Caenorhabditis elegans свободно живущая нематода, которая обнаруживается в почве всех уголков Земли. Т.к. взрослые животные достигают около 1 мм в длину, то это самое маленькое животное, представляющее собой исключительную модельную систему для биомедицинских исследований. C. elegans осуществляет очень простой жизненный цикл, который длится приблизительно 96 ч от оплодотворения до взрослой стадии. Гермафродиты способны к само-размножению; поэтому они представляют клон самого себя, создавая тем самым изогенную генетическую популяцию. Они могут расти в жидкой среде, содержащей бактерии, которыми они питаются, что позволяет культивировать их на стандартных 96-well пластинках, делая их пригодными для высокопродуктивных стратегий. Животные могут размножаться, поддерживаться и анализироваться с использованием доступных коммерческих работающих с жидкостями роботов. Все эти признаки являются важными автоматизации, что и позволяет быстрый успешный по всему геному скрининг.

В последние годы RNA-mediated interference (RNAi) стало одним из наиболее мощных инструментов изучения функции генов у metazoans. У C. elegans, феномен RNAi впервые был обнаружен Guo and Kemphues (1), когда они установили, что инъекции как смысловых, таки антисмысловых РНК, специфичных для гена par-1 вызывают эмбриональный летальный фенотип у потомства инъецированных животных. Тот факт, что смысловые и антисмысловые РНК оказывают один и тот же эффект указывает на то, что наблюдаемый фенотип возникает в результате механизма, который отличается от типичного ингибирования трансляции, вызываемого воздействием антисмысловой РНК. Важный успех в понимании молекулярной основы этого эффекта был сделан, когда Fire et al. (2) установили, что double-stranded RNA (dsRNA)действует как потенциальный триггер. trigger. Они продемонстрировали, что высвобождение довольно небольшого количества молекул dsRNA на клетку достаточно, чтобы вызвать реакцию, вызывая временное функциональное нарушение интересующего гена.

В дальнейшем было установлено, что RNAi высоко законсервирована среди множества эукариотических организмов, включая и человека [rev. (3-5)]. У всех изученных видов прерывание активности гена происходило, когда рибонуклеопротеиновый комплекс, содержащий малую ингибирующую РНК (siRNA) специфически доставляется в область мРНК, которая комплементарна siRNA и запускает её расщепление. Этот законсервированный механизм может возникать как защита против инвазивных вирусов, которые часто обладают РНК геномом, или чтобы воспрепятствовать перемещениям транспозонов в геноме. Генерируемые молекулы siRNA гарантируют сиквенс-специфичность механизма и тем самым делают RNAi мощным инструментом для изучения функции генов или, in vivo или в культуре ткани. Методы доставки siRNA в клетках млекопитающих варьируют и даже могут использовать вирусы, которые экспрессируют малые dsRNA молекулы, которые могут эффективно превращаться в siRNAs с помощью эндогенных клеточных RNAi компонентов.

У C. elegans, крупно масштабные нарушения функции генов с помощью RNAi могут быть достигнуты, по крайней мере, тремя способами доставки dsRNA: инъекциями, погружением в жидкость или с питанием. Инъекция dsRNA непосредственно животным наиболее пригодный метод для получения RNAi реакции (2, 6). Однако, это связано с манипуляциями с отдельными животными и , следовательно, не очень пригоден для анализа всего генома. Смачивание животных раствором, содержащим dsRNA является достаточно мощным и может быть легко использован в крупно масштабных подходах (9, 10). Наконец, кормление не является мощным методом, но может эффективно и мало-затратно использоваться в крупно масштабных подходах (11-14). Он вызывает индукцию экспрессии dsRNA у бактерий, которые затем используются в качестве источника пищи для растущих животных. RNAi реакция у C. elegans является системной по природе и , следовательно, небольшие количества dsRNA могут вызывать реакцию RNAi в большинстве, если не во всех клетках организма (7). Т.к. коллекция бактериальных линий доступна, причем каждая линия экспрессирует уникальные dsRNA молекулы, соответствующие примерно 84% генома C. elegans (15), то кормление становится широко используемым методом для высокопроизводительного по всему геному RNAi скрининга у C. elegans.

