Исследователи использовали in vivo bioprobe imaging technology для изучения эндогенной активности малой GTPase CDC42 у эмбрионов Drosophila melanogaster . Неожиданно, хотя CDC42 экспрессируется повсеместно, её активность ограничена во время развития. Изучение показало, что паттерн активации молекул скорее, чем патерн экспрессии, предоставляет важную информацию о их функциях in vivo.

После активации CDC42 обратимо соединяется со специфическим пептидом, наз. CDC42-binding domain (CBD). Авт. использовали эти преимущества и генерировали активационный биозонд (A probe), который состоит из CDC42 и CBD, и дает в результате флюоресцентный сигнал, который обнаружим с помощью fluorescent resonance energy transfer только когда CDC42 активен. Хотя CDC42 экспрессируется повсеместно, он неактивен в течение большого (~65%) периода эмбриогенеза - вплоть до эмбриональной ст. 16, когда он активируется в клетках дорсальной срединной линии, в трахеях и ЦНС. Эти результаты объясняют предыдущие находки, показавшие, что хотя истощение CDC42 вызывает эмбриональную гибель, мутантные мухи не имеют онтогенетических дефектов в течение большей части эмбриогенеза.

С помощью экспрессии A probe в anterior corner cell (aCC) motorneuron - одни из первых нейронов в ЦНС, обладающие сложной клеточной морфологией - авт. нашли, что активация CDC42 совпадает с началом дендритогенеза и пространственно ограничена клеточным компартментом, из которого формируются дендриты. Избыточная экспрессия конституитивно активной формы CDC42 в aCC двигательных нейронах вызывает аномалии, которые широко варьируют и, напр., приводят к преждевременному окончанию роста конусов аксонов. Точный пространственно-временной контроль активности CDC42 является критическим для нейрогенеза.

Подавляющее большинство сигналов от других клеток нейроны получают на обильно разветвленные отростки, называемые дендритами. Паттерн дендритного ветвления весьма существенен для функции нейронов и служит основой для классификации типов нервных клеток (1, 2). К примеру, распространение дендритов в определенные области нервной системы способствует селекции связанных друг с другом партнеров и, следовательно, определяет типы полученных сигналов. Путь их интеграции определяется геометрией дендритных деревьев и их электрическими свойствами (3). Имеется множество доказательств того, что развитие дендритов определяется комбинацией внутри- и внеклеточных факторов (cell-intrinsic и cell-extrinsic) (4). Ранее полагали, что intrinsic коды и каскады транскрипционных регуляторов отвечают за детерминацию большинства специфических признаков клеточных типов (5). Однако почти неизученным остается вопрос о том, как транскрипционные коды (транскрипционный код) воздействуют на цитоскелет и образуют специфические паттерны дендритного роста и ветвления. Авторы попытались проанализировать данные последних лет о процессах детерминации и регуляции специфических признаков дендритов во время развития нервной системы.

Архитектура дендритных деревьев является результатом особого паттерна роста, ретракции и ветвления (6-9). Процесс дендритного морфогенеза регулируется многими факторами – во-первых, числом (первичных) ветвей, инициируемых и поддерживаемых в каком-нибудь определенном направлении. Во-вторых, способом ветвления (т.е. расщеплением кончика или промежуточным ветвлением). В-третьих – частотой ветвления. И, в четвертых – балансом между ростом, стабилизацией и ретракцией дендритных отростков. Все эти процессы являются функциями дендритного цитоскелета и прежде всего нужнопонять как они модулируются транскрипционными кодами, детерминирующими разнообразие типов нейронов. Генами эффекторами могут, вероятно, быть: регуляторы актина и динамики микротрубочек, молекулы ассоциированного с клеточной мембраной рецептора и молекулы адгезии, протеиновые комплексы, регулирующие субклеточную локализацию и превращение рецепторных молекул и молекул адгезии и внутриклеточные сигнальные механизмы трансдукции, которые связывают внеклеточные сигналы с дендритным цитоскелетом. Через ансамбль таких генов транскрипционные коды детерминируют компетентность клеток при получении внешних специфических факторов – таких как факторы роста, диффузные и ассоциированные с мембраной сигналы (ориентиры) – а также природу их ответа на эти факторы. Синаптические сигналы, особенно сигналы нейрональной активности и сигналы ассоциированного кальциевого притока, также являются важными внешними ориентирами (сигналами). Их роль в регуляции развития дендритов недавно активно обсуждалась (10-13) и не является предметом обсуждения в данном обзоре.

