Tamara A. Franz-Odendaal, Brian K. Hall, P. Eckhard Witten Developmental Dynamics
Volume 235, Issue 1,
During osteogenesis, osteoblasts lay down osteoid and transform into osteocytes embedded in mineralized bone matrix. Despite the fact that osteocytes are the most abundant cellular component of bone, little is known about the process of osteoblast-to-osteocyte transformation. What is known is that osteoblasts undergo a number of changes during this transformation, yet retain their connections to preosteoblasts and osteocytes. This review explores the osteoblast-to-osteocyte transformation during intramembranous ossification from both morphological and molecular perspectives. We investigate how these data support five schemes that describe how an osteoblast could become entrapped in the bone matrix (in mammals) and suggest one of the five scenarios that best fits as a model. Those osteoblasts on the bone surface that are destined for burial and destined to become osteocytes slow down matrix production compared to neighbouring osteoblasts, which continue to produce bone matrix. That is, cells that continue to produce matrix actively bury cells producing less or no new bone matrix (passive burial). We summarize which morphological and molecular changes could be used as characters (or markers) to follow the transformation process.
Известно, что остеоциты происходят из остеобластов (Gegenbauer, [1864]). Остеобласты (кость формирующие клетки) мезенхимного происхождения, они секретируют не-минерализованный костный матрикс (osteoid) и в конечном итоге включаются в виде остеоцитов в минерализованный косный матрикс. Остеоциты наиболее многочисленный компонент костей млекопитающих, составляющий до 95% от всех костных клеток (20,000 до 80,000 клеток на mm3 костной ткани) , которые покрывают 94% всей костной поверхности (Frost, [1960]; Marotti, [1996]); имеется примерно в 10 раз больше остеоцитов, чем остеобластов в индивидуальных костях (Parfitt, [1990]). У людей, остеоциты могут жить долго. Frost ([1963]) подсчитал средний период полу-жизни человеческих остeоцитов равным 25 годам. Однако, если мы будем рассматривать общую скорость ремоделирования кости в 4 - 10% в год (Delling and Vogel, [1992]; Manolagas, [2000]), то жизнь большинства остеоцитов может быть короче (Marotti et al., [1990]). Более того, продолжительность жизни остеоцитов существенно превосходит таковую активных остеобластов, которая определена только в 4 мес. в костях людей (Manolagas, [2000]) и 10-20 дней в альвеолярной кости мышей (McCulloch and Heersche, [1988]). Остеоциты общаются др. с др и с клетками на костной поверхности посредством сети клеточных отростков, которые проникают через canaliculi в костном матриксе (Palumbo et al., [1990]). Т.о., костные клетки формируют функциональную сеть, внетри которой клетки всех стадий формирования кости от преостеобластов до зрелых остеоцитов остаются взаимосвязанными.
Литература сталкивает нас удивительным количеством терминов, связанных с переходом от остеобластов к остеоцитам, такими как osteocytes are encased in mineralized matrix (Holtrop, [1990]); osteoblasts are buried within the bone matrix (Manolagas, [2000]); and osteoblasts merge progressively into the bone matrix (Meunier, [1989]). Несмотря на большое количество различных фраз, которые используются для описания этого процесса, фундаментальный вопрос, как остеобласты оказываются замурованными, остается в основном без ответа. Это может быть связано с тем фактом, что большинство исследователей костных клеток, сконцентрировались на остеобластах и остеокластах. В электронной базе данных (WebOfScience) используя поиск по ключевым словам osteoblast*, osteocyte* и osteoclast*, выясняется, что в течение последних 30 лет менее 5% публикаций упоминало osteocyte*, хотя этих работ становится всё больше.
25 лет тому назад Knese ([1979]) предположил два возможных механизма захвата остеобластов: (1) само-замуровывание или (2) вмуровывание с помощью соседних клеток. Мы исследуем трансформацию путем оценки и синтеза знаний о механизме(ах), с помощью которых остеобласты внедряются в костный матрикс. Мы исследовали разные того, как остеобласты могут превращаться в остеоциты и обсуждаем морфологические и молекулярные маркеры, которые могут быть важными для изучения процесса трансформации. Наконец, мы предлагаем модель трансформации остеобластов в остеоциты во время формирования внутримембранозной кости у млекопитающих и мы подчеркиваем, что не существует единственного механизма трансформации остеобластов в остеоциты, т.к. существуют разные механизмы в разных костях, при разных типах формирования кости, в разных позициях в кости и у разных видов позвоночных.
MODES OF OSSIFICATION
Как остеобласты трансформируются в остеоциты зависит от способа оссификации - intramembranous, perichondral, endochondral (см. Hall and Witten, [2005] в отношении др. способов формирования кости) - и типа кости, который д. быть сформирован (переплетенная (woven) или пластинчатая (lamellar) кость). Это может также зависеть от места формирования кости, от вида и возраста и/или пола индивида.
Во время внутримембранозного образования кости мезенхимные клетки дифференцируются в остеобласты, а кость формируется без замещения хрящевой модели. Кости, которые образуются таким способом, называются мембранными (membrane) костями. Оссификация надхрящницы наиболее распространенный способ формирования кости, если присутствует хрящевой предшественник. Перихондральная оссификация обычно начинается с трансформации надхрящницы в надкостницу (Scott-Savage and Hall, [1980]).
Найденная у большинства групп позвоночных эндохондральная оссификация обычно исследовалась на длинных костях позвоночных. Эндохондральная оссификация использует хрящевую матрицу, которая замещается или ремоделируется в кость с помощью процесса, который может включать кальцификацию хрящевого матрикса, гипертрофию хондроцитов , сопровождаемую апоптозом или трансдифференцировкой хондроцитов в остеобласты (в некоторых длинных костях), резорбцию кальцифицированного хряща, рекрутирование остеобластов и отложение woven кости (а позднее и lamellar кости) на поверхности остатков минерализованного хряща (Roach, [1990], [1992]; Thesingh et al., [1991]; Gerstenfeld and Shapiro, [1996]; Buxton et al., [2003]; Eames et al., [2003]). У развитых костистых рыб (Acanthomorpha примерно с 16,000 видов), intramembranous, perichondral и endochondral образование костей дают в результате кости, которые не содержат остеоцитов и, как известно, являются костями не содержащими клеток (Witten and Huysseune, [2005]). Кости менее развитых рыб и тетрапод содержат остеоциты, а также кости содержащие клетки (Witten et al., [2001]; Witten and Hall, [2003]). Образование костей, не содержащих клеток, включает отложение osteoid и костного матрикса, но они не заключают в себя остеобласты (Ekanayake and Hall, [1988]).
Костные элементы могут возникать посредством дополнительных и менее распространенных способов оссификации. Кость может формироваться с помощью метаплазии из др. типов тканей и многие ткани обладают способом образования, который дает в результате структуры, нечто среднее между дентином и костью или между костью и (Orvig, [1951]; Huysseune and Verraes, [1990]; Hall, [2005]; Vickaryous and Olson, [2005]; Witten et al., [2005]). Эти промежуточные способы образования кости не будет здесь обсуждаться, см. Beresford ([1981], [1993]), Hall ([1990], [2005]), Taylor et al. ([1994]), Witten and Hall ([2002]), Hall and Witten ([