В недавние годы, RNAi использовалась для функционального аннотирования генома C. elegans с помощью систематического нарушения функции генов и определения возникающего в результате фенотипа. Такая облегченная характеристика и фенотипическая классификация некоторых генов у C. elegans и сделала возможной широкое описание клеточной физиологии у многоклеточного организма. Т.к. более 60% генов C. elegans законсервировано у млекопитающих, включая и человека, то эта информация может быть использована как точка старта для понимания сложности генетических и фенотипических взаимодействий в ходе развития metazoans. В свою очередь эта информация также может быть использована для улучшения нашего понимания роли различных генов, ассоциированных с болезнями людей.

Развитие ранних эмбрионов C. elegans изучалось экстенсивно с помощью традиционного генетического скрининга с использованием мутагенезированных больших популяций животных и отбора интересующих фенотипов. Хотя мутанты, полученные в этих скринингах предоставили множество информации о различных аспектах эмбрионального развития C. elegans, но при этом имеются определенные важные ограничения: материнские фенотипы генов, которые дают зиготический летальный фенотип, будучи мутироваными не могут быть изучены. При RNAi подходе, dsRNA доставляется во взрослые животные, у которых соматическое развитие в основном завершено и , следовательно, эмбриональные фенотипы могут наблюдаться для генов, которые будут по всему давать зиготический летальный фенотип или арестовывать развитие личинок. Более того, хотя фенотипы и могут быть детерминированы в течение всего жизненного цикла животного, некоторые типы клеток устойчивы к нарушению с помощью RNAi (напр., нейроны) и поэтому анализ функции генов в этих типах клеток труден. Тот факт, что зародышевая линия C. elegans чувствительна к RNAi облегчает целенаправленный поиск многих материнских генов и характеристику тех из них, которые специфически вовлекаются в функцию зародышевой линии и эмбриогенез.

C. elegans следует стереотипическому паттерну раннего эмбриогенеза (16, 17) (Fig. 1). После оплодотворения эмбрион проходит свой мейотический клеточный цикл и отторгает два полярных тельца, которые соответствуют материнским мейотическим остаткам. Ассоциированные со спермием центросомы затем запускают цитоплазматические токи, процесс внутриклеточной подвижности, который заключается в актин-зависимых кортикальных перестройках зиготы. Во время цитоплазматических токов устанавливается полярность клетки м мужской и женский пронуклеусы движутся навстречу др. др. и встречаются вблизи задней части эмбриона. После встречи пронуклеусы движутся вместе, чтобы оказаться в центре зиготы. В центре формируется веретено и происходит смещение в направлении кзади во время метафазы и анафазы в результате чего две дочерние клетки оказывася разных размеров и с разной судьбой после цитокинеза. Крупная передняя клетки дает большую часть эктодермы и некоторую часть мезодермы,

Fig. 1. Early embryogenesis in C. elegans. The embryo was imaged by differential interference contrast microscopy. Time after initiation of cytoplasmic flows (in minutes) is shown at the bottom right corner. In each frame, anterior is to the left and the length of the embryo is approximately 50 mm. See main text for more details.

тогда как маленькая задняя клетка является предшественницей всей энтодермы и зародышевой линии. Такая асимметрия зависит от сегрегации ряда детерминантов клеточной судьбы вдоль передне-задней оси зиготы.

Некоторые скрининги для генов, которые затрагивают эти ранние процессы у C. elegans были проведены с использованием инъекций, смачиваний и скармливания dsRNA и оценки конечного фенотипа у потомства (6,9,11,15,18-22). Эти скрининги продемонстрировали, что большинство генов у C. elegans не существенны для эмбриогенеза и лишь приблизительно 6% исследованных генов давали эмбрионов, не способных к вылуплению. Богатая фенотипическая информация была получена путем генерации time-lapse картин раннего развития RNAi-обработанных эмбрионов (6,18,19,21,22). Это позволило произвести тонкое вычленение различных процессов, которые имеют место, когда клетка делится асимметрично, а также классификации многих генных продуктов, которые участвуют в общих клеточных процессах. Информация, полученная в этих работах, показала, что ранние эмбрионы C. elegans являются одной из наиболее мощных генетических систем для изучения широкого спектра клеточных функций.