From transcriptional cell-type specification programs to dendritic diversity

Каким образом клеточные программы спецификации детерминируют различия клеточных типов по их дендритной архитектуре? Эта проблема почти не изучена, хотя недавние исследования периферической нервной системы Drosophila несколько улучшили понимание механизмов, лежащих в основе этого процесса (14, 15).

Specification of primary branch number

Периферическая нервная система дрозофилы состоит из нескольких типов клеток с морфологически отличимым паттерном арборизации (ветвления) дендритов (16). Самым ранним решением при образовании дендритного древа является выбор того, будет ли эта клетка иметь один простой дендрит или сложные ветвящиеся дендриты. Этот выбор опосредуется экспрессией мульти-доменного zinc finger protein Hamlet (17). Кроме такой селективной функции Hamlet продолжает экспрессироваться во время ранней фазы дендритного роста, а его misexpression в постмитотических нейронах достаточно для спецификации простых дендритных структур благодаря подавлению обильного дендритного ветвления (17). Однако механизм такого опосредования остается пока плохо изученным.

Complexity of the dendritic skeleton and mode of branching

Кроме структурно сложной «дендритной арборизацией» нейронов, дендритное разнообразие регулируется, по меньшей мере, двумя дополнительными транскрипционными факторами - Abrupt и Cut (18, 19). Группа нейронов с дендритной арборизацией имеет четыре подгруппы – от I до IV (20). Класс I нейронов имеет дендриты с относительно простой и неветвящейся, хотя и особой, похожей на гребень, архитектурой – первичный дендрит имеет вторичные коллатерали, идущие параллельно друг другу (17, 19). Следует отметить, что BTB-Zinc finger белок Abrupt избирательно экспрессируется в классе I нейронов. Эксперименты с целенаправленным действием на loss-of-function и mis-expression показали, что экспрессия Abrupt необходима и достаточна для обеспечения дендрито-арборизованных нейронов class-I простым, гребнеподобным паттерном дендритного ветвления (17, 19).

Transcriptional regulators of terminal branch complexity

В соответствии с паттерном экспрессии Abrupt нейроны усложняли свою дендритную структуру и нейроны с сильно ветвящимися дендритами (классы II-IV) уже экспрессируют гомеодоменный фактор Cut [18,20]. Уровни экспрессии Cut различны для этих трех подклассов, они коррелируют характерные паттерны терминального ветвления и регулируют их (18). Например, высокие уровни Cut необходимы и достаточны для формирования неразветвленных терминальных «дендритных шипиков», которые характерны для нейронов класса III с дендритной арборизацией (18).

Abrupt и Cut управляют дополнительными программами дифференцировки дендритов, они не пересекаются друг с другом и их функции различны. Abrupt регулирует сложный паттерн дендритного ветвления путем ограничения дендритного роста, размера поля и ветвления первичного дендритного скелета. Он также детерминирует способ ветвления для образования гребнеподобной (класс-I) архитектуры нейронов. Как оказалось, Cut экспрессия оказывает небольшое влияние на спецификацию первичного дендритного скелета. Напротив, он регулирует морфологию дендритов в различных точках, способствуя и регулируя рост и ветвление высокоупорядоченных терминалей (18, 19). Очевидно, что Abrupt и Cut опосредуют свои эффекты через набор нижестоящих (downstream) генов, модулирующих дендритный цитоскелет самыми разными способами, влияющими на образование дендритных ветвей в разное время (primary/lower или terminal/higher-order branching) и в разном месте (co-lateral branching for class I versus end-splitting for class IV [7]). Если удастся идентифицировать эти гены, то появится возможность установить генетические и молекулярные связи между транскрипционными кодами, лежащими в основе спецификации и морфологического разнообразия клеток.

