается вывод, что перекрывание barbed концов не оказывает эффекта на активацию ARP2/3 и ветвление, в подтверждение side-branching модели65, в то время как др. приходят к выводу, что перекрывание ингибирует ветвление, что трактуется в пользу модели barbed-end-branching66,67. Подтверждение в пользу модели ветвления из barbed конца получено также из EM данных, которые показали корреляцию между длинами материнской и дочерней филамент в точке разветвления61.
Привлекательным компромиссом между этими моделями (Fig. 2) могут служить наблюдения, что боковое ответвление имеет тенденцию происходить в части, никогда не содержащей АТФ, вблизи barbed концов материнских филамент по сравнению со старыми ADP-содержащими частями в направлении заточенных концов16,64. Дальнейшим подтверждением этого biased-side-branching механизма явилось кинетическое моделирование, которое показало, что эта модель дает наилучшее согласие с кинетическими данными68. Тенденциозное боковое ответвление д. гарантировать, что новые концы филамент будут генерироваться проксимальнее мест, которые необходимы для генерации актином-обуславливаемых сил в клетках.
Mechanisms of debranching. Освобождение материнской и дочерней филамент от комплекса известно как debranching, оно является критическим для рециклинга актиновых сетей в клетках. In vitro, период полужизни y-разветвления находится в пределах от 8 до 27 мин.31,33,69. Этот период полужизни, по-видимому, намного короче в клетках, т.к актиновые филаменты заменяются менее чем через минуту в областях динамической разборки актина70.
Были описаны некоторые факторы, как участвующие в debranching. Гидролиз нуклеотида и высвобождение неорганического фосфата (Pi) с помощью актиновых субъединиц в материнской филаменте, как предполагается, влияет на частоту ветвления64,69, однако, эти данные не отличаются между эффектами инициации ветвления или диссоциации. Гидролиз АТФ и высвобождение Pi из актиновых субъединиц в дочерней филаменте также, как было установлено, снижает сродство ARP2/3 комплекса к заостренным концам и способствует диссоциации69. Эти результат не согласуются с наблюдениями, показавшими, что фиксация актина в ADP-Pi состоянии не сказывается на debranching31, и что гидролиз АТФ и высвобождение Pi из актина происходит значительно быстрее, чем debranching. Для решения этого вопроса необходима разработка более физиологических и количественных подходов debranching.
Несмотря на эту неудачу становится ясно, что гидролиз АТФ и высвобождение Pi от ARP2 играет важную роль в debranching31,33. Хотя точная временная последовательность ARP2 ATФ гидролиза по отношению к debranching служит предметом споров31,32, недавнее исследование с использованием мутантного ARP2, который не может гидролизовать АТФ показало, что гидролиз по времени связан с нуклеацией, но функционально важен для облегчения debranching33. Этот интригующий результат указывает на то, что гидролиз нуклеотида на ARP2 может инициировать часы debranching, но не запускать непосредственно диссоциацию веточек. Актин-связывающие белки, подобно нуклеотиду, могут регулировать время жизни y-разветвления. Напр., debranching может быть ускорено с помощью actin-depolymerizing factor (ADF; известного также как cofilin)69, и может ингибироваться с помощью class II NPF cortactin59. Этот и др. регуляторные факторы скорее всего действуют в клетках, гарантируя, что комплекс ARP2/3 и actin будут подвергаться рециклингу и что актиновая сеть будет ремоделироваться, как необходимо.
Cellular functions of the ARP2/3 complex
Скоординированная нуклеация и ветвление с помощью ARP2/3 комплекса играет важную роль в некоторых клеточных процессах.