Большая часть этой информации может быть использована во вторичных целенаправленных скринингах. Напр., Srayko et al. (23) используя трансгенную линию, экспрессирующую микротрубочки связывающий белок EB1, слитый с GFP для изучения роста микротрубочек и их зарождения (nucleation) у эмбрионов, нарушали различные гены, участвующие в процессах, связанных с микротрубочками. Эта работа выявила участие нескольких белков, связывающих микротрубочки. в регуляции динамики микротрубочек in vivo.Сходным образом работы идут работы с использованием комбинаций данных о межбелковых взаимодействиях, локализации белка и функционального анализа для вычленения процессов функции кинетохор (24, 25), а также удвоения центросом (26-30). Т.к. функции кинетохор и центросом в основном законсервированы, то эти работы предоставляют критические данные для понимания того, как эукариотические клетки делятся и поддерживают свою характерную, определенную клеточную архитектуру. Более того, т.к. неправильная регуляция кинетохор или центросом является общей в трансформированных клетках, то эта работа несомненно углуби наше понимание физиологии раковых клеток.

Большинство важных генов, идентифицированных при таком геномном скрининге, законсервированы и у др. видов и некоторые из них имеют гомологов, участвующих в возникновении болезней у человека. Напр., C. elegans ген lis-1 гомолог человеческого гена, названного LIS-1 (31). Пациенты, несущие мутантный аллель LIS-1 страдают lissencephaly, врожденным заболеванием, характеризующимся отсутствием извилин на поверхности головного мозга [rev. (32-34)]. LIS-1 кодирует связывающий микротрубочки белок, который взаимодействует с микротубулярным мотором dynein и регулирует клеточные деления и миграцию нейронов (35-38). У эмбрионов C. elegans дисрегуляция lis-1 приводит к дефектам организации микротрубочек, фенотипу, напоминающему дефекты активности dynein (6, 31, 39). Как результат миграция пронуклеусов не происходит у lis-1 (RNAi) эмбрионов и формируются дефектные веретена в задней части клетки, в результате возникают нарушения цитокинеза. LIS-1 и гомолог тяжелой цепи dynein DHC-1 , каждый влияет на клеточную локализацию др., но не абсолютно необходим для локализации др. в некоторых определенных компартментах, таких как кинетохоры (39). Эта работа демонстрирует взаимоотношения между LIS-1 белком и Dynein для процессов, зависящих от микротрубочек.

Сходным образом ген C. elegans par-4 кодирует гомолога Ser/Thr protein kinase для человеческого белка опухолевого супрессора LKB1 (40). Пациенты с мутациями в LKB1 страдают синдромом Peutz-Jeghers, болезнью, характеризующейся предрасположенностью к туморогенезу в разных органах (41, 42). Эмбрионы C. elegans, мутантные по par-4/LKB1 обнаруживают дефекты клеточной полярности и неспособны вылупляться (40, 43), демонстрируя тем самым роль LKB1 в поляризации клеток. Недавние результаты показали, что экспрессия LKB1-связывающего белка STRAD в линиях раковых клетках эпителия кишечника вызывает транслокацию LKB1 из ядра в цитоплазму и этого достаточно для полного восстановления полярности в индивидуальных раковых клетках (44, 45). Все эти крупно масштабные RNAi скрининги эмбрионов предоставляют сами по себе эффективную первую ступень описания функций многих генов, которые потенциально участвуют в различных болезнях человека.