Regulation of dendritic growth and branching by intrinsic factors

Гены, определяющие специфический клеточный паттерн дендритного роста и ветвления, могут контролировать либо границы, в пределах которых развиваются дендритные деревья, либо точки, в направлении которых растут эти деревья. Как это осуществляется – пока неясно. Возможно, что здесь задействованы специфические для этих клеток процессы или модулируются общие механизмы роста и ветвления. Кандидатными эффекторными генами могут быть гены, ограничивающие рост дендритов и сверхэкспрессию ( sequoia [21], flamingo [22], heron, kali [23], tropomyosin II [24], RhoA [25,26]) или способствующие разрастанию дендритов ( asm1 [27], EphB2 [28_], roadblock [23], Lis1 [29], dCul3 [30]).

Timing of outgrowth and modulation of dendritic stability

Рост дендритов может регулироваться модуляцией скорости распространения ветвей, стабильности и ретракции или модуляцией времени начального роста. Недавно идентифицировано некоторые модуляторы роста дендритов, но их действие пока не изучено. Например, seven-pass transmembrane cadherin Flamingo/Starry Night нужен для сенсорных нейронов в дорсальной срединной линии для подавления преждевременного роста дендритов в направлении к- и через границу срединной линии (23, 31). Каким образом Flamingo регулирует время и протяженность разрастания дендритов? Фенотип быстрого роста, сходный наблюдаемым в сенсорных нейронах мутантов Flamingo, также возникает в результате мутаций в Tropomyosin II – актин-связывающего белка, способного прямо регулировать динамику актиновых филаментов, контролируя доступ других актин-связывающих белков (32) или стабилизируя актиновые филаменты (33, обзор 34). Исследования по генетическому взаимодействию дали возможность предположить, что Flamingo может определять протяженность дендритного роста и, возможно, время инициации, регулируя динамику цитоскелета, по крайней мере, отчасти через Tropomysoin II [24].

В отличие от преждевременного роста дендритов и «избыточности» фенотипа при Flamingo/Starry Night нокдауне в периферических нейронах дрозофилы нокдаун Celsr2 (гомолог Flamingo/Starry Night у млекопитающих) - усиливает нестабильность и ретракцию в центральных пирамидных нейронах и клетках Пуркинье, приводя к упрощению дендритного ветвления (35). Структурно-функциональный анализ Celsr2M указывает на две области белка необходимые для регуляции дендритного роста – cadherin (кадхериновые) повторы и карбоксильный внутриклеточный участок (35).

Диаметрально противоположные фенотипы в периферической нервной системе насекомых и в центральных нейронах млекопитающих могут указывать на то, что насекомые и млекопитающие используют разные пути сигнальной трансдукции, стоящие ниже (downstream) Flamingo и Celsr2. И, напротив, такие эффекты у тех и у других могут быть результатом дестабилизации дендритных структур в отсутствие Flamingo/ Celsr2-опосредованного межклеточного взаимодействия, ведя к преждевременному и обильному росту у одних и нестабильности и ретракции ветвления у других. Другой молекулой, участвующий в стабилизации дендритных ветвей в нейронах гиппокампа, является Dasm1 (dendrite arborization and synapse maturation 1), член иммуноглобулинового суперсемейства (27). Утрата цитоплазматического «хвоста» продуцирует доминантно-негативный фенотип, подтверждая тем самым, что этот домен может трансдуцировать поверхностно-клеточные взаимодействия в цитоскелет (27). Однако на сегодняшний день наши познания о том, каким образом сигналы, полученные Flamingo, Celsr2 и Dasm1 перенаправляются в цитоскелет дендритов скудны. Неясно также, как эти сигналы или нижестоящие эффекторы осуществляют и в какой степени оперируют через Rho семейство небольших GTPases, являющихся ключевыми интеграторами средовых сигналов (ориентиров) (36). Предстоит также выяснить, представляют ли Flamingo, Celsr2 и Dasm1 общие или специфические для определенных типов клеток регуляторы дендритного роста и ветвления.

Localization of receptor proteins

Паттерн дендритной арборизации в значительной степени определяется локализацией и активностью рецепторов и ассоциированных с цитоскелетом белков. Например, мутации в моторных белках ( CHO1/MKLP1, Lis1, dynein heavy и light chain/Roadblock), которые перемещают cargo белки в развивающиеся дендритное древо, ассоциируются с аберрациями в развитии дендритов (23, 29, 37). Недавнее исследование Hoogenraad с соавт. показало наличие когерентной связи между дендритной локализацией поверхностно-клеточных рецепторов EphB типа, моторным белком KIF5 микротрубочек и ростом дендритов (28). EphB рецепторы (особенно из внеклеточной области) необходимы для морфогенеза дендритов. EphB связывается адаптерным белком GRIP1, который, в свою очередь, рекрутирует KIF5 моторный белок для транспорта в дендриты (28).