Evidence from genetics. Генетические исследования показали, что комплекс ARP2/3 важен для жизнеспособности как одноклеточных, так и многоклеточных организмов. У S. cerevisiae и S. pombe, инактивация или делеция генов, которые кодируют субъединицы комплекса ARP2/3, вызывают тяжелые дефекты роста или гибель5,9,10,19,71. У D. melanogaster, нарушение функции ARP2/3 вызывает гибель до достижения взрослой стадии, с дефектами в цитоплазматической организации бластодермы, развития аксонов, экспансии и морфологии глаз72,73. RNA interference (RNAi)-обусловленный нокдаун субъединиц ARP2/3 у C. elegans приводит к гибели и затрагивает вентральную enclosure у развивающегося червя74. Хотя не опубликовано сообщений о ARP2/3-нокаутных млекопитающих, но инактивация ARPC3 в клетках HeLa человека с помощью RNAi летальна75. Более того, инактивация или нокаут индивидуальных NPFs у мышей приводит к дефектам от эмбриональной или постнатальной смертности до более легких ткане-спецефических отклонений76-81
Функция комплекса ARP2/3 безусловно важна для некоторых организмов, однако, не существенна для всех эукариот. У Arabidopsis thaliana, мутации субъединиц ARP2/3 комплекса вызывают дефекты в форме эпидермальных клеток, но не влияют на жизнеспособность растений82-84. Также, apicomplexan паразиты, полностью лишенные ARP2/3 комплекса13, а L. major кодирует только некоторые из субъединиц14. Тем не менее тяжесть фенотипов, которые индуцируются, когда нарушена функция ARP2/3 комплекса у разных видов, отражает его роль в фундаментальных и законсервированных клеточных процессах.
Cell migration and adhesion. Клеточная миграция ползком является основным поведением многих типов клеток от одноклеточной амёбы, которая мигрирует в направлении пищи, до клеток многоклеточных организмов, которые мигрируют во время развития, заживления ран и иммунной реакции. Эффективность миграции связана с динамичной сборкой актина по соседству с плазматической мембраной в структурах, известных как , и , которые являются выпячиваниями, которые управляют продвижением ведущего края клетки.
Комплекс ARP2/3 локализуется в lamellipodia и pseudopodia, обычно внутри нескольких микрометров ведущего края23,85-87, но не филоподий. Более того, ARP2/3 комплекс обнаруживается с помощью immuno-EM как организующий актин в y-разветвленные сети в ламеллиподиях, одинаково с его активностью in vitro15,88. Мнение, что ARP2/3 комплекс играет важную роль в выпячивании ламеллиподий подтверждается находками, показывающими, что этот процесс ингибируется, когда активность ARP2/3 редуцирована в разных типах клеток с использованием RNAi89,90, ингибирующих антител62 или доминантно-негативных фрагментов NPFs18. Имеются противоречивые сообщения, что замалчивание экспрессии ARP3 с помощью RNAi не ингибирует выпячиваний ламеллиподий91, но в этом случае RNAi неспособна также полностью ингибировать подвижность L. monocytogenes, процесса, который зависит от активности ARP2/340,92.
Некоторые из этих расхождений могут быть обусловлены дифференциальной ролью комплекса ARP2/3 в разных типах клеток, т.е. активность ARP2/3, как было установлено, безразлична для выпячивания ведущего края во время транслокации ростового конуса нейронов93. Более того, неспособность формировать обнаружимые ламеллиподии, которые содержат ARP2/3, не обязательно ингибирует выпячивание ведущего края или миграцию всей клетки94. Относительно filopodia, было предположено, что их организованная в пучки филамент сердцевина возникает из ARP2/3-генерированных y-разветвленных филаментных сетей в ламеллиподиях95,96. Тем не менее, последнее исследование приводит к заключению, что ARP2/3 не является необходимым для формирования филоподий90. Эти наблюдения подчеркивают потенциальную важность др. путей полимеризации актина.