Интересно отметить, что большинство генов у C. elegans не дают очевидного фенотипа в ответ на нарушение с помощью RNAi (15, 21). Сходные наблюдения были сделаны у дрожжей S. cerevisiae, где более 80% генов безразличны для роста, если нарушены (46). Это указывает на то. что многие гены или молекулярные пути могут иметь определенную степень перекрывания (redundancy) у каждого из этих двух видов. У S. cerevisiae, степень подобного перекрывания подробно исследовалась в системных скринингах с целью открытия комбинаций генов, которые дают жизнеспособные фенотипы, если мутируют по отдельности, но дают повреждающие фенотипы если мутируют вместе в одной и той же клетке (47, 48). Так наз. synthetic lethal подход представляет собой мощный инструмент для выявление и характеристики генетических путей у разных модельных организмов, включая дрожжи, червей и мух. RNAi инструменты пригодные сегодня у C. elegans позволяют проводить скрининги синтетических леталей по всему геному. Напр., жизнеспособным мутантным животным по любому данному гену можно скармливать индивидуальные бактериальные клоны из доступных коллекций, каждый экспрессирующий dsRNA, чтобы предсказать ген в геноме C. elegans (15). Возникающее в результате потомство этих RNAi-обработанных животных может быть затем проверено в отношении жизнеспособности. Такой подход был успешно использован для идентификации генов, которые функционируют на пути реакции на повреждения ДНК у C. elegans (49) и может в принципе использоваться для выявления перекрывания (redundancies ) и картирования генетических путей, которые функционируют во время развития C. elegans. Этот подход открывает потрясающие возможности в клинических терминах, из-за своего диагностического значения и его использования для разработки режимов эффективного лечения разных заболеваний. Рак, как известно, возникает в результате комбинаций мутаций определенных генов, таких как опухолевые супрессоры. Обнаружение генов, которые являются синтетическими леталями с данным опухолевым супрессором может быть использовано, чтобы специфически находить раковые клетки, в которых этот ген опухолевого супрессора мутантен. Сходным образом, гены синтетически летальные с опухолевыми супрессорами и чьи белковые продукты обладают биологической активностью, могут быть потенциальными мишенями для лекарств в крупно масштабных скринингах малых молекул, которые могут быть биологически активны против этих генных продуктов.

В ходе эмбриогенеза C. elegans подвергаются определенному количеству клеточных делений и клеточных смертей, чтобы создать в конечном итоге 959 соматических клеток, которые составляют взрослый гермафродит. Эти деления д., следовательно, тонко регулироваться, так чтобы они соотв. образом были скоординированы с онтогенетическими программами во время периодов морфологических изменений и/или органогенеза, которые происходят пост-эмбрионально. Генетические скрининги, разработанные для выделения мутантов в этих процессах оказались пригодны для нашего понимания генетических основ того, как такие процессы регулируются. Характеристика этих мутантов предоставляет бесценную информацию, которая существенно увеличивает наше знание многочисленных сигнальных компонентов, участвующих в ras, Notch и Wnt путях, а также открывают новые важные функции ранее описанных генных продуктов в регуляции базовых клеточных процессов.

RNAi скрининг по всему геному был использован для идентификации генов, участвующих в ряде постэмбриональных онтогенетических процессов и в большинстве случаев данные подтверждали ранее проведенный генетический анализ, так что эти скрининги существенно расширили наше понимание этих процессов. Однако, не смотря на значительное количество новой информации, связанной с активностями разных генов, описанные данные недооценены в основном из-за внутренне присущих ограничений, связанных с RNAi (2, 50).

Генетический контроль продолжительности жизни привлекает особое внимание и C. elegans предоставляет великолепную модель для поиска ключевых генов, участвующих в этом процессе. По крайней мере, три критических пути были идентифицированы, которые детерминируют продолжительность жизни C. elegans, каждый из которых конвергирует или непосредственно или косвенно с критическими метаболическими процессами. Ограничение калорий, митохондриальная функция и сигналы, которые передают информацию insulin-подобному пути передачи сигналов, вносят вклад в соотв. регуляцию продолжительности жизни независимым или взаимозависимым способом посредством активности Forkhead/FOXO-like транскрипционного фактора, названного DAF-16, нижестоящего эффектора insulin-зависимого сигнального каскада у C. elegans и большинства др. metazoans (51, 52). Ген daf-16 необходим личинкам C. elegans , чтобы осуществлять альтернативные онтогенетические программы, называемые dauer, которые представляют собой диапауза-подобную стадию, которая позволяет животным выживать в неблагоприятных условиях среды (53).

Потенциальные транскрипционные мишени для DAF-16/FOXO были идентифицированы с использованием кластерного анализа данных микромассивов, полученных от мутантов C. elegans, которые осуществляют dauer онтогенетическую программу постоянно, причем различия в уровнях мРНК, продуктов ряда генов, были отличимы от профилей, получаемых от daf-16 (dauer defective) мутантов (54). Эти находки подкрепляются существенно при использовании RNAi для систематического нарушения этих мишеней кандидатов, т.к. оценка их способности или влиять на продолжительность жизни или усиливать различные аспекты dauer развития. Использование RNAi в качестве комплементарного метода для оценки microarray-предсказанных транскрипционных мишеней скорее всего станет стандартным для тестирования предсказаний, сделанных на основании крупного функционального анализа генома.