Дифференциальная субклеточная локализация рецепторных белков или нижестоящих компонентов сигнальной трансдукции может способствовать компартментализации и, следовательно, диверсификации дендритных деревьев. К примеру, базальные и апикальные дендриты пирамидных нейронов осуществляют разные функции и по разному реагируют на нейротрофины (38). Ориентированный рост апикальных дендритов по отношению к pial поверхности опосредуется селективной апикальной локализацией нижестоящих сигнальных компонентов, растворимой guanylate cyclase, которая придает аттрактивную реакцию сигналу управления Semaphorin 3A [39].

Dendritic localization of mRNAs and local regulation of translation

Считали, что локальный контроль белкового синтеза наиболее важен для способности дендритных деревьев регулировать отдельные синаптические связи, модулируя морфологию и электрические свойства дендритных ветвей и шипиков в ответ на синаптические связи (40). Этот аспект регуляции, который критичен для передачи сигналов нейронами и для пластичности, зависит от локализации mRNAs в дендритах и постсинаптических участках и от контроля их трансляции путем дерепрессии. Не так давно была установлена когерентная молекулярная связь между гомологом белка Fragile X mental retardation (FMR1) дрозофилы (регулятором трансляции) и нейрональным цитоскелетом. dFMR1 ограничивает высокоупорядоченное и аксональное коллатеральное ветвление, подавляя трансляцию mRNAs, кодирующую RhoGTPase Rac1 и Profilin [41,42,43] – регуляторы динамики филаментов актина (44). Rac1 может также функционировать как часть регуляторного feedback loop (обратного цикла), в котором он независимо активирует dFMR1 путем негативного модулирования активности dFMR1 супрессора CYFIP [45]. Модулирование цитоскелета микротрубочек посредством dFMR1 через репрессию MAP1B/Futsch трансляции было показано в работе (46). Кроме регуляции морфологии нейронов, dFMR может также регулировать электрические свойства нейронов посредством контроля уровня экспрессии Pickpocket1, degenerin и члена семейства epithelial sodium channel (47).

Ye с соавт. недавно идентифицировали еще одну группу РНК связывающих белков – Nanos и Pumilio, который формируют трансляционный репрессорный комплекс (translational repressor complex) – регуляторов высокоупорядоченного ветвления в двух подклассах (III и IV) арборизированных нейронов у дрозофилы (48). Изучение нейронов у дрозофилы подтвердило, что Nanos и Pumilio, подобно dFMR1 могут дополнительно модулировать нейрональную возбудимость, регулируя voltage-gated sodium channel protein Paralytic [49]. Однако гены и механизмы, посредством которых Nanos и Pumilio осуществляют свое действие на морфогенез дендритов, остаются невыясненными. Более того, было бы крайне важно установить, в какой степени FMR1 и Nanos/Pumilio translational repressor complexes регулирует отдельные аспекты нейронального развития и какие сигналы модулируют их активность.

Control of growth and branching by extrinsic factors

Было идентифицировано множество секретируемых сигнальных молекул, регулирующих развитие дендритов. Это нейротрофины, костные морфогенетические белки, ингибиторные факторы лейкемии, interferon-g и B-type эфрины, являющиеся регуляторами роста и ветвления (обзор 50). А также Semaphorins - Slit и Netrins – которые, как было установлено, опосредуют направление роста дендритов через направленный рост (directional growth) [39,51,53]. Однако для подавляющего большинства этих внешних ориентиров (сигналов) наши знания о механизмах? посредством которых они осуществляют свои эффекты на морфологию дендритов, пока фрагментарны. Недавно группа, возглавляемая Salinas, добавила к списку внешних регуляторов развития дендритов Wnt-7b и установила его молекулярную связь с цитоскелетом (54). Wnt белки участвуют в управлении аксонами, аксональном ремоделировании и формировании синапсов (обзоры 55. 56). Rosso с соавт. показал, что обработка культивируемых нейронов гиппокампа Wnt-7b, который в норме экспрессируется в гиппокампе мыши, увеличивает длину дендритов и их ветвление (54). Каким образом внеклеточный сигнал Wnt модулирует развитие дендритов? Оказалось, что Wnt сигнал трансдуцируется в скаффолдный (scaffold) белок Dishevelled, который ко-локализуется с актином и влияет на ростовые конусы дендритов. Dishevelled, в свою очередь, формирует комплексы с цитоскелетным регулятором Rac (но не с Rho!) и передает сигнал через нестандартный путь в Junterminal kinase (JNK), чьими мишенями являются microtubule associated proteins (т.е. MAP1b и MAP2) [57] и транскрипционный факторы (т.е. AP-1) [57,58].

