Посещений:
Формирование Передне-Заднего Паттерна Конечностей

Генетический Контроль

Anteroposterior Patterning in the Limb and Digit Specification: Contribution of Mouse Genetics
B.Robert, Y.Lallemand
Dev. Dyn. - 2006.- V.235, No 9, P. 2337-52

Article

Недавно полученные данные существенно изменили наше мнение о механизмах формирования паттерна конечностей, особенно вдоль передне-задней оси. Эти данные привели нас к пересмотру способа действия зоны поляризующей активности. Они пролили свет на на молекулярные и клеточные механизмы формирования паттерна, связанные с путми передачи сигналов Shh-Gli3 и предоставили информацию о механизме активации этих кардинальных факторов, а также о последствиях их активности. Эти новые данные прекрасно согласуются с результатами молекулярной генетики мышей. Эти подходы расширили возможности генетики мышей благодаря введению мутационных стратегий, которые позволяют осуществлять тонко настраиваемые модуляции генной экспрессии. В обхоре литературы основное внимание уделено данным, достигнутым в последние 5 лет в результате анализа развития конечностей мышей и обсуждены новые перспективы, открываемые этими результатами.


Рис.1. Figure 1. A-C: Skeleton morphology of a normal (A), a Gli3Xt/Xt homozygous mutant (B), and a Shh-/- homozygous mutant (C) embryo limb. All specimens are from embryonic day (E) 14.5 embryos with Alcian blue-stained cartilages. Anterior is up. A: Normal forelimb. Digits are numbered from thumb (digit1, anterior) to small digit (5, posterior). Cardinal segments of the limb are depicted: stylopod (S), which contains a single bone, the humerus (H); the zeugopod (Z), composed of two bones, radius (R) anteriorly and ulna (U) posteriorly; the autopod (A), comprising carpals, metacarpals and digits. B: The Gli3 homozygous null-mutant is polydactylous (seven digits in the specimen shown). Anteroposterior polarity is lost; therefore, digits cannot be assigned an identity (question marks). Note that none of these digits display the morphology of a normal digit 1. C: In the Shh null mutant, no digit is detectable in the forelimb and a single digit remains in the hindlimb. This digit has a digit1 (hallux) identity according to molecular markers (Chiang et al.,[2001]). The zeugopod contains a single bone, likely a radius (R?), in the forelimb, and two misshapen elements that are fused in the midline, likely representing a tibia (T?) and a fibula (Fi?), in the hindlimb (Chiang et al.,[2001]; Kraus et al.,[2001]). The stylopod is less affected (forelimb: H, humerus; hindlimb: Fe, femur). Note that a double Gli3:Shh homozygous mutant would display a limb phenotype similar to that of the Gli3 homozygote.  | 


Рис.2. Figure 2. Genetic interactions in limb morphogenesis. A: Just after limb budding (embryonic day [E] 9.0), the anteroposterior (AP) axis is determined by the mutual antagonism between Gli3 and Hand2, two genes encoding transcriptional factors, that are expressed each in half of the early limb bud, Gli3 anteriorly and Hand2 posteriorly. At this stage, Shh is not activated yet. The Gli3 protein is likely to be present predominantly in its truncated form (Gli3R) and controls expression of Alx4 in the anterior domain (te Welscher et al.,[2002a]). Conversely, in the posterior region, Hand2 will induce the expression of Shh either directly or by means of the activation of the 5 genes of the HoxD complex. B: Later on (E11.0), Shh in turn maintains the expression of both Hand2 and the 5-Hoxd genes. It further regulates the level of Gli3R in a graded manner (illustrated by the red gradient), by repressing Gli3 at the transcriptional level on one side, and by preventing the transformation of the full-length Gli3 form (Gli3A) into Gli3R on the other. Gremlin expression is inhibited by Gli3R and, therefore, concentrates in the posterior limb bud, where it represses, by means of protein-protein interactions, Bmp signaling. This prevents down-regulation of the expression of Fgf4 and Fgf9, as well as Bmp-induced regression of the apical ectodermal ridge (AER; Pizette and Niswander,[1999]). In red, A, anterior; P, posterior.  | 


Рис.3. Figure 3. Contribution of cells producing or receiving the Shh signal to the limb. Drawings schematically represent the limb bud at different stages of development (as indicated in the top line). The scale has been roughly respected. Anterior (digit 1) is to the right. A: Shh expression profiles. B,C,D: Shh-expressing cells were irreversibly marked at different times of development by tamoxifen-based induction (TM induction) of a CreErT2 gene inserted in the Shh locus (see text for details). B: Induction at the onset of Shh expression shows that the early zone of polarizing activity (ZPA) contributes descendants to digits 5 and 4 and the posterior half of digit 3. C,D: Induction at later stages demonstrates that the fate of the ZPA cell descendants is progressively restrained to more posterior digits. E: Gli1 expression profile. Gli1 is used as a readout of Shh signaling response. Note that, around E11.5, the posterior-most region of the limb mesenchyme, although expressing Shh (A), does not respond to the Shh signal. F: Early labeling of the Gli-expressing cells, induced by tamoxifen, gives rise to descendants in the four posterior digits (digits 5 to 2), according to a posterior to anterior decreasing gradient. G: Due to the switch-off of Gli1 expression at E11.5, tamoxifen induction at later stages leads to labeling that partially excludes the digit 5 territory. Noticeably, neither cells producing nor responding to the Shh signal contribute descendant to digit1, nor to the anterior bone of the zeugopod, Radius or Tibia. NB: The latest stage represented is embryonic day (E) 12.5. This is an interpolation of data gathered between E12.5 and E16.5 by Harfe et al. ([2004]) and Ahn and Joyner ([2004]).  | 


Рис.4. Figure 4. Collinear regulation of the HoxD complex. The HoxD complex is oriented with the 5 (centromeric) end to the left. The black boxes represent the different genes and the corresponding transcription starts are indicated by arrows. A: Early limb expression of the Hoxd genes is under the control of two regulatory sequences, one located on the 3 side of the cluster (ELCR, early locus control region) and the other (posterior restriction = POST) on the 5 side. During limb budding, the temporal activation of Hoxd genes is under the control of the ELCR, such that the closer the gene is located relative to the ELCR, the earlier its expression is induced (temporal collinearity, indicated by the fading arrows). Similarly, the POST control region regulates the spatial restriction of transcripts in the posterior bud (indicated by the T bar), according to a gradient of repressor activity (black triangle). Thus, the posterior restriction is maximal for genes located close to the 5 end of the cluster and decreases progressively for genes located more 3 along the cluster. B: Later in development (embryonic day [E] 10.5 to E12.5), a second wave of transcription, independent of the first one, takes place. It is controlled by the GCR (global control region) and leads to expression of the 5-most genes (Hoxd13 to Hoxd9) in the digit presumptive territory. (Adapted from Tarchini and Duboule,[2006], with permission from Elsevier.)  | 

