Calreticulin-нулевые эмбрионы погибают во время средины беременности из-за дефектов развития сердца. Исследования показали. что в самом деле промотор calreticulin высоко активен во время кардиального органогенеза, но его активность снижается и становится не обнаружимой после рождения [11]. Western blotting показал, что количества белка calreticulin соответствуют по времени уровню активных промоторов. Установлено, что устранение calreticulin сопровождается дизорганизацией миофибрилл в миокарде желудочков, но не предсердий. Кроме того, calreticulin KO фенотип характеризуется низким числом миофибрилл, их волнистостью и истонченностью.

Рано в эмбриональном развитии миофибриллы ограничиваются периферией кардиомиоцитов. Однако, т.к. количество и размеры миофибрилл увеличиваются во время развития, то они прогрессивно распространяются во внутрь клетки. В раннем развитии миофибриллы не организованы, т.е. миофибриллы случайно ориентируются на срезах и не лажат параллельно вдоль длинной оси кардимиоцита. Такая случайная ориентация миофибрилл характеризует незрелый миокард в нормальных условиях [17]. По ходу дальнейшего эмбрионального развития миофибриллы дикого типа становятся более упорядоченными по отношению др. к др и длиной оси кардимиоцитов [18]. Напротив, развивающиеся вентрикулярные миофибриллы из calreticulin KO сердец становятся выровненными по отношению одна к др. и к длинной оси кардиомиоцитов значительно позднее вентрикулярных миофибрилл в нормальных сердцах. Это иллюстрирует временную природу этой дизорганизациии миофибрилл.

Вторым признаком вентрикулярных KO миофибрилл является их волнистый вид. Волнистость миофибрилл дикого типа выражена на 13.5 dpc, затем миофибриллы выпрямляются. Сходная волнистость описана и в раннем миокарде крыс [19]. Напротив, calreticulin KO миофибриллы становятся волнистыми с начала развития и не выпрямляются. Это различие наиболее заметно на 18.5 dpc. Сравнивали морфологию calreticulin KO вентрикулярных миофибрилл с таковыми дикого тип на более ранних стадиях развития. Было установлено, что calreticulin KO вентрикулярные миофибриллы поздних стадий эмбрионального развития не напоминают ни ранние, ни средней стадии вентрикулярные миофибриллы дикого типа. Следовательно, характерная волнистость calreticulin KO вентрикулярных миофибрилл не является результатом онтогенетической задержки, а результат дефекта, связанного с недостаточностью calreticulin.

Какрв же механизм, с помощью которого устранение calreticulin влияет на организацию миофибрилл? Calreticulin затрагивает экспрессию как vinculin так и N-cadherin в клетках, растущих in vitro [3-5], их роль заключается в модуляции клеточной адгезивности [6]. Клеточная адгезивность является морфогеном с ролью в кардиальном миофибриллогенезе [20-23]. Главными адгезивными структурами кардиомиоцитов являются интеркалированные диски [24,25], часть из которых является adherens-типа соединениями, которые содержат N-cadherin [26]. N-cadherin необходим для собственно органогенеза сердца, как показывают эксперименты с использованием антител, блокирующих функцию [27-30], экспрессии ретровирусов с доминантно-негативными мутациями N-cadherin [31,32] или генетическими преобразованиями [33,34]. Во время гаструляции N-cadherin униформно распределен по всей сердце-формирующей мезодерме и также униформно распределен в трубчатом сердце [35]. В развивающемся сердце zonula adherens являются первичными местами накопления N-cadherin [26,36-38]. N-cadherin может также обнаруживаться в non-junctional sarcolemma [21,27,39] и главным образом в costameres [30,40]. Экспрессия N-cadherin в развивающемся миокарде , как было оценено с помощью Western blotting, постепенно увеличивается на стадии пре-трабекуляции, после чего она остается относительно постоянной [32]. Важно, что экспрессия N-cadherin не столь уж необходима для миофибриллогенеза per se, а также для непрерывного выравнивания миофибрилл между миоцитами [41]. Вполне возможно, что редукция экспрессии N-cadherin в calreticulin KO сердцах может лежать в основе наблюдаемого беспорядка миофибрилл.

Большинство миофибриллярных белков присутствуют в саркомерах, когда происходят первые сокращения в развивающемся сердце. Вскоре после этого миофибриллы приобретают свою окончательную ориентацию вдоль оси клетки, возможно благодаря взаимодействию с промежуточным белком филамент, desmin, и с vinculin в costameres, которые являются компонентами кардиального цитоскелета, ответственного за передачу генерируемых сил с помощью сократительного аппарата [21,23,42-46]. Т.о., costameres и интеркалированные диски являются важными для собственно миофибриллогенеза [17,24,40,47,48]. Сравнение вентрикулярного миокарда у calreticulin KO по сравнению с нормой показало едва различимые отличия в морфологии интеркалированных дисков. В нормальном миокарде интеркалрованные диски разделяют кардиомиоциты по прямой линии или ступенчатым образом. Хотя и нет обнаружимых морфологических отличий между интеркалированными дисками в предсердиях и желудочках при любом фенотипе, но интеркалированные диски calreticulin KO вентрикулярного миокарда скорее всего образуются ступенчато, это скорее всего обусловлено тем, что интеркалированные диски соседних миофибрилл кардиоцита не находятся в одном регистре. Т.к. устранение N-cadherin обусловливает потерю интеркалированных дисков [34], то мы полагаем, что наблюдаемое снижение его экспрессии может вмешиваться в собственно расположение интеркалированных дисков в calreticulin KO миокарде.

В развивающихся кардиомиоцитах гликоген многочисленен, т.к. он является главным энергетическим источником [49] , но его количество снижается по мере созревания. В раннем эмбриональном развитии (12.5 и 13.5 dpc), гликоген диффузно распределен ко всей саркоплазме. Хотя гликоген в большинстве тканей локализован в лизосомах, этого не происходит в сердце. Частицы гликогена располагаются свободно в саркоплазме: они не окружены и не прикреплены к мембранам [50,51]. На 14.5 dpc, гликоген агрегирует в глобулы и на 18.5 dpc, он обнаруживается в основном в виде крупных пулов с саркоплазме [25]. Calreticulin KO вентрикулярные кардиомиоциты содержат достоверно больше гликогене, чем соотв. дикого типа кардиомиоциты. Более того, т.к. содержание гликогена снижается в желудочках дикого типа, его количество увеличивается по мере эмбрионального развития в calreticulin KO желудочках. Онтогенетическая регуляция содержания гликогена в сердце не изучалась. Knaapen et al. [52] сообщили об увеличении содержания гликогена в сердце крыс между эмбриональным днем 11 и 17 и предположили, что это увеличение может быть скорее структурным, чем метаболическим. Накопление гликогена в calreticulin KO но не в дикого типа сердцах и в желудочках, но не предсердиях, по-видимому, согласуется со структурной гипотезой накопления гликогена в развивающемся сердце мышей. Эти отклонения гликогена обеспечиваются каскадом событий, которые превращают неактивную glycogen phosphorylase b в активную phosphorylase a [49]. Calmodulin, внутриклеточный кальций-связывающий регуляторный белок, является одной из субъединиц phosphorylase b kinase, высвобождает inositol trisphosphate-dependent calcium из хранилищ и необходим для активации его и phosphorylase [53]. Т.к. calreticulin является основным источником inositol trisphosphate-releasable кальция [54], то его нехватка может приводить к нарушению функции calmodulin и накоплению гликогена. С др. стороны, накопление гликогена в желудочках calreticulin KO напоминает легкую форму болезни накопления гликогена. При glycogen storage diseases type II (Pompe's disease), type III (Cori's disease) и type IV (Andersen's disease), у людей может затрагиваться сердце [55] как и у мышей [56]. При Pompe's болезни, мышечные клетки сердца вакуолизируются из-за массивных отложений гликогена смещающих миофибриллы на периферию клеток [50,57,58]. N-сцепленное гликозилирование происходит во время пост-трансляционных модификаций лизосомного α-glucosidase и сообщалось, что мутации лизосомного 1,4-α-glucosidase затрагивают укладку и в результате приводят к болезни Pompe's [59-62]. Помимо регуляции внутриклеточного гомеостаза кальция др. функцией calreticulin является "quality control" укладки гликозилированных белков [2]. Т.к. calreticulin функционирует как lectin-подобный молекулярный хаперон, то он может также участвовать в укладке лизосомной 1,4-α-glucosidase. Т.о., дефицит calreticulin может приводить к к несоответствующей функции α-glycosidase и накоплению гликогена.

Многие признаки, связанные с устранением calreticulin, следуют разными курсами в предсердиях и желудочках. Соотв. кардиомиоциты возникают из самостоятельных клонов кардиальных миоцитов и экспрессируют разные субнаборы генов контрактильных белков [63-65]. Т.о., отсутствие calreticulin может иметь как разные, так и общие эффекты на эти кардиальные фенотипы. Пока неясно, почему дефекты в calreticulin-дефицитных миофибриллах ассоциированы с прямым эффектом calreticulin на структуру собственно кардиальных миофибрилл, возможно calreticulin затрагивает адгезивные белки и тем самым вызывает структурные изменения миофибрилл. В самом деле, calreticulin KO фенотип обнаруживает сходство с др. мутациями, устраняющими клеточные адгезивные белки [66-70], но особенно с фенотипами, вызываемыми подавлением N-cadherin [27,29,33,41,71]. Мы полагаем, что морфологические изменения, ассоцированные с отсутствием calreticulin в сердце могут быть обусловлены дефектом развития контрактильного аппарата и/или дефектом развития клеточной адгезии кардиомиоцитов.