Таким образом, Wnt сигнал, трансдуцируемый через Dishevelled, может не только приводить к локальному, но и через JNK-опосредованный транскрипционный ответ и к глобальному модулированию дендритного цитоскелета.

Specification and regulation of dendritic territories

Важным аспектом функции нейронов является детерминация территорий, через которые происходит ветвление дендритов. На периферии размер дендритного поля определяет область или рецептивное поле, из которого получены сигналы. (inputs). В центральной нервной системе позиционирование дендритов в определенные территории способствует спецификации их inputs. Для многих типов клеток территории дендритов не только детерминируются внутренним потенциалом дендритного роста и позиционирования, но и соседними клетками через dendro–dendritic и dendro–axonal взаимодействия (59). Например, в зрительной системе млекопитающих дендриты каждого ганглионарного клеточного типа сетчатки иннервируют («tile») всю сетчатку, но без избыточности. Таким способом перекрывание дендритов встречается исключительно между деревьями разных ганглионарных классов клеток (обзор 60).

Regulation of dendritic field size in sensory systems

Такой ‘tiling’ обнаружен во многих сенсорных системах, обеспечивающий их полный, но не чрезмерный охват рецептивного пространства (7, 20, 60). До недавнего времени считали, что размер дендритного поля и межклеточного пространства регулируются репульсивными взаимодействиями между дендритами одного и того же типа. Это положение сейчас пересмотрено после изящных экспериментов Lin с соавт., исследовавшими мутации Brn3b и Math5 мышей, у которых истощена популяция ганглионарных клеток сетчатки (61). В сетчатке Brn3b- и Math5 мутантных мышей пространство между оставшимися ганглионарными клетками было таковым, что гомотипические контакты отсутствовали. К удивлению авторов, средний размер дендритных полей двух протестированных ганглионарных клеточных типов сетчатки оставался нормальным, сохранялось и регулярное межклеточное пространство (61). Это свидетельствует о том, что размер дендритного поля может, по крайней мере в этом случае, быть детерминирован преимущественно внутренними программами дифференцировки. Тем не менее, гомотипические репульсивные взаимодействия участвуют в процессе дендритного tiling во многих сенсорных системах, хотя в некоторых из них они могут потребоваться для fine-tuning («отделки») размера дендритных полей и миниминизации перекрытий. Что лежит в основе этого механизма? Недавние исследования у мух и червей показали наличие первых двух эволюционно консервативных белков, участвующих в регуляции дендритного «тэйлинга», роста и ветвления – Tricornered (Trc)/Sax-1 (serine/threonine kinase) и Furry (Fry)/Sax-2 (крупный белок необходимый для Trc/Sax-1 activation) [62,63]. В арборизированных нейронах личинки мутанта дрозофилы по одному из этих генов ветвление дендритов увеличено как по числу ветвей, так и по их протяженности. Кроме того, мутантные нейроны имеют аберрантный «тэйлинг» в виде неправильного перекрытия терминальных ветвей (62). Используя множественные мутантные аллели и мозаичный анализ Emoto с соавт. показали, что Trc и Fry действуют автономно (cellautonomously) в нейронах и что процессы, регулирующие ветвление и тэйлинг, могут быть разделены. Более того, это исследование выявило потенциальные даунстримные (downstream) эффекторы и показало, что Trc и Fry могут контролировать ветвление, но не тэйлинг посредством регуляции передачи сигналов членом семейства Rac - RhoGTPase (62). У червей мутации, гомологичные Trc и Fry – Sax-1 и Sax-2, дендритный тэйлинг двух механосенсорных нейронов - ALM и PLM, также аберрантен [63]. Однако здесь оказалось, что дендритное перекрытие определялось регуляцией протяженности ветвления, а не тэйлингом, опосредованным через гетеронейрональное отторжение.