Большинство исследований, которые были адресованы регуляции продолжительности жизни, были сфокусированы на генах, чья роль была описана ранее в dauer пути и/или посредством классических генетических скринингов мутантов, влияющих на продолжительность жизни. Как и в любых др. генетических скринингах выделение мутантов в основном зависело от того, как мутантный ген может затрагивать др. аспекты развития, помимо его влияния на продолжительность жизни, и , следовательно, существовала тенденция отбора в направлении генов, которые оказывают незначительный эффект на существенные процессы, которые могут происходит в эмбриогенезе. В недавней серии исследований эта тенденция была преодолена путем инактивации функции гена посредством RNAi только в течение личиночного периода (50, 55,56). Систематический RNAi анализ продуктов генов, присутствующих на хромосомах I и II был использован для дальнейшего расширения репертуара генов, которые контролируют продолжительность жизни. Этот подход подчеркнул важность генов, которые затрагивают митохондриальную функцию, в регуляции продолжительности жизни взрослых. До этого лишь небольшое количество митохондриальных генов было идентифицировано с помощью классического генетического подхода (57, 58). Этот новый набор идентифицированных генов , следовательно, дополняет существующие немногие гены, которые ранее были охарактеризованы и расширяет наше понимание о множестве важных функций митохондрий в предопределении продолжительности жизни.

RNAi поиск по всему геному всех генов, участвующих в контроле продолжительности жизни недавно подтвердил роль многих генов, которые функционируют в зависимой или независимой FOXO/DAF-16/insulin передаче сигналов (56). однако, этот скрининг открыл также 23 ранее не охарактеризованных гена, которые влияют на продолжительность жизни, некоторые из которых функционируют посредством пути передачи сигналов insulin, но наиболее важно, что новый класс генов влияет на продолжительность жизни способом, независимым от передачи сигналов DAF-16/insulin и что он может играть определенную роль в метаболизме РНК.

Помимо определения продолжительности жизни анализ различных метаболических процессов, которые регулируются во время dauer развития также пролили свет на наше понимание диабета и ожирения, двух главных проблем здоровья человека. В недавнем исследовании способности dauer животных приспосабливать свой метаболизм к хранению капель липидов в качестве долговременных источников энергии было использовано в качестве базы для геномного поиска генов, участвующих в хранении жиров (59). Было установлено, что животные, мутантные по рецепторам инсулина, накапливают капельки жира через какое-то время и что эти капельки может увидеть с помощью Nile Red. Эти скрининги идентифицировали гены, участвующие в хранении жиров как у накапливающих липиды, так и липид-истощенных животных. Среди генов, которые вызывают такие изменения в хранении жиров, законсервированы гены, которые играют критическую роль в метаболизме и биосинтезе жиров (59). Более неожиданным стало, что RNAi-обусловленный нокдун ряда транскрипционных факторов, особенно определенных рецепторов ядерных гормонов, как установлено, нарушает соответствующее хранение жиров. Это указывает на то, что эти рецепторы и др. идентифицированные транскрипционные факторы м. выполнять консервативную роль в качестве мастеров регуляторов хранения жира, вообще-то путем модулирования экспрессии ключевых генов мишеней, которые, следовательно, затрагивают пути клеточного метаболизма в ответ на steroid-подобные сигналы, хотя понимание этих механизмов ещё впереди. Все продукты этих генов являются прекрасными кандидатами для тестирования их способности целенаправленного изменения химическими средствами в качестве потенциальных средств лечения ожирения и/или диабета.