PATTERNING MECHANISMS ALONG THE AP AXIS


Zone of Polarizing Activity


Открытие zone polarizing activity (ZPA) (Saunders, Gasseling, 1968) стало отправной точкой в нашем понимании механизмов, контролирующих формирование Ар паттерна конечностей. ZPA является небольшой субапикальной областью задней мезенхимы зачатка конечности. Трансплантации этой области вперед в хозяйскую куриную конечность ведет к к зеркальному удвоению пальцев. Свойства ZPA действует посредством секретируемого морфогена в соотв. с моделью, предложенной Вольпертом (Wolpert, 1969; rev. Tickle, 2002). В этой модели морфоген д. диффундировать из задней части мезенхимы, где он продуцируется, создавая пространственный градиент. Качественные особенности каждого пальца д. специфицироваться значениями порогов вдоль градиента морфогена. Эта модель была в дальнейшем подтвержена наблюдениями Tickle, что ретиноевая кислота (RA), небольшая, липофильная, способная к диффузии молекула, может воспроизводить эффект трансплантации ZPA (Tickle et al., 1982).
Наилучшим кандидатом на роль ZPA морфогена явился Sonic hedgehog (Shh) мышиный ортолог гена hedgehog (hh) Drosophila (Riddle et al., 1993; Chang et al., 1994). Shh удовлетворяет всем условиям, предъявляемым к морфогену ZPA; (1) Shh является секретируемым белком; (2) в конечностях Shh экспрессируется специфически в ZPA и в точное время, когда эктопические трансплантации задней мезодермы вызывают удвоения пальцев; (3)клетки, экспрессирующие Shh, обладают активностью, сходной с таковой у ZPA, когда трансплантируются впереди в зачаток конечности хозяина, при этом они также индуцируют зеркальные удвоения пальцев. более того, ретиноевая кислота способна активировать экспрессию Shh в передней части мезенхимы конечности. Наконец, подобно ZPA Shh активирует экспрессию в задней части гена Hoxd (rev. Pearse, Tabin, 1998; Tickle, 2002). Необходимо учитывать в дальнейшем, что у Drosophila hedgehog (hh) является морфогеном, диффундирующим на короткое расстояние, он активирует продукцию decantoplegic (dpp, члена семейства сигнальных факторов Bmp1/Bmp4) на границе между передним и задним компартментом крылового имагинального диска. Dpp в свою очередь формирует морфогенетический градиент по обеим сторонам границы, чтобы сформировать паттерн крыла (Lawrence, Struhl, 1996; Hammerschmidt et al., 1997). Учитывая гомологию процессов в перспективе (Gilbert et al., 1996), Shh может быть ожидаемым морфогеном для конечностей. Более того, предполагается потребность во втором диффундирующем морфогене.
Доступность мышей, несущих нулевую мутации Shh, подтверждает важность этого гена для развития конечностей (Chiang et al., 1996). Гомозиготные эмбрионы обнаруживают тяжелые фенотипы конечностей в autopod (Рис. 1), скелет полностью лишенный пальцев в передних конечностях и всегда одиночный из двух фаланг палец на задних конечностях, а zeugopod состоит из одиночной кости в передних конечностях. Эти результаты подтверждают, что Shh необходим для формирования паттерна зачатков конечностей в довольно крупной области (Chiang et al., 2001; Kraus et al., 2001). Напротив некоторые мутантные мыши обнаруживают полидактилию благодаря эктопической эжкспрессиии Shh в переднем домене конечности (Masuya et al., 1995, 1997). Некоторые из этих мутаций действительно обусловлены мутациями в регуляторных последовательностях Shh, такие как Hemimelic extra-toes (Hx; Lettice et al., 2002, 2003; Sagai et al., 2004) и Sasquatch (Lettice et al., 2003), в то время как др. обусловлены мутациями в др. генах, таких как Strong's Luxoid (который затрагивает Alx4; Qu et al., 1998; Takahashi et al., 1998) или extra-toes (Xt; затрагивающий Gli3; Schimmang et al., 1992; Vortkamp et al., 1992; Hui, Joyner, 1993). Эти результаты указывают на то, что передняя эктопическая экспрессия Shh является общим феноменом у мутантов с преаксиальной полидактилией и как следствие эта неправильная экспрессия вызывает фенотип, с помощью механизма, сходного с трансплантацией ZPA у эмбрионов кур. Дальнейший анализ показал, что некоторые из этих мутаций в самом деле Shh-зависимые, тогда как др. нет (Litingtung et al., 2002; te Welscher et al., 2002b).

Mechanism of Action of Shh: Molecular Aspects


Передача сигналов hedgehog у Drosophila опосредуется с помощью белка Cubitus interruptus (Ci), транскрипционного фактора с цинковыми пальчиками. Ci присутствует в клетка или в виде формы полной длины (Ci155) или укороченной формы, которая N-терминальные последовательности, включая Zn-finger домен (Ci75; Aza-Blanc et al., 1997). Обе формы обладают сходными ДНК-связывающими свойствами, но Ci155 действует как транскрипционный активатор, в то время как Ci75 является репрессором. Процессинг Ci155 нуждается в цАМФ-активированной протеин киназе А (РКА) и в двух кластерах сайтов РКА в Ci белке (Chen et al., 1998). Соединение hh со своим рецептором Patched связано с Patched-зависимой репрессией белка Smoothened с 7 трансмембранными доменами (Smo). Smo затем предупреждает протеолитическое расщепление Ci, который благодаря этому остается транскрипционным активатором полной длины (rev. Huangfu, Anderson, 2006).
У птиц и млекопитающих ортологи Cubitus interruptus составляют Gli семейство из трех членов (Gli1, Gli2 и Gli3). В конечностях хотя и экспрессируются все три Gli гена, но только Gli3? по-видимому, необходим для формирования паттерна (Park et al., 2000; Bai et al., 2002). Сходным с Drosophila Ci образом, Gli3 продуцирует белок в 190 кДа, который повергается процессингу в белок в 83-кДа (Wang et al., 2000). Процессинг зависит от от РКА-обусловленного фосфорилирования и ингибируется с помощью Shh в micromass культуре конечности. Укороченная форма действует как строгий репрессор транскрипции и может, следовательно, рассматриваться как Shh-зависимый транскрипционный репрессор. В самом деле укороченная форма приблизительно в 7 раз более многочисленна в передней трети, чем в задней трети зачатка конечности. Способность формы в 190 кДа активировать транскрипцию, сходная с таковой у Ci155, всё ещё спорна (Dai et al., 1999; Wang et al., 2000; Litingtung et al., 2002). Необходимо учитывать, однако, что экспрессия Gli1 лишь уменьшена а Gli2 мутантных конечностях, в то время как она полностью исчезает у двойных мутантов Gli2:Gli3 (Bai et al., 2004). Кроме того, предупреждая формирование репрессорной формы Gli3, Shh контролирует также Gli3 на транскрипционном уровне путем репрессии его экспрессии в задней части зачатка. Т.о., концентрация Gli3R является результатом комбинации АР градиента из транскриптов Gli3 и АР градиента активности процессинга Gli3 (Рис. 2).

Mechanism of Action of Shh: Cellular Aspects


После идентификации Shh в качестве молекулярного детерминанта ZPA, механизм, объясняющий способность дальнодействующей передачи вдоль оси АР конечности сигналов, стал популярным. Недавно два сообщения, базирующиеся на картировании судеб в конечности, прояснили этот вопрос и предоставили основу для понимания способа действия Shh и установления качественных особенностей пальцев вдоль Ар оси.
Оба сообщения базируется на Cre активации floxed, дремлющего LacZ гена в повсеместно экспрессирующемся локусе Rosa (Soriano, 1999). После нокаута в специфическом гене, Cre, необратимо метятся все клетки, которые когда-то экспрессировали этот ген и все их производные.
Используя трансгенных мышей с Cre геном, вставленным в локус Shh, Harfe et al., (2004) проследили судьбу клеток из ZPA (Shh-экспрессирующие клетки) и их производных, которые больше не экспрессировали Shh. В то время как Shh-экспрессирующие клетки формировали небольшой домен в задней части мезенхимы конечности по время всего периода экспрессии Shh ( Е9.75-Е12), их производные вносят вклад в большую часть конечности, а именно, во все 5 и 4-й пальцы, приблизительно в 30% клеток 3-его пальца на задней стороне и и в треть локтевой кости (Рис. 3). Не выявлено меченных клеток ни в пальце 1, ни 2, в лучевой или плечевой кости. У Shh нулевых мутантов, только плечевая кость и единственная кость zeugopod, которая, по-видимому, формируется лучевой костью и пальцем 1 (Рис. 1C; Chiang et al., 1996, 2001). Эта находка подтверждает, что только палец 2 нуждается в диффузии или транспорте белка Shh для спецификации, в то время как палец 1 специфицируется независимо от передачи сигналов Shh.
Harfe et al. (2004) анализировали далее с использованием CreERT2 гена, вставленного в локус Shh. CreERT2 кодирует слитый белок из Ску рекомбиназы и активационного домена ядерного рецептора эстрогена, который активируется у эмбрионов, когда tamoxifen предоставляется матерям (Feil et al., 1997). Таким способом они смогли пометить Shh-экспрессирующие клетки в избранные промежутки времени во время развития. Если мыши подвергались воздействию тамоксифена на ст. 9.5, в начале экспрессии Shh, то меченные клетки на ст. Е14.5 обнаруживались в составе пальцев %и 4 и частично в пальце 3 и локтевой кости, т.е. как и при использовании Shh-Cre слитого белка (Рис. 3D)/ Активация CreERT2 на ст. Е10.5, однако, вызывала мечение пальца 5 и задней части пальца 4 на ст. Е14.5, в то время как активация CreERT2 на ст. Е11.5 приводила к мечению клеток только пальца 5 (Рис. 3С,Д). Т.о., клетки, которые вносят вклад в наиболее передние пальцы, прекращают экспрессировать Shh на ранних стадиях развития конечности. Эти результаты указывают на то, что критическими факторами для спецификации задних пальцев являются: (1) продолжительность и интенсивность воздействия Shh и (2) клеточная способность удерживать в памяти оказанное на них воздействие передачи сигналов Shh.
В др. работе по отслеживанию клеточных клонов Ahn и Joyner (2004) метили клетки, которые чувствительны к сигналу Shh путем инсерции CreERT2 трансгена в локус Gli1. Экспрессия Gli1 активируется с помощью Shh посредством Gli2 и Gli3 и следовательно, аккуратно считывает данные по передаче сигналов Hedgehog (Рис. 3Е; Bai et al., 2004). В этих экспериментах, клетки, чувствительные к Shh и их производные, метились преимущественно, независимо от того, экспрессируют ли они Shh или нет.
Когда CreERT2 активировался на ст. Е9.5, то небольшая группа реагирующих на Shh клеток в задней трети зачатка конечности увеличивалась и занимала всю пластинку руки на ст. Е12.5, за исключением презумптивной территории пальца 1, градированным образом от задней части к передней (Рис. 3F). На ст Е16.5 они вносили вклад, происходящий из пальца 5 в палец 2, наивысшим мечением в пальце 5 и снижением уровня мечения в пальцах 4 и 3 и лишь немногими меченными клетками в пальце 2. В zeugopod меченные клетки обнаруживались в локтевой кости. Лопатка, плечевая и лучевая кость и палец 1 не метились. Т.о., клетки, отвечающие на Shh, вносили вклад только в дистальную (autopod zeugopod) и заднюю (локтевая кость и пальцы 2-5) части конечности. Граница производных Gli-1-экспрессирующих клеток (палец 2), при сравнении с таковой для производных Shh-экспрессирующих клеток (палец 3; Harfe et al., 2004) подтверждает, что только развитие пальца 2 зависит целиком от дально-действующей диффузии Shh, в то время как палец 3 только частично зависит от неё, а пальцы 4 и 5 не зависят совсем. Чувствительные к Shh клетки вносят вклад в производные не только костей, но и также всех соседних тканей (таких как мышцы и сухожилия), включая эпидермальную ткань в задней области конечности, указывая тем самым, что Shh, продуцируемый мезенхимными клетками, может диффундировать в клетки др. зародышевых слоёв.
Когда CreERT2 активировался на 1 день позднее (Е10.5), то инициальная популяция меченных клеток была более широкой на Е11.5. Однако, на ст. Е16.5 домены, соответствующие меченным клеткам не расширялись более кпереди, а скорее ограничивались пальцами 5-2 и локтевой костью. Кумулятивное мечение в течение всего периода экспрессии Shh (Е9.5-Е12) давало те же самые результаты (Рис. 3G)/
Др. крупным наблюдением стало мечение конечности на ст Е10.5. В соответствии с негативной регуляцией Gli1 в наиболее заднем домене ZPA на ст. Е10.5 (Рис. 3Е), количество меченных клеток в задней области конечности заметно редуцировалось начиная с Е11.5. Соотносительно ст. Е16.5, в то время как клетки, меченные на ст. Е9.5, вносили вклад производных наивысший в палец 5, клетки же, меченные на ст. Е10.5, колонизировали пальцы 3, 4 и 5 приблизительно на одном и том же уровне (Рис. 3F,G). Т.о., хотя сигнал Shh первоначально воспринимается от ZPA в виде задне-переднего градиента в дистальной части конечности, степень накапливаемого Shh сигнала, получаемого клетками пальца 5, только лишь слегка выше, чем накапливаемы клетками пальца 4 и затем снижается для пальцев 3 и 2.
Мыши, Gli2-/- не обнаруживают дефектов формирования паттерна конечностей, хотя экспрессия Gli1 заметно снижена в этом контексте (Park et al., 2000; Ahn, Joyner, 2004). Соответственно, у мутантов Gli2-/- количество клеток, экспрессирующих lacZ после доставки тамоксифена, достоверно снижается во всей передней конечности, хотя они всё ещё вносят вклад в презумптивные территории пальцев 5-2. На Е16.5 только небольшое количество меченных клеток наблюдалось в пальцах 4 и 3, даже меньше, чем в пальцах 5 и 2, демонстрируя тем самым, низкая и не отсортированная реакция на Shh не устраняет нормального формирования паттерна пальцев. У таких мышей поддерживалось градированное распределение Gli3R вдоль АР оси.
Эти результаты привели к реинтерпретации данных, подтвердив, что диффузия Shh не нужна для формирования всех пальцев в конечности, это согласуется со способностью cигнала Shh распространяться на небольшие расстояния. Продукция активного Shh сигнала нуждается в автопротеолитическом расщеплении белка Shh полной длины, при этом высвобождается N-терминальный фрагмент в 19-кДа (Bumcrot et al., 1995). Последний ассоциирует с клеточной поверхностью с помощью холестерола и жирных кислот, которые ковалентно соединяются с его С-концом (Porter et al., 1996; Pepinsky et al., 1998). Lewis et al., (2001) сконструировали мутантную линию мышей, которая постоянно продуцирует укороченную форму белка Shh (N-Shh), которая не может подвергаться холестероловым модификациям. В противоположность ситуации у Drosophila (Burke et al., 1999), эта находка сильно ограничила поле мишень Shh, это подтверждено иммуногистохимией Shh и анализом экспрессии генов мишеней для Shh. В то время как связанный с холестеролом Shh передает сигналы на расстояния приблизительно 300 µm (30 клеточных диаметров), N-Shh действует только на треть этой дистанции, хотя он сохраняяет такой же свою биологическую активность. У мышей, который продуцируют N-Shh как единственную функциональную форму Shh, пальцы 5 и 4 формируются нормально, тогда как пальцы 3 и 2 отсутствуют. Т.к. Shh нулевые мутанты формируют только палец 1 (Chiang et al., 2001), то эта находка ведет к заключению, что Shh диффузия критическая только для пальца 2 и возможно для части пальца 3, т.к. рудимент metacarpus 3 в этих условиях формируется. К тому же выводу пришли Harfe et al., (2004), используя мутантов Disp1. Disp1 является геном, родственным Patched? который необходим для паракринной передачи сигналов Shh (Caspary et al., 2002; Tian et al., 2005). У мышей, несущих одиночный функциональный, но гипоморфный2 аллель Disp1 с гетерозиготной нулевой мутацией Shh, градиент белка Shh распространяется существенно меньше кпереди. Это приводит в результате к формированию только пальцев 5-3 и 1, подтверждая заключение, что диффузия Shh является критической только для пальца 2. Сходным образом у кур, прикрепленный к мембране клеток Shh, трансплантированных в переднюю часть зачатка конечности, вызывает зеркальное удвоение пальцев зависимым от дозы образом, точно также как трансплантаты ZPA (Yang et al., 1997). Эти результаты подтверждают более ранние данные по картированию судеб ZPA у кур (Vargesson et al., 1997; Yang et al., 1997). В частности эти данные показали, что клетки, дающие дополнительные пальцы после применения кусочков, смоченных в Shh, на переднем краю зачатка крыла, возникают внутри радиуса в 300-micro;m вокруг кусочка. Более того, при увеличении времени экспозиции Shh, специфицировалось более задние пальцы, сначала палец 2, затем 3 и,наконец,4.
Всё это ведет к предположению, что Shh не сам по себе морфоген, а необходим для индукции вторичного, диффундирующего сигнала, чтобы действовать на расстоянии. сходном с ситуацией в крыловых имагинальных дисках Drosophila. Bmp2, ортолог dpp, индуцируется с помощью Shh и обладает слабой поляризующей активностью, которая делает его потенциальным кандидатом на эту функцию (Francis et al., 1994; Duprez et al., 1996). Из данных, суммированных выше, мы знаем. что ограниченная диффузия Shh достаточна для формирования паттерна конечностей, которая прежде всего связана с экспансией клеток из ZPA. Насколько интенсивной д. б. диффузия? Антитела против Shh и генов мишеней показывают, что белок Shh диффундирует на расстояние от одной трети до половины пластинки (paddle) конечности на Е11.5. Эта область достаточна для спецификации пальцев 2-5 и предполагаемый вторичный диффундирующий морфоген становится необязательным.
В то время как результаты картирования клеточных судеб очевидны и недвусмысленны, их интерпретация далеко не прямолинейна. Действительные механизмы, которые связывают позицию (т.е. историю) клеток внутри поля мишеней для Shh, и их специфичность (т.е. в каком отношении они отличаются от др. клеток и будут вносить вклад в разные структуры in fine) всё ещё предмет споров. Время, проведенное клетками за продукцией Shh? l/,/ основным сигналом. Однако, продукция Shh не является потребностью для того, чтобы клетки адоптировали специфическую заднюю судьбу: кусочек, высвобождающий Shh д. индуцировать задние структуры, хотя он не индуцирует экспрессию Shh в соседних клетках (Lopez-Martinez et al., 1995; Yang et al., 1997). Продолжительность и интенсивность передачи сигналов Shh в клетки может быть индуцирующей. Однако, передача сигналов Shh выключается раньше в клетках ZPA, это действительно заставляет её действовать более длительно и с наивысшей интенсивностью. Значит, эти параметры могут не вносить существенного вклада в спецификацию качественных особенностей клеток, которые формируют пальцы в разных позициях вдоль АР оси, как это ожидалось.
Harfe et al., (2004) поэтому предложили модель развития конечностей, согласно которой качественные особенности двух наиболее задних пальцев зависят только от продолжительности времени, в течение которого клетки их формирующие, продуцировали высокие концентрации Shh. Между тем спецификация пальца 2 зависит только от пределов продолжительности передачи сигналов при низких концентрациях Shh. Палец 3 д. зависеть как от времени продукции Shh, так и от передачи сигналов на расстояние с помощью Shh. Наконец, палец 1 целиком независим от Shh.
Ahn, Joyner (2004), с др. стороны, предположили, что существует уровень Gli3R, который является детерминантом формирования паттерна пальцев вдоль АР оси, т.к. его градиентное распределение законсервировано у мутантов, таких как Gli2-/-, у которых распределение Shh продуцирующих и воспринимающих клеток существенно изменено.

Downsteam Shh: Life and Death in the Limb Field


Результаты, представленные выше, подчеркивают кардинальную роль Shh и Gli3 в формировании АР паттерна конечности. Кроме того, одним из наиболее заметных признаков конечностей у мутантов Shh является полное отсутствие задних структур, таких как ulna/fibula и пальцы 2-5. Эта находка указывает на роль Shh в гарантии выживаемости и роста задней части мезенхимы. В самом деле, инактивация Shh приводит к существенному увеличению апоптоза, концентрирующегося парадоксально в передней части мезенхимы, точно также как при удалении ZPA у кур (Todt, Fallon, 1987; Chiang et al., 2001; Bastida et al., 2004). Интересно. что в то время как куры обладают задней некротической зоной, перекрывающейся с задней частью ZPA, зачатки конечностей мышей не имеют сравнимой зоны гибели клеток (Saunders, Fallon, 1967; Harfe et al., 2004).
Анализ мутантов Shh и Gli3 и двойных гомозиготных мутантов Shh:Gli3 пролил свет на оба этих аспекта функции Shh (Litintung et al., 2002; te Welscher et al., 1002b). Shh мутанты лишены всех пальцев кроме первого. Extra-toes (Xt; Gli3 null) мутанты имеют полидактилию с более 8 неидентифицируемыми пальцами (Рис 1В; но альтернативное мнение см. Ahn, Joyner, 2004). Т.к. Shh эктопически экспрессируется в передней части мезенхимы конечности мутантов Gli3-/-, то было предположено, что дерегуляция Shh является ключевым фактором для полидактилии у этих мутантов (Buscher et al., 1997; Masuya et al., 1997). Но в противоположность тому, что наблюдается у др. полидактиличных мутантов, таких как Alx4-/-, исключено, что полидактилия у Gli3-/- мутантов не зависит от Shh (Litintung et al., 2002; te Welscher et al., 1002b). Т.о., несмотря на отсутствие Shh, фенотип конечности Shh;Gli3 двойных нулевых мутантов неотличим от такового у одиночных Gli3 гомозигот. Эта находка указывает на то, что в конечности основная, если не исключительная, роль Shh состоит в предупреждении процессинга Gli3 (Рис. 2В).
в свою очередь основной функцией Gli3R в конечности является репрессия супрессии Gremlin (Рис. 2В), диффундирующем BMP антагонисте, экспрессирующемся в мезенхиме конечностей в соответствии с АР градиентом, противоположном градиенту Gli3R. Экспрессия Gremlin наивысшая в ZPA и снижается в направлении презумптивной территории пальца 1 (Litintung et al., 2002; te Welscher et al., 1002b).
Gremlin играет критическую роль в регуляторной петле, которая связывает Shh в мезенхиме и Fgf4 апикальном эктодермальном гребне (AER; Рис. 2В)ю Shh необходим для поддержания ФУК в задней части (Laufer et al., 1994; Niswander et al., 1994). Это поддержание обеспечивается ингибированием активности BMP (Bmp2, Bmp4, Bmp7), анти-AER фактора, благодаря продукции Gremlin (Zuniga et al., 1999; Khokha et al., 2003; Michos et al., 2004). И как результат Fgf4 оказывается необнаружимым у мутантов Gremlin в AER. Однако, экспрессия Fgf8 снижается лишь незначительно (Kuhlman, Niswander, 1997). Поэтому дефекты в формировании паттерна конечностей у мутантов скорее всего обусловлены подавлением Shh скорее, чем разрушением AER (Khokha et al., 2003; Michos et al., 2004). Интересно, что Shh индуцирует Gremlin в соседних клетках, но не в Shh-продуцирующих клетках или их производных, это указывает на механизм завершения Shh-Fgf4 петли, как только производные ZPA клетки подвергаются экспансии (Scherz et al., 2004).
Было показано, что Gli3R необходим для ограничения экспрессии Gremlin областью задней части конечности (Litingtung et al., 2002). У Shh мутантов форма Gli3R превалирует вдоль всей АР оси, а Gremlin подавляется, высвобождая активность BMP. Соотв. индуцируется экспрессия Fgf4, Fgf9 и Fgf17, но не сохраняется в AER, в то время как Fgf8 строго подавляется со ст. Е10.5. Как результат архитектура Shh-/- AER постепенно нарушается в ходе развития (Zuniga et al., 1999; Sun et al., 2000; Chiang et al., 2001). Учитывая роль AER в пролиферации ниже расположенных мезенхимных клеток, этот процесс скорее всего вызывается потерей задних структур как autopod (пальцы 2-5), так и zeugopod (локтевая кость). Напротив , у Xt/Xt (Gli3 null) мутантов отсутствие Gli3R провоцирует расширение экспрессии Gremlin кпереди и общее ингибирование передачи сигналов BMP. Соотв., т.к. индукция Gremlin не зависит от Shh, то Fgf4 экспрессируется по всему апикальному гребню у двойных нулевых мутантов Shh:Gli3 и устраняется клеточная гибель (Litintung et al., 2002; te Welscher et al., 1002b). Было показано, что передняя часть мезенхимы конечности является местом для заметной клеточной гиьбели на Е11.5 (Grotewold, Ruther, 2002a) Эта находка может быть Dickkopf-зависимой, т.к. Dkk1 геном мишенью для BMP (Mukhopadhyay et al., 2001; Grotewold, Ruther, 2002b). На этой стадии Xt/Xt гомозиготные конечности обнаруживают передние разрастания, которые будут давать полидактилию, подтверждая тем самым, что в отсутствие Gli3R клеточная гибель устраняется.
Необходимо отметить, однако, что нулевой фенотип Gremlin менее тяжелый, чем Shh фенотип (Khokha et al., 2003; Michos et al., 2004). Более того, Shh подавляется у мутантов Gremlin и это может быть прямой причиной его фенотипа. Shh может действовать, следовательно, как фактор жизнеспособности/роста в мезенхиме зачатка конечности, как это предполагается для др. тканей (Charrier et al., 2001).
Связь между Shh, Gli3, Gremlin может также объяснить спецификацию качественных особенностей пальцев. У Gremlin-дефицитных эмбрионов экспрессия Shh инициируется, но не распространяется и активность Shh теряется преждевременно (Michos et al., 2004). Т.о., задние клетки воспринимают сигнал Shh в течение более короткого периода времени, чем обычно и поэтому формируется только три пальца. Один обладает характеристиками пальца 1, тогда как спецификацию двух др. определить невозможно (Khoka et al., 2003; Michos et al., 2004). Эти результаты подтверждают важность времени экспозиции передачи сигналов Shh для спецификации пальцев (Harfe et al., 2004).

Before Sonic Hedgehod: Prepatterning of the Limb


Благодаря раннему началу экспрессии Shh, его транскрипты ограничены небольшим доменом в задней части мезодермы, которая в точности перекрывается ZPA (Riddle et al., 1993; Chang et al., 1994). Эти находки подтверждают, что уже имеется система поляризации для предопределения домена экспрессии Shh. Значит ген Shh отвечает на предсуществующую в конечности мезенхиму, это подтверждается анализом Hemimelic extra-toes (Hx), Sasquatch (Ssq) и М100081 мутациями мышей и родственными мутациями у людей (Lettice et al., 2002, 2003; Sagai et al., 2004). Эти мутации ведут к удвоению домена экспрессии Shh кпереди, это, как и в случае трансплантации ZPA, вызывает преаксиальную полидактилию до 8 пальцев на кисти. Они были картированы на расстоянии 1.0 Mb выше кодирующей области Shh, в интроне 5 гена Lmbr1? где они собраны внутри элемента из последовательностей в 500 п.н., которые высоко законсервированы среди позвоночных. С помощью генетических подходов было показано, что они действуют в цис-положении на Shh ген и что ген Lmbr1 не играет роль в неправильной регуляции Shh (Lettice et al., 2002; Sagai et al., 2004). Более того, фрагмент в 450 п.н. из законсервированного элемента управляет экспрессией трансгена в обычном домене экспрессии Shh, в то время как делеция этого элемента приводит к полной потере экспрессии Shh в зачатке конечности (Sagai et al., 2005)/ Эта область, т.о. содержит специфичный для конечностей энхансер Shh, который находится выше кодирующей последовательности. Он также контролирует многие соседние гены, предопределяя тем самым регуляторный ландшафт (Spitz et al., 2003; Zuniga et al., 2004).
Т.к. аллели Hx отличаются по законсервированной области по одиночным заменам нуклеотидов, то Maas и Fallon (2005) сконструировали два трансгена, в которых фрагмент в 1.7 т.п.н., соответствовавший этой области, управляет экспрессией LacZ и они отличаются по одному нуклеотиду. В то время как нормальная версия этого элемента оказывается достаточной для управления экспрессией в виде нормального домена Shh в конечности, мутантный трансген управляет экспрессией lacZ как в нормальном Shh домене, так и в переднем эктопическом домене, характерном для Hx. Это указывает на то, что энхансер содержит регуляторные элементы, которые ограничивают экспрессию нормальным задним доменом, в дополнение к активирующим последовательностям, которые управляют экспрессией Shh в конечности. Такого типа подход д. приводить к идентификации Shh регуляторных факторов.
Всё это демонстрирует, что д. существовать локальные сигналы для индукции корректной экспрессии Shh в конечности. Соответственно, конечности (и плавники у рыбок данио) содержат препаттерн вдоль АР оси в отсутствие Shh (Zuniga et al., 1999a; Chiang et al., 2001; Kraus et al., 2001; Ros et al., 2003). Несколько путей было использовано для объяснения этого препаттерна и последующей корректной локализации Shh.
Retinoic acid. RA может служить заменой трансплантатам ZPA по генерации зеркальных удвоений пальцев и на этой основе было высказано предположение, что она представляет собой дально-действующий диффундирующий морфоген для формирования паттерна АР оси в зачатке конечности (rev. Tickle, 1991). Представленное выше картирование судеб показало, что только ограниченная диффузия Shh необходима для формирования АР паттерна, что делает неопределенным участие дально-действующего морфогена, который бы был связан с передачей сигналов Shh. Тем не менее анализ подтвердил функцию RA в формировании конечности. RA необходима для роста конечности и индукции Shh (Helms et al., 1998; Stratford et al., 1996; Power et al 1999; Niederreiteher et al., 2002; Mie et al., 2004). Последняя функция частично зависит от RA-обеспечиваемой индукции Hoxb8 в передних конечностях, но не в задних (Lu et al., 1997; Stratford et al., 1997). Hoxb8 в свою очередь активирует Shh (Charite et al., 1994). Эта эпистатическая взаимосвязь объясняет, как экзогенная RA может приводить к активации Shh и формированию эктопической ZPA. Должны существовать дополнительные пути, связывающие RA с активацией Shh, т.к. Hoxb8 нулевые мутации и даже одновременные мутации всех трех Нох8 паралогов не приводят к дефектам формирования паттерна конечностей (van den Akker et al., 1999; 2001).
Этот механизм, однако, не работает в задних конечностях, где экзогенная RA не может активировать Hoxb8 (Stratford et al., 1997). Это расхождение между передними и задними конечностями недавно было объяснено с помощью вмешательства siRNA, miR-196, которая разрушает мРНК Hoxb8 и экспрессируется только в задних конечностях (Hornstein et al., 2005). Эктопическая экспрессия miR-196 в передних конечностях кур предупреждает индукцию Hoxb8 с помощью RA и редуцирует, но не устраняет экспрессию эндогенного Shh, как это можнро было ожидать исходя из результатов нокаута Hox8. Специфическая инактивация гена Dicer в мезенхиме задних конечностей восстанавливает способность к индукции Hoxb8 с помощью RA и превращает задние конечности в передние по этому критерию. Очевидно, что инактивация Dicer сама по себе не ведет к экспрессии Hoxb8 в задних конечностях, указывая тем самым, что экспрессия Hoxb8 в первую очередь регулируется на транскрипционном уровне и что роль MiR-196 заключается в предупреждении несоотв. экспрессии Hoxb8 в задних конечностях. Т.к. RA индуцирует Shh в нормальных задних конечностях тоже, но несмотря на это это не активирует экспрессию Hoxb8, то эта индукция д. обеспечиваться др. фактором, который может быть др. Нох геном, такими как паралоги группы Hox9 (Cohn et al., 1997).
Hand2/Gli3 mutual antagonism. Hand2 (первоначально dHand) bHLH транскрипционный фактор, является прекрасным кандидатом на роль индуктора экспрессии Shh. Его экспрессия локализуется в задней части мезенхимы зачатков передних конечностей очень рано после появления зачатка (Е9.25 у мышей; стадия 22-23 сомитов), что сопровождается появлением домена экспрессии Shh и предшествует в несколько часов появлению Shh (25 сомитов) (Chartie et al., 2000; Fernandez-Teran et al., 2000; te Welscher et al., 2002a). Более того, инактивация Hand2 устраняет экспрессию Shh в придатках мышей и раб данио, в то время как эктопическая экспрессия ведет к эктопической индукции Shh и к передней полидактилии (Charite et al., 2000; Fernandez-Teran et al., 2000; Yelon et al., 2000). Эктопическая экспрессия Hand2 под контролем Hoxb8 регуляторных последовательностей ведет к эктопической индукции Shh впереди и к преаксиальной полидактилии, иногда ассоциированной с агенезом большеберцовой кости (элемент переднего zeugopod). Эктопическая экспрессия Hand2 под контролем Prx1 регуляторных последовательностей ведет к обширной экспрессии в мезенхиме по всей почке передней конечности, начиная с ранних стадий. Это приводит к почти точной картине зеркального удвоения ulna и задних carpals и трех наиболее задних пальцев, которые ассоциируют с центральным пальцем не определяемых качественных особенностей (возможно палец 2; Chartie et al., 2000). Эта находка указывает на то, что сам по себе Hand2 достаточен , чтобы индуцировать ZPA с полным сигнальным потенциалом. В свою очередь, у нулевых мутантов Shh экспрессия Hand2 строго редуцирована, хотя устранена не полностью в задней части, указывая тем самым, что регуляторная петля реципрокно связывает Shh и Hand2.
В противоположность Shh паттерн экспрессии Hand2 высоко динамичен, начинается с большого латерального домена мезенхимы, чтобы затем стать ограниченным задней частью мезенхимы конечности. Gli3? как полагают, является одним из факторов, которые ограничивают экспрессию Hand2 задними регионами почки конечности (te Welscher et al., 2002a). На ранних стадиях развития Hand2 и Gli3 формируют два взаимоисключающих и комплементарных домена в зачетке конечности, с Gli3 экспрессирующимся впереди и Hand2 взади. У Shh нулевых мутантных мышей на ст. 25 сомитов Gli3 экспрессируется одинаково с нормальными животными, указывая тем самым, что ограничение Gli3 передней частью не зависит от Shh на ранних стадиях. Приблизительно спустя 12 ч (ст. 34 сомитов) Gli3 экспрессируется по сему зачатку конечности. Эта находка согласуется с уменьшением транскриптов Hand2 в очень ограниченном заднем домене, т.к. экспрессия Hand2 не поддерживается в отсутствие Shh. Генетические данные демонстрируют, что Gli3 и Hand2 взаимодействуют, чтобы репрессировать др. др. (Рис. 2А). У Gli3 (Xt/Xt) мутантов Hand2 экспрессия распространяется сильно кпереди в зачатке конечности. Напротив, у мутантов Hand2 ген Gli3 экспрессируется по всему зачатку конечности, хотя в этом случае анализ ограничивался интенсивностью апоптоза, наблюдаемого, начиная с Е9.75. Домен экспрессии Gremlin, который обычно ограничен задними 2/3 мезенхимы конечности, распространяется кпереди у мутантов Xt/Xt. Это, по-видимому, не является результатом индукции с помощью Hand2, хотя Hand2 способен индуцировать Gremlin эктопически в конечностях кур (te Weltscher et al., 2002a), он не нужен для нормальной экспрессии Gremlin (Charite et al., 2000). Большее значение имеет тот факт, что Hand2 индуцирует экспрессию 5' Hoxd генов, которые в свою очередь может быть регуляторами для тонкого позиционирования Shh (Рис. 2А).
Hoxd genes and early posterior restriction of the ZPA Hox кластеры в первую очередь участвуют в организации плана тела вдоль ростро-каудальной оси (Deschamps, van Nes, 2005). HoxA и HoxD кластеры (Рис. 4) в дальнейшем рекрутируются для формирования паттерна вторичных осей, таких как конечности и наружные гениталии. Участие кластера HoxD в формировании паттерна конечностей продемонстрировано с помощью эффектов индивидуальных Hoxd мутаций на форму пальцев, с помощью того факта, что Hoxa/Hoxd скомбинированные мутации затрагивают специфически формирование различных сегментов конечности и посредством воздействия специфическими манипуляциями в кластере HoxD на количество и специфичность пальцев (Capecchi, 1996; Favier, Dolle, 1997; Zakany, Dubole, 1999; Kmita et al., 2002). Роль генов Hoxd в локальной активации Shh была раскрыта недавно (Zakany et al., 2004).
Делеция HoxA и HoxD кластеров в конечностях мышей ведет к аресту их развития на ранних стадиях. Shh не активируется и только укороченная бедренная кость обнаруживается в передних конечностях при рождении вместе с кусочком не оссифицированного презумптивного zeugopod, одинаково с Shh нулевыми мутантами, но менее развитыми (Kmita et al., 2005). У рыбок данио отсутствие Hand2 является более значимым для устранения полярности грудного плавника, чем отсутствие Shh (syu; Yelon et al., 2000). Очевидно, что Hoxd11 и Hoxd12 не индуцируются у этих мутантов Hand2, это указывает на то, что задние Hoxd гены необходимы ниже Hand2, чтобы индуцировать Shh. Кроме того, эктопическая экспрессия Hoxb8 и Hoxd12 обнаруживает потенциал Нох генов индуцировать Shh (Charite et al., 1994; Knezevic et al., 1997).
У мышей гены наиболее близкие к 3' концу кластера, такие как Hoxd1 и Hoxd3 (b даже Hoxd9; Рис. 4) первоначально экспрессируются по всему зачатку конечности, в то время как Hoxd10-Hoxd13 экспрессируются в домене задней части с самого начала своей экспрессии (Nelson et al., 1996; Zakany et al., 2004). Этот ранний паттерн является независимым от Shh (Grieshammer et al., 1996; Ros wt al., 1996;2003; Neumann et al., 1999; Kraus et al., 2001). Путем индукции инверсии в целом кластере HoxD Zakany et al.(2004) наблюдали эктопическую экспрессию Hoxd11 и Hoxd13 по всему зачатку конечности, включая передний домен, на ранних стадиях. Тот же результат получен с большой делецией, которая элиминирует Hoxd1-Hoxd10 и приводит Hoxd11 на 3' конец кластера. Эти изменения в экспрессии тем самым предопределяют early limb control region (ELCR), которая расположена вне кластера HoxD на 3' (теломерной) стороне (Рис. 4). Этот регуляторный элемент ответственен за раннюю и повсеместную экспрессию в зачатке конечности генов Hoxd, которые расположены вблизи, такие как Hoxd1 и Hoxd3. Эти находки показывают, что паттерн экспрессии Hoxd зависит только от расстояния данного гена от ELCR и не зависит от промотора.
Эктопическая экспрессия Hoxd11 и Hoxd13? когда они оказываются вблизи ELCR? ведет к аномальной, передней индукции Shh в зачатке конечности, указывая тем самым, что экспрессия Shh обычно контролируется задними в кластере Hoxd генами. Этот процесс затем вызывает, на поздних стадиях, симметричную экспрессию Hoxd13, Shh-индуцибельного гена и транслируется в набор пальцев и карпальных косточек при рождении, которые обнаруживают билатеральную симметрию. Безусловно, эктопическая экспрессия Shh в этом контексте ведет к респецификации пальцев вдоль АР оси, но не к полидактилии. Эта находка может быть связана с потребностью в Hoxd генах для собтвенно роста придатков 9Zakany et al., 2004).
Анализ был расширен с использованием большого набора делеций и дупликаций в HoxD кластере (Tarchini, Duboule, 2006). Эти наборы были получены с помощью очень эффективной ст ратегии мейотической рекомбинации (TAMERE; Herault et al., 1998). Делеции, которые приводят 5'-локализованные гены (Hox11-13) к соседству с ELCR, вызывают, как и ожидалось, к более ранней и более передней экспрессии перемещенных генов. Гены, локализованные на 3' стороне делеции (напр., Hoxd4 или Hoxd9) не д. затрагиваться, т.к. их расположение по отношению к ELCR не меняется. Неожиданно, они начинали экспрессироваться на ст. Е10.5 в домене более заднем, чем обычно. Следовательно, они обнаруживают тенденцию адоптировать паттерн экспрессии, характерный для более 5' расположенных генов. Это указывает на то. что регуляторная область на 5' конце кластера (posterior restriction: POST, Рис. 4) репрессирует экспрессию 5' генов в клетках переднего аспекта зачатка конечности, с увеличением эффективности генов, расположенных более 5' в кластере. Как результат, гены Hoxd10-Hoxd13 экспрессируются во все более и более кзади ограниченных доменах, в виде паттерна гнёзд, что отражает пространственную колинеарность между позицией генов в кластере и передней границей экспрессии данного гена (Рис. 4А). Затем Hoxd10-Hoxd13 могут активировать Shh (Zakany et al., 2004). 5' регуляторная область, т.о., д. быть ответственна за точную локализацию транскриптов Shh. Как подчеркивается Tarchini, Duboule (2006) морфологическая асимметрия конечностей зависит от асимметрической локализации этого регуляторного элемента вне кластера и от его градированной репрессирующей активности на промоторы в кластере, как функции расстояния. Она может также зависеть от свойств белка, кодируемого наиболее 5' геном, т.к. экспрессия Hoxd1-Hoxd9, которая обычно распространяется на мезенхиму всей конечности на ранних стадиях, не ведет к индукции Shh в передней части (Zakany et al., 2004).
Tarchini, Dubole (2006) предположили, что Gli3 белок является репрессором для 5' расположенных генов, т.к. инактивация Gli3 ведет к экспрессии этих Hoxd генов в передней части зачатка конечности (Zuniga, Zeller, 1999; te Welscher et al., 2002b) и , кроме того, GLI3 может непосредственно взаимодействовать с HOXD белками (Chen et al., 2004). Это очень интересная гипотеза, т.к. это создает иерархическую связь между свойствами экспрессии Hand2/Gli3 и активностью Hoxd по формированию паттерна. Роль наиболее 5' Hoxd генов д. тонко контролировать локализацию транскриптов Shh после того, как зачаток конечности разделяется на крупные части за счет антагонистических активностей Hand2 и Gli3.
Затем Shh регулирует экспрессию Hoxd генов двумя способами: во-первых, путем поддержания экспрессии Shh после того, как она инициируется; во-вторых, путем предупреждения в задней части образования Gli3? который является негативным регулятором транскрипции Нох генов (Рис. 2А; Wang et al., 2000; Litingtung et al., 2002; te Welscher et al., 2002b). В самом деле, эктопическая экспрессия Shh впереди ведет к экспрессии в передней части генов Hoxd (Riddlr et al., 1993). Следовательно, паттерн формирующая активность Shh может быть обеспечена, частично, генами Hoxd.
Role of Tbx genes in specification of more posterior identity. Tbx гены кодируют Т-box транскрипционные репрессоры. Они выполняют несколько функций в развитии конечностей. Tbx4 и Tbx5 играют кардинальную роль в инициации выроста конечности. Более тогоTbx5 специфически экспрессируется в поле передней конечности, а Tbx4 задней и гены, как предполагаются специфицируют качественные особенности передних и задних конечностей (rew. Logan, 2003). Эти находки, однако, не подтверждены экспериментами, демонстрирующими смену экспрессии между Tbx4 и Tbx5 в передних конечностях (Minguillon et al., 2005)/ В этих условиях Tbx4, который, как было показано, специфицирует качественные особенности задних конечностей, поддерживает образование правильных нормальных передних конечностей. Напротив, Ptx1? ген, обычно экспрессирующийся специфически на территории задних конечностей, может частично трансформировать передние конечности в задние, если экспрессируется эктопически, и остается наилучшим кандидатом на спецификацию качественных особенностей задних конечностей.
Первоначально Tbx2 и Tbx3 широко экспрессируются в латеральной пластинке. Затем подобно Hand2 их паттерны становятся всё более ограниченными в зачатке конечности. Оба гена формируют две полоски экспрессии, переднюю и заднюю, в проксимальной части мезенхимы конечности. На курах было продемонстрировано, что задняя полоска является менее лабильной, чем передняя и ведет себя клеточно-автономно в экспериментах с эктопическими трансплантациями (Tumpel et al., 2002). В презумптивном autopod Tbx2 экспрессируется позади презумптивного пальца 5, в то время как Tbx3 экспрессируется позади презумптивных пальцев 4 и 5 (Gibson-Brown et al., 1996, 1998; Tumpel et al., 2002; Suzuki et al., 2004).
Оба гена экспрессируются раньше, чем Shh и Bmp2 и могут также регулировать экспрессию Shh. Более того, у кур неправильная экспрессия Tbx2 ( но не Tbx3) индуцирует сдвиг кпереди домена Shh, в то время как доминантная активная форма Tbx2 (VP16ΔTbx2) репрессирует экспрессию Shh, следовательно, можно предположить, регулирует передачу сигналов Shh (Suzuki et al., 2004). Сходным образом с Hand2 и Hoxd11-13 Tbx2 может затем индуцироваться с помощью Shh, как только он будет активирован (Gibson-Brown et al., 1998). Напротив, у мышей Tbx3, по-видимому, более важен, чем Tbx2 в активации Shh. Более тяжелый фенотип Tbx3 мышей очень сходен с нулевой мутацией Shh, он представлен единственной косточкой zeugopod и единственным пальцем (Davenport et al., 2003). Было установлено, что Tbx3 может сдвигать позицию передних конечностей кпереди вдоль ростро-каудальной оси у кур (Rallis et al., 2005). Поразительно, неправильная экспрессия Hand2, Gli3 и Shh находится среди первых событий, наблюдаемых далее, указывая тем самым, что Tbx3 стоит иерархически выше в каскаде генной экспрессии, участвующем в АР поляризации конечности. Tbx2 мутации, с др. стороны, приводят к бифуркации пальца 4 (Harrelson et al 2004). Эта находка может быть больше связана с ролью Tbx2, а Tbx3 играет роль в локальном морфогенезе пальцев ниже межпальцевой передачи сигналов BMP (Suzuki et al., 2004).

BYOND SHH; TRANSLATING OF THE PATTERNING OF THE LIMB INTO DIGIT MORPHOLOGY


HoxD Cluster: An Intrinsic Determinant of Limb Cell Fate?


HoxD кластер играет главную роль в формировании пальцев в сочетании с генами паралогами кластера HoxA. Систематическая инактивация генов показала, что наиболее 5' гены кластера (Hoxd12, Hoxd13) участвуют в этом процессе, тогда как Hoxd11 необходим для формирования паттерна zeugopod, a Hoxd9 stylopod (rev. Capecchi, 1996; Favie, Dolle, 1997; Zakany, Dubole, 1999). Наиболее привлекательны доказательства, которые подтвержают участие Hoxd11-13 в формировании паттерна пальцев получены при одновременной инактивации Hoxd11,12 и 13. Такая инактивация приводит к полидактилии, ассоциированной с укорочением и дисморфологией пальцев. Если эти мутации кроме того ассоциированы с гомозиготной нехваткой Hoxa13, то конечности. которые формируются, полностью лишены пальцев (Zakany, Dubole, 1999).
Благодаря работам из Лаб. Dubole наше понимание регуляции экспрессии Hoxd генов в конечностях заметно продвинулось (Kmita et al., 2002; Spitz et al., 2003; Tarchini, Dubole, 2006). Делеционно/дупликационная стратегия (Herault et al., 1998) позволила сделать различия между регуляторными событиями, которые имеют место на уровне индивидуальных промоторов, и теми, которые используют общие регуляторные элементы с каждой из сторон кластера. Хотя большая часть исследований проведена на передних конечностях, они без сомнения приложимы и к задним конечностям (rev. Kmits, Dubole, 2003; Freitas, Cohn, 2006).
Как мы видели выше, на ранних стадиях экспрессия Hoxd генов инициируется и регулируется двумя регуляторными элементами вне кластера, один на 3', a др. на 5' конце кластера (Рис. 4А). Экспрессия, которая индуцируется в зарождающейся почке конечности, является критической для экспрессии Shh. Кроме того, паттерн экспрессии, который генерируется с помощью этого механизма, сдвигается по ходу развития за счет влияния роста конечности и становится ассоциированным с презумптивной областью zeugopod (Tarchini, Dubole, 2006). Формирование домена zeugopod затем не нуждается в регуляторных механизмах, отличных от тех, что работали при установлении ранних паттернов зачатков передних конечностей. С инициального паттерна экспрессии Hoxd11-Hoxd13 эти находки могут объяснить, как Hoxd11 приобретает свою выдающуюся важность в формировании паттерна zeugopod.
Позднее (с Е10.5) домен экспрессии активируется с 5' регуляторных последовательностей, пальцевого энхансера, который расположен внутри Global Control Region (GCR) кластера Hoxd (Рис. 4В); Spitz et al., 2003). Это приводит к экспрессии 5' Hoxd генов в задне-дистальном домене, который представляет собой презумптивную территорию пальцев. Используя набор делеций и дупликаций Kmita et al., (2002) показали, что хотя инактивация Hoxd13 и не затрагивает паттерна экспрессии Hoxd12, но делеция Hoxd13 приводит к адаптации геном Hoxd12 паттерна экспрессии Hoxd13. То же самое верно и для более 3' делеций, которые приводят Hoxd11 в позицию Hoxd13, наделяя тем самым Hoxd11 паттерном экспрессии Hoxd13. Следовательно, перемещение гена относительно 5' конца кластера достаточно, чтобы вызвать в нем специфический паттерн экспрессии, демонстрируя тем самым, что GCR осуществляет свою активность в зависимости от расстояния. Этот регуляторный элемент активирует преимущественно Hoxd13, а затем и гены, расположенные ближе к 3', с уменьшающейся эффективностью. Его эффект обычно не простирается дальше Hoxd9 (Рис. 4В). Однако, соотв. делеция может приводить к активации Hoxd8, демонстрируя тем самым, что пальцевой энхансер слабо зависит от промотора (Tarchini, Dubole, 2006).
Поэтому кажется, что глобальный паттерн экспрессии Hoxd генов является результатом двух волн активации. Первая волна от 3' элемента (ELCR), который обеспечивает временную колинеарность, как функцию расстояния, тогда как 5' локализованный элемент (POST, Рис. 4В) прогрессивно ограничивает экспрессию наиболее 5' генов, Hoxd9-Hoxd13, более задними доменами. Вторая волна индуцирует задне-дистальный домен, который составляет презумптивную территорию пальцев, только Hoxd9-Hoxd13 генов (Tarchini, Dubole, 2006). Комбинация этих двух разных фаз и дает кажущуюся (виртуальную) колинеарность, создавая задне-дистальный гнездовой паттерн, который стал эмблемой экспрессии генов Hoxd с момента открытия (Dolle et al., 1989). Она также объясняет сложную эволюцию этого паттерна в ходе развития (Nelson et al., 1996).
Регуляторные механизмы, которые управляют экспрессией генов Hoxd, безусловно играют главную роль в формировании паттерна пальцев. Однако, связь между экспрессией специфических генов и фенотипом пальцев, формируемом благодаря этому паттерну экспрессии, всё ещё непонятна. Очевидно. что некоторые из Hoxd белков функционально сходны, тогда как др. нет. Напр., делеция Hoxd13 ведет к очень слабому фенотипу из-за того, что Hoxd12 смещается и воспринимает паттерн экспрессии, характерный для Hoxd13 и может функционально замещать Hoxd13. Сходное смещение Hoxd11 ведет к его экспрессии, подобной Hoxd13. Это, однако, индуцирует зрелищную полидактилию, ассоциированную со слиянием пальцев и задержкой оссификации (Kmita et al., 2002). Этот эффект избыточности функции Hoxd11 объясняется с помощью др. свойства кластера HoxD, а именно, posterior prevalence, с помощью которого функциональная супрессия обычно затрагивает Hoxd13-Hoxd11 (van der Hoven et al., 1996; Goff, Tabin, 1997). Это тем самым демонстрирует, что белки в кластере не являются взаимозаменяемыми и что их уровень и домен экспрессии, а так же коэкспрессия с др. Hoxd белками, являются критическими для собственно формирования паттерна конечностей. Влияние альтераций Нох генов на клеточную физиологию является очень важным вопросом, который только начинают исследовать. Среди наиболее успешных исследований, Bullet и Capecchi (2004) показали, что дефекты zeugopod, ассоциированные с нокаутом паралога Hox11, возникают довольно поздно в развитии. Они затрагивают дефекты в созревании хряща и неспособность формировать ростовые пластинки на проксимальном и дистальном концах zeugopod костей. Такого типа работы указывают направление будущим исследованиям. Учитывая очень высокий комбинаторный потенциал кластеров, таких как HoxD, необходимы обширные исследования для установления морфогенетических правил, ассоциированных с экспрессией и регуляцией Hoxd генов.

Bmp and Tbx: Local Cues for Morphogenesis


Итак, хотя формирование паттерна зачатка конечности происходит на довольно ранних стадиях, морфогенез зачатков пальцев остается лабильным вплоть до конденсации хрящей, в противоположность предсказаниям гипотезы позиционной информации, согласно которой различные скелетные элементы неэквивалентны с момента своего зарождения. Dahn, Fallon (2000) сообщили о серии элегантных микрохирургических манипуляций на зачатках конечностей кур, которые продемонстрировали, что качественные особенности пальцев не являются фиксированным свойством зачатков пальцев. Эти данные указывают на то, что инициальное формирование паттерна поля конечности, заложено в межпальцевой мезенхиме, с которой он и управляет, после того как сформированы зачатки пальцев, их морфогенезом. Эксперименты продемонстрировали преимущества в вычленении различий в количестве и форме фаланг разных пальцев autopod конечностей кур: палец 1 имеет две фаланги, палец 2 - три, палец 3 - четыре и палец 4 - пять. Простое деление пополам зачатков пальцев с использование барьеров из фольги на стадии, когда зачаток уже сконденсирован, ведет к изменению качественных особенностей передней половины в половину более переднего пальца (напр., рассеченный палец 2 давал палец 1 спереди и палец 2 взади). Эти находки указывают на роль межпальцевой мезодермы (interdigit, ID) в предписании каждому пальцу специфической формы. В самом деле, любая манипуляция, которая изменяет взаимосвязь между пальцами и соседней ID, изменяет форму пальцев, указывая тем самым, что межпальцевая мезенхима диктует качественные особенности пальца, расположенного впереди её. Shh, высвобождаемый в межпльцевой промежуток, ведет к сходной постеризации двух соседних пальцев путем модификации уровней Bmp. Было постулировано, что уровень Bmp в любом ID влияет на соседний передний зачаток. Т.к. количество фаланг зависит от передачи сигналов Fgf из апикального эктодермального гребня (Sanz-Ezquerro, Tickle, 2003), то д. существовать взаимозависимость в регуляции экспрессии Fgf, Bmp и генов антагонистов Bmp, которые тонко настраивают уровень передачи сигналов Bmp.
Уровень активности Bmps, по-видимому, регулируется с помощью Tbx2 и Tbx3 транскрипционных факторов. Tbx2 и Tbx3 экспрессируются в наиболее задних межпальцевых промежутках. Suzuki et al., (2004) продемонстрировали, что повсеместная экспрессия Tbx3 (который обычно экспрессируется позади последних двух пальцев, пальца 4 и пальца 3) в зачатках конечностей кур достаточна для изменения качественных особенностей пальца 2 в палец 3, в то время как в тех же самых условиях, Tbx2 (обычно экспрессируемый позади пальца 4) респецифицирует палец 2 в палец 3, а палец 3 в палец 4, соотв. Более того, имплантация Noggin-высвобождающего кусочка в межпльцевой промежуток 3, напр., ведет к изменению соседнего пальца 3 в палец 2 (Dahn, Fallon, 2000), но это изменение устраняется при одновременной и повсеместной экспрессии Tbx2. Сходные результаты наблюдались с Tbx3, показавшие, что Tbx2 и Tbx3 действуют иерархически выше в межпальцевых промежутках относительно передачи сигналов Shh и Bmp, чтобы обеспечить специфическую форму пальцев.
Эти интригующие наблюдения далеки от подтверждения с помощью независимой стратегии у мышей. Некоторые трансгенные линии мышей сконструированы, в которых экспрессия Noggin управляется в конечностях (Guha et al., 2002; Plikus et al., 2004; Wang et al., 2004). У всех из них, однако, экспрессия имела место в эктодерме, а не в мезодерме. Эти находки привели, тем не менее к бифуркациям и дупликациям, но не могут быть интерпретированы как трансформации качественных особенностей пальцев. Кроме того, имеется прирожденная трудность с мышами, у которых форма пальцев не столь четко отлична, как у кур. Экспрессия Tbx2 и Tbx3 для наиболее задних пальцев, экспрессия Hoxd11-12 для пальцев 2-5 (и следовательно, для пальца 1, который единственный не экспрессирует этих Нох) д. использоваться в качестве маркеров качественных особенностей, по крайней мере, некоторых пальцев, учитывая, что последние экспрессируются в пальцевых лучах после их конденсации. Tbx2 and Tbx3 регуляторные последовательности, среди прочего, могут быть использованы для нахождения мишеней, среди соотв. транс-генов, для выявления экспрессии Bmp агонистов и антагонистов в мезенхиме специфических межпальцевых промежутков, вызывающих изменения качественных особенностей пальцев.

PERSPECTIVES


From the data summarized in this review, several points emerge. Of the novel observations, the most striking is that AP patterning by Shh involves primarily a considerable expansion of the descendants of Shh-expressing cells and a limited diffusion of the Shh protein. From these data, it appears that a secondary morphogen that would diffuse over a large distance throughout the limb field is unlikely to be required.
They further suggest that the limb field is partitioned into two broad domains at an early stage before the digit primordia condensate. Anteriorly, cells that will give rise to digit 1 do not express Hoxdll or Hoxdl2 and are independent of Shh for their formation. Posteriorly, all structures are dependent on Shh for their formation. In the Shh mutant, all digits but digit 1 fail to form, indicating that, in addition to specifying digits 5 to 2 likely through a graded influence, Shh has an all or none effect on survival of posterior mesenchyme. Indeed, the target field of Shh, evaluated by histochemistry or activation of target genes, covers roughly half of the limb bud at E10.0 (Lewis et al., 2001). The initial partition may be governed by the antagonism between Gli3R and Hand2, which form complementary domains in the early limb bud. An appealing and testable hypothesis is that anterior and posterior cells would clonally derive from these two broad domains. Cells posteriorly would then proliferate to a considerable extent to provide most of the autopod structures. Although it is clear that Shh is a major determinant for the posterior identity in the limb, it remains to be determined which are the factors that specify the anterior identity, provided this is not a default identity. A high level of the repressor form of Gli3 (Gli3R) characterizes anterior territories, which may be a clue for their specification. Noticeably, these are precisely the regions that are absent in the Msxl:Msx2 double mutant, suggesting a role for Msx genes in anterior specification (Lallemand et al, 2005).
Although patterning of the limb appears to be an early event, morphogenesis of the specific digits remains labile until after they have condensed (Dahn and Fallon, 2000). It should be noticed that, due to the lack of molecular markers in this analysis, it is not possible to decide whether the identity is changed because of a respecification of digit-associated expression programs or by local changes in cell metabolism (proliferation, apoptosis), which would lead to the acquisition of a shape characteristic of another digit. As described, Tbx2-3 and Hoxdll-12 expression could be used to discriminate between these two possibilities. This aspect awaits further, independent confirmation using mouse genetics.
Taken together, these results sustain the reflection about the issue thoroughly discussed by Shubin and Alberch (1986) on whether digits have an identity of their own, thereby allowing for homology analysis among species. They raised the issue of whether the information for digital identity is encoded in some way in the vertebrate genome or is the product of a small set of developmental rules acting on an integrated developmental limb field. Shubin and Alberch's conclusion, that "the development of the limb is the product of a combination of global organizers (...) and local interactions that characterize the process of chondrogenesis" appears remarkably prescient in view of the data gathered here. It would justify further analyses throughout vertebrate species to evaluate conservation and variation in the patterning mechanisms that have been identified in the chick as well as the mouse, with their relation to morphology.
Another issue of importance is the identification of regulatory sequences for Shh, located 1 Mb upstream of the coding sequences. This identification would have been nearly impossible were it not for the power of mouse forward genetics, associating point and insertional mutations. This strategy unambiguously identifies a Shh enhancer together With specific molecular alterations that point at critical regulatory sequences. It should lead to the identification of the regulatory factors that drive expression of Shh in the posterior mesenchyme. This question too has been pending for the past decades. In 1991, Horn-bruch and Wolpert (1991) reported a dedicated analysis of the evolution of the polarizing activity that rises in the flank to become localized to the posterior aspect of the limb bud. Strikingly, expression of Hand2 parallels the evolution of the polarizing activity, which should be investigated further. This determination would bring us one step earlier in the chain that leads to formation of the ZPA. However, ZPA formation must be explained in fine by a generator of positional identity in the limb independent of pre-existing local cues. This might be the HoxD cluster, because Hox clusters are en-dowed of intrinsic properties to gen-erate patterns along the rostro-caudal axis (Deschamps and van Nes, 2005). However, the current hypothesis is that 5' Hoxd genes are repressed anteriorly by GH3R (Tarchini and Duboule, 2006). Alternatively, the localization of the ZPA may depend on a mechanism similar to the localization of the limbs themselves. We know now that limb initiation depends on the local production of Fgfs in the lateral plate mesoderm (Cohn et al., 1995; reviewed in Ohuchi and Noji, 1999). This finding is likely triggered by a signal coming from the paraxial mesoderm, as proposed initially by Madeleine Kieny (Kieny, 1969) as well as Madeleine Pinot (Pinot, 1970) and reinvestigated by Trent Stephens (Stephens et al., 1991). Ten years ago, Fgf8 was proposed to be the relay that transfers positional information from the paraxial mesoderm to the presumptive limb field (Crossley et aL, 1996). This finding, however, has not been confirmed (Fernandez-Teran et al., 1997), and the signal remains to be identified. We may be confident that these questions are within our grasp. Mouse genetics, as we have seen, complements very efficiently the power of experimental embryology in the chick, and we should get further insight into new functions involved in limb patterning with the advances of forward genetics in the mouse (Anderson, 2000). Noticebly, these have already produced remarkably results for the Shh signaling pathway (Huangfu et al., 2003).
Сайт создан в системе uCoz