NPFs, которые ответственны за активацию комплекса ARP2/3 в lamellipodia и pseudopodia являются SCAR/WAVE белками (Fig. 4). В клетках млекопитающих имеются три SCAR/WAVE изоформы, которые обнаруживают ткане-специфичные паттерны экспрессии97,98, каждый из которых локализуется на ведущем крае мигрирующих клеток99-101. Путем исследования фибробластов и др. типов клеток, которые истощали по этим белкам с помощью мутаций или RNAi, стало ясным, что SCAR2/ (Refs 80, 81) и SCAR3/ (Ref. 102) являются критическими для формирования lamellipodia и управляют клеточной миграцией, в то время как SCAR1/ является важным для формирования дорсальных морщин (ruffle) и стабилизации lamellipodial выпячиваний103,104. Значение SCAR/WAVE белков не уникально для млекопитающих, т.к. потеря этих белков в D. melanogaster S2 клетках также предупреждает образование ламелл89. Функция SCAR/WAVE белков на ведущем крае, как полагают, контролируется с помощью малой GTPase Rac, которая играет ключевую роль в формировании lamellipodia105 (Box 2). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять, как SCAR/WAVE-ARP2/3 путь кооперирует с др. путями, чтобы обеспечить полимеризацию актина во время клеточной миграции.
Ремоделирование актина в lamellipodium связано с формированием слипчивых контактов, которые связывают актиновый цитоскелет с внеклеточным матриксом или соседними клетками. Полученные доказательства указывают на то, что комплекс ARP2/3 может быть временно ассоциирован с формируемыми фокальными контактами посредством их непосредственного связывания с integrin-ассоциированным белком vinculin, вообще-то действующим как связь адгезии с выпячиваниями мембран106. Сходным образом наблюдалось, что E-cadherin взаимодействует с ARP2/3 комплексом, чтобы обеспечить локальную сборку актина и выпячивания ламеллиподий во время формирования ранних межклеточных адгезивных контактов107, эффект, который снижается после созревания адгезивных сайтов108. Это позволяет объяснить переход этих сайтов от сайтов динамических контактов к неподвижным соединениям, которые необходимы для стабильных взаимодействий между клетками.
Moving membranes and their cargoes. Полимеризация актина также связана с генерацией сил, которые ремоделируют транспортные мембраны во время событий доставки. Фагоцитоз или поглощение крупных (более 0.5 µm в диаметре) частиц, таких как бактерии, нуждается в полимеризации актина, чтобы управлять увеличением плазматической мембраны вокруг поверхности частицы (Fig. 4). Комплекс ARP2/3 локализуется как на-опосредованных так и -обеспеченных фагосомах и является важным для полимеризации актина в фагоцитическом бокале, а также для последующего поглощения частиц109. Эта функция скорее всего имеет первостепенное значение для профессиональных фагоцитов иммунной системы, которые помогают очищать от инфекционных агентов. Единственным NPF участвующим в фагоцитозе является WASP, который специфически экспрессируется на Fcγ-receptor-индуцированными фагоцитических бокалах110,111, и клетках от пациентов с , которые содержат нулевые аллели WASP, обнаруживают пониженную способность к фагоцитозу и дефекты накопления актина в фагоцитических структурах112.
Актин также участвует в интернализации малых грузов с помощью эндоцитоза (Fig. 4). У S. cerevisiae комплекс ARP2/3 и NPFs, включая Pan1, myosin-5, Las17 (WASP гомолог) и Abp1, рекрутируются в эндоцитотические сайты перед или одновременно с полимеризацией актина113,114. Сходным образом, в клетках млекопитающих N-WASP, cortactin и ARP2/3 комплекс локализуются в местах 115,116. Нарушение активности комплекса ARP2/3 и его активаторов в дрожжах или клетках млекопитающих вызывает дефекты эндоцитоза117-120.
ARP2/3-обусловленная полимеризация актина участвует и в событиях мембранного трафика (Fig. 4). Актин и актин-связывающие белки ассоциируют с аппаратом Golgi и играют роль как в антероградном, так и ретроградном транспорте127. Инициация полимеризации актина в Golgi мембранах регулируется за счет рекрутирования ARP2/3 комплекса, N-WASP и его вышестоящего регулятора CDC42 (Refs 128-131). Точная роль актина в транспорте в и из Golgi ещё предстоит выяснить, но сходно с его ролями в эндоцитозе, он может функционировать в отшнуровке или подвижности пузырьков. Комплекс ARP2/3 может также играть роль в экзоцитозе. Хотя детали его участия неясны, ARP2/3 комплекс локализуется в секреторных гранулах в PC12 нейроэндокринных клетках, а N-WASP и CDC42, как было установлено, способствуют экзоцитозу132. Понимание биофизической роли ARP2/3 в ремоделировании мембран и того как этот процесс контролируется в клетках является важной областью будущих исследований.
The ARP2/3 complex and disease
Учитывая рад важных клеточных функций, которые приписываются комплексу ARP2/3 complex, не удивительно, что его дисфункция ассоциирует с болезнями.
Pathogens abuse the ARP2/3 complex's power. Многочисленные микробные патогены манипулируют комплексом ARP2/3 для получения преимуществ во время инфекции (Fig. 5). Микробы отличаются существенно по механизму, с помощью которого они достигают и активируют комплекс ARP2/3, но в целом они могут быть сгруппированы в два класса: те, которые активируют ARP2/3 комплекс с внешней стороны клетки, и те, которые активируют комплекс внутриклеточно.
Патогены, которые активируют ARP2/3 на внешней стороне используют стратегию, чтобы воспроизвести или вставиться в рецепторами обусловленные сигнальные события, которые ведут к полимеризации актина на плазматической мембране. Двумя сходными примера этого являются вызывающие диарею агенты enteropathogenic и enterohaemorrhagic Escherichia coli (EPEC и EHEC), которые формируют богатые актином пьедесталы, которые обеспечивают прикрепление бактерий и перемещение через клетки кишечного эпителия133. EPEC используют тип .
Напротив, патогены, которые располагаются внутри цитоплазмы имеют непосредственный доступ к комплексу ARP2/3 и NPFs. Многие из этих патогенов приобретают способность рекрутировать и активировать ARP2/3 на своей поверхности, приводя к полимеризации актина и к базирующейся на актине подвижности, которая способствует распространению бактерий между клетками (Fig. 5). Такого типа подвижность впервые была описана для L. monocytogenes и Shigella flexneri, а позднее наблюдалась у филогенетически отличающихся бактерий, включая виды Rickettsia, Burkholderia pseudomallei и Mycobacterium marinum133. В случае L. monocytogenes и видов рикетсий бактерии кодируют свои собственные NPFs (ActA и RickA, соотв.), которые непосредственно активируют ARP2/3 комплекс36,44,45. Напротив, S. flexneri экспрессирует белок, наз. IcsA, который рекрутирует N-WASP хозяина143, a M. marinum также рекрутирует WASP или N-WASP хозяина посредством не установленного механизма144. Точные механизмы, используемые B. pseudomallei, чтобы полимеризовать актин ещё неизвестны145. Базирующаяся на актине подвижность L. monocytogenes и S. flexneri теперь может быть восстановлена путем очистки компонентов in vitro146, что служит прекрасной моделью для понимания биохимических и биофизических свойств генерирующих силы актиновых сетей.
The ARP2/3 complex and human disease. Помимо злоупотребления инвазирующими микроорганизмами, неправильное функционирование комплекса ARP2/3 и его регуляторов могут приводить к болезням. Важным примером является WAS, редкое рецессивное Х-сцепленное заболевание, которое связано с дефектами функции кровяных клеток147 и ведет к чувствительности к инфекции, экземе и внутренним геморрагиям. Ген, который мутантен при WAS кодирует белок WASP, NPF, который специфически экспрессируется в гематопоэтических клетках148. В Т клетках мутации в WASP вызывают специфические дефекты в функционировании богатых актином иммунологических синапсах, которые формируют интерфейс между Т клеткой и 149,150, приводя к дефектам в передаче сигналов Т-клеточными рецепторами, в продукции interleukin-2 и пролиферации Т клеток147. Недавние исследования показали, что SCAR/WAVE белки также играют важную роль в обеспечении динамики актина в иммунологических синапсах151,152, чтобы вносить translocated intimin receptor (Tir) в плазматическую мембрану клеток хозяина. Tir в свою очередь рекрутирует факторы хозяина, включая NPF N-WASP, что ведет к активации комплекса ARP2/376,134,135. С слегка измененной такой стратегией EHEC используют бактериальный эффекторный белок EspFU в комбинации с Tir, чтобы рекрутировать N-WASP и ARP2/3 комплекс хозяина136. Vaccinia virus, довольно причинный агент smallpox, формирует поддержки (pedestals) для выхода из клеток хозяина в процессе, который, как полагают, способствует межклеточному распространению137. Одинаково с EPEC и EHEC, vaccinia A36R белок воспроизводит передачу сигналов рецепторной тирозин киназы, приводящих к активации N-WASP и комплекса ARP2/3 хозяина138. Др. примером служит Salmonella enterica, которая индуцирует полимеризацию актина в не фагоцитирующих клетках, что способствует интернализации бактерий. Подобно E. coli, S. enterica использует type III секрецию, чтобы доставлять бактериальные эффекторы в цитоплазму клеток хозяина139. Однако, эффекторы S. enterica активируют CDC42 и Rac, которые в свою очередь активируют WASP или N-WASP и SCAR/WAVE, приводя к ARP2/3-обусловленному сморщиванию мембраны, которые съёживаются, и интернализации бактерий140-142.
В тромбоцитах мутации в WASP вызывают дефекты цитоскелета, которые приводят к снижению количества и объёма тромбоцитов147. Более того, мутации в WASP вызывают дефекты в формировании богатых актином podosome в макрофагах153 и остеокластах154, эффективности фагоцитоза у макрофагов112 и хемотаксиса у макрофагов и дендритных клеток155-157. Тяжесть болезни, которая возникает, когда функция этого одиночного NPF нарушена, подчеркивает важность точной регуляции комплекса ARP2/3 в иммунном ответе и подчеркивает потенциальное значение эти х факторов для понимания и лечения болезней иммунитета и воспалений.
Дисфункция комплекса ARP2/3 может таке быть ассоциирована с раковым метастазированием, что связано со способностью раковых клеток мигрировать прочь от первичной опухоли и инвазировать здоровые ткани158. Экспрессия ARP2/3 мРНК и уровней их белков159-161, вместе с N-WASP162, WAVE2 (Ref. 161) и др. факторами, которые функционально ассоциированы с клеточной подвижностью158, позитивно регулируется в некоторых опухолевых тканях и инвазивных клетках. Инвазия раковых клеток в ткани также нуждается в формировании богатых актином структур, таких как подосомы и invadopodia, которые обладают адгезивной и protrusive активностью и способствуют деградации внеклеточного матрикса. Активация ARP2/3 комплекса необходима для формирования podosome153,154,163, a комплекс ко-локализуется с WASP163, N-WASP164 и cortactin165 в сердцевине богатых F-актином podosome (Fig. 4). Сходным образом ARP2/3 комплекс и N-WASP локализуются в invadopodia и необходимы для их образования166. Комплекс ARP2/3 и его активаторы, следовательно, сходны с критическими участниками процесса инвазии опухолевых клеток и метастазированием и могут представлять собой мишени для терапевтического воздействия.
Concluding remarks
Ten years of research into the function and regulation of the ARP2/3 complex has produced abundant information about this fascinating molecular machine. Nevertheless, many questions remain to be answered. One important area for exploration relates to how the activity of ARP2/3 is regulated in the cell. For example, we know little about how the activities of distinct NPFs are coordinated to mediate actin polymerization and organization during different cellular behaviours. Moreover, we need to determine whether there are undiscovered NPFs that link the ARP2/3 complex to unique signalling pathways, subcellular locales and actin-dependent events. A second important area for exploration relates to the precise mechanism of actin nucleation and organization by the ARP2/3 complex. What is missing is a detailed molecular map of the complex when it is engaged with an NPF, mother filament, and daughter filament. Last, we are beginning to characterize the role of the ARP2/3 complex in pathogenesis, immunity, inflammation and cancer progression, and the information we gain from basic studies could be relevant to translational research that is aimed at diagnosing and treating disease. With the basic paradigms of ARP2/3 complex regulation and function defined, we are poised to begin exploring the complex web of interactions that allow it to function precisely in the complicated cellular world.