RNAi скрининг по всему геному использован и для нашего понимания различных аспектов туморогенеза. Недавнее исследование было сфокусировано на генах, участвующих в раке, и было показано, что 47 из 61 генов человека, которые были исследованы, и которые как известно участвуют в разных раках, имеют очевидных ортологов у C. elegans (60). Многие из этих генов хорошо охарактеризованы благодаря их вовлечению в онтогенетические пути, необходимые для спецификации типов клеток или формирования органов у животных. Фактически, генетический анализ развития vulva у C. elegans оказался очень плодотворным в этом отношении: было показано, что они участвуют от формирования паттерна до онтогенетического определения временных параметров (timing) (rev. 61). Вульва развивается как отверстие в эпителии, которое позволяет взрослым гермафродитам выталкивать свои оплодотворенные яйца. Во время формирования вульвы ras белок активируется только в одной клетке, которая затем передает сигналы своим ближайшим соседям, чтобы активировать Notch-подобный рецептор, а также чтобы ингибировать ras путь в этих соседних клетках. Однако, в клетках, которые не получают какого-либо сигнала и , следовательно, не могут вносить вклад в собственно вульву, любые фоновые ras signalling шумы д. ослабляться. Это достигается посредством перекрывающихся путей, которые нуждаются в генных активностях, которые распадаются на три категории, и которые обозначаются как synthetic Multivulva гены (synMuvA, synMuvB и synMuvC); они наз. синтетическими, т.к. одиночные мутации в любом из этих 3-х классов не вызывают какого-либо видимого фенотипа, но в комбинации мутации из двух разных классов вызывают множественные выпячивания или pseudovulvae, чтобы сформировать вентральную сторону животного, где располагаются клетки vulval предшественника (61, 62). Один synMuvB класс генов назван lin-35, кодирует C. elegans гомолог человеческого гена супрессора опухолей Rb. Обширный список генов, которые взаимодействуют с lin-35/Rb во время формирования вульвы указывают на то, что lin-35/Rb функционирует в основном в качестве транскрипционного модификатора, который модулирует экспрессию генов (62-65).

Чтобы детально проанализировать весь геном C. elegans по всем генам, участвующим в synMuv путях, был осуществлен широко масштабный RNAi скрининг как synMuvA, так и synMuvB мутантного фона (66). В этом исследовании были идентифицированы 9 новых synMuv генов, большинство которых давало в результате летальный фенотип, сопровождаемый нарушениями и которые никогда не смогли бы быть изолированы с помощью классического генного скрининга, т.к. мутантные животные никогда не достигали момента развития, чтобы сформировать vulva. Среди них имеются гены, которые действуют на транскрипционном уровне путем модификации хроматина, а также гены, которые затрагивают sumoylation, которое может участвовать в модификации компонентов ras-активируемой транскрипционной реакции, а также затрагивать экспрессию активированного лиганда сигнального пути Notch (66, 67).

Геномная нестабильность часто ассоциирует с началом многих типов раковых опухолей у людей. Сходным образом некоторые мутантные линии C. elegans демонстрируют частые спонтанные мутации и поэтому обозначаются как mutators (53). Такие фенотипы могут возникать благодаря альтерациям в генах, которые затрагивают стабильность генома или влияя на скорость транспозиции или напротив путем модифицирования способности клеток точно реплицировать или репарировать свой геном (53). Мутации в генах, участвующих в замалчивании транспозонов, являются мутаторами, т.к. на этом генетическом фоне транспозоны высвобождаются, чтобы мобилизоваться и вызвать деструкции генов вследствие их инсерции в различные генетические локусы. В элегантной стратегии, чтобы идентифицировать гены, которые вносят вклад в стабильность генома, мультикопийные трансгенные массивы, которые включают 17-нуклеотидные мономерные повторы, которые прерывают рамку считывания чувствительного colorimetric репортерного гена (LacZ) были использованы в качестве сенсора для идентификации генов, которые будучи knocked down, д. восстанавливать трансляцию репортерного гена в массиве (68). Используя этот подход исследователи провели RNAi скрининг всего генома, чтобы идентифицировать гены, которые д. вызывать сдвиг рамки считывания, возможно благодаря репликации скольжения (slipping) в мономерном линкере и следовательно, предрасполагать клетки к ошибкам во время удвоения генома. В некоторых случаях это позволяет возобновить трансляцию репортерного гена, который затем действует как read-out для таких событий. В результате этой работы выявлен 61 ген, которые распадаются на разные категории, в пределах от факторов ремоделирования хроматина до регуляторов клеточного цикла, которые участвуют в сенсибилизации животных к таким изменениям. Интересно, что ряд таких кандидатов имеет своих аналогов у др. metazoa, включая и людей, но отсутствуют у дрожжей. Следовательно, хотя этот процесс и высоко законсервирован, имеются всё ещё существенные различия в способе, с помощью которого дрожжи и животные лечат ошибки репликации.