Сигналы, опосредующие изо- и гетеронейрональное отторжение, остаются пока неидентифицированными, хотя не исключается, что они включают ассоциированные поверхностно-клеточные или диффундируеммые факторы, действующими короткое время. Потенциальным геном-кандидатом может быть Drosophila Down syndrome cell adhesion molecule (Dscam), продуцирующий множество изоформ, многие из которых оказывают влияние на дендриты. (64, 65). Нейроны, очевидно, экспрессируют уникальные комбинации Dscam изоформ (66). Предполагают, что изоформ-специфическое гомофильное связывание участвует в «изонейральных» (т.е. распознающим самого себя) и гетеронейральных взаимодействиях (67, 68).

Refinement of dendritic fields by dendro–dendritic interactions

В центральной нервной системе совершенствование дендритных ветвлений в особых территориях способствует спецификации дендритного таргетирования и входов (сигналов). Ранее Komiyama с соавт. показали, что в зрительной системе дрозофилы два транскрипционных регулятора Acj6 (abnormal chemosensory jump response 6) и Drifter необходимы и достаточны для спецификации типов дендритов проекционных нейронов в отдельных гломерулах (69). Хотя эффекторные белки Acj6 и Drifter плохо изучены, недавние исследования лаборатории Luo and Zipursky идентифицировали классический cadherin – N-Cadherin – необходимый для разделения дендритов проекционных нейронов на единичные зрительные гломерулы (70, 71). Однако роль N-cadherin в этом процессе отличается от инструктивных ролей других ранее идентифицированных сигналов, таких как Semaphorin 3A/Neuropilin-1 [39,72], Slit/Robo [51–53] и Netrin/Frazzled [53]. N-cadherin играет, скорее, «разрешительную», а не «управляющую» роль, опосредуя потенциально адгезивные дендро-дендритные взаимодействия между проекционными нейронами с тем, чтобы ограничить их дендритное ветвление к одной гломеруле (71). Способность к регулированию территорий дендритной организации в ответ на сигналы, полученные от соседних клеток важна для функций нервной системы, хотя является существенной только для особых программ спецификации нейронов (73). Хотя первые гены, опосредующие «тэйлинг» и дендро-дендритные взаимодействия были идентифицированы, природа и идентичность лежащих в их основе сигналов, их рецепторы и механизмы внутриклеточной трансдукции остаются предметом исследования.

Conclusions

Исследования в области роста и развития дендритов выявили некоторые механизмы, посредством которых программы спецификации клеточных типов генерируют самую разнообразную геометрию дендритов. Специфическая архитектура дендритов достигается регуляцией паттерна роста и способа ветвления в определенное время периода развития дендритов (т.е. во время первичного или терминального рождения дендритов) и вариациями локализации в появляющихся деревьях (т.е. в различных компартментах дендритов). Для изучения этой проблемы сенсорные системы Drosophila и C. Elegans оказались удобными модельными генетическими системами. Однако преимущество простой, почти плоской организации дендритов сенсорных нейронов, может ограничивать их использование в качестве моделей для понимания того, как дендриты ЦНС осуществляют навигацию через сложное окружение в развивающейся нервной системы. Вероятно, что «прокладка» функциональных нейрональных путей в ЦНС требует разных регуляторных механизмов, которые объединяют рост и ветвление дендритов в трех измерениях с распознаванием синаптических партнеров для того чтобы выработать распределение синаптических контактов и дендритной геометрии с соответствующими свойствами (3, 8). Некоторые модельные системы у позвоночных и беспозвоночных животных успешно используются для решения многих вопросов в этой области. На этих системах выявлены механизмы, посредством которых синаптическая активность и связанная с ней передача кальциевых сигналов регулируют развитие дендритов (10-13). Однако для понимания того, какие механизмы способствуют воспроизводимости специфической для определенных типов клеток дендритной архитектуры, требует дальнейших исследований. Последние методы, с помощью которых можно реконструировать сложные деревья нейронов и анализировать распределение флуоресцентно меченых белков, будут незаменимы в этих исследованиях (74, 75). Недавно в Curr Biol (2005) опубликован прекрасный обзор Grueber et al. [76] о развитии дендритов у насекомых.

Литература