Использование систематического RNAi скрининга недавно было расширено для проверки генов, которые являются критическими для самого пост-транскрипционного пути gene-silencing/RNAi, тем самым была получена новая ценная информация о механизмах, с помощью которых этот критический клеточный путь регулирует экспрессию генов. Генетические скрининги для идентификации генов, участвующих в этом процессе оказались пригодными для молекулярной трктовки этого законсервированного клеточного механизма (69-71).

Гены, участвующие в молчании GFP репортерного трансгена посредством активации RNAi пути (трансген формирует dsRNA шпильку, которая заставляет молчать GFP), были идентифицированы при скармливании трансгенной линии индивидуальных клонов из библиотеки бактериальных RNAi, что сопровождалось скринингом аномальной персистенции сигнала GFP. Из 19,000 проанализированных клонов идентифицировано 79 новых генов, которые участвуют в пути RNAi (72). Приблизительно 85% из них имеют без сомнения гомологи у людей и 65% из них существенны для C. elegans. Многие из идентифицированных генов выполняют различные роль в метаболизме РНК, включая ядерный транспорт, полиаденилирование/расщепление и nonsense-обусловленную деградацию. Это указывает на то, что их клеточные функции в RNAi могут быть приспособлены для многочисленных клеточных и онтогенетических ролей.

Подобно RNAi, ко-супрессия является RNAi-родственным пост-транскрипционным механизмом молчания генов, который может играть защитную роль в зародышевой линии C. elegans (73). Когда мультикопийные трансгены экспрессируются в зародышевой линии, то клетки отвечают молчанием повторяющихся последовательностей (трансгенов), тогда как эндогенный локус, который соответствует генному продукту также в последствии затрагивается. Это позволяет предположить защитный механизм против продуктов экспрессируемых генов с повторяющихся мобильных элементов, которые д.б. во всем остальном вредны для клеточного гомеостаза в этой критической клеточной линии. Неожиданно, многие из компонентов RNAi пути также вовлечены в этот процесс. Использование классического генетического анализа для идентификации генов, участвующих в ко-супрессии, затруднено из-за мутаций, которые затрагивают гены, участвующие в функционировании зародышевой линии и делающие животных стерильными, затрагивая тем самым способность восстанавливать и/или поддерживать мутантов. RNAi анализ по всему геному недавно был использован для идентификации генов, которые необходимы для трансгенами индуцируемого молчания в зародышевой линии путем мониторинга молчания экспрессирующегося в зародышевой линии GFP репортерного трансгена (74). Когда гены, необходимые для установления или поддержания ко-супрессии, затрагивались вследствие поглощения бактериальных клонов из RNAi библиотеки, то экспрессия молчащего GFP трансгена восстанавливалась. Это исследование идентифицировало 59 генов, которые необходимы для ко-супрессии, из которых только 1 как было показано ранее играет некую роль в молчании в зародышевой линии. Эти гены попадают во множественные классы, 25% которых участвуют в различных аспектах метаболизма РНК. В целом, очевидно, что идентифицировнаные гены затрагивают связанное с ко-супрессией молчание как транскрипционном, так и пост-транскрипционном уровне.

This review is by no means comprehensive, and a number of other very important genome-wide screens have been carried out in C. elegans, mainly using the feeding RNAi library. The results of all these screens have taken us a substantial step forward in understanding how genes function, at the genomic level, in various cellular and developmental processes. At present, the diverse applications of these high-throughput approaches are limited only by the creative methods of selection that individuals can design in order to carry out their respective screens. Undoubtedly, this will become increasingly more sophisticated as numerous high-throughput platforms become available that can be interfaced with this powerful approach. Most notably, screens that make use of fluorescence or GFP reporters are becoming more common, and with recent progress in fluorescence detection and sorting technologies, selection methods that hinge on this read-out will rapidly become strategies of choice for global gene characterization. The combination of RNAi-mediated functional genomics and the advent of high-throughput biological investigation have once again put C. elegans into the limelight where it will continue to serve as a prototype for understanding how gene activities are coordinated within the cell and during animal development. In turn, the accessibility and application of all of this information by clinical scientists will facilitate the study and understanding and offer great promise in improving our current treatment of numerous human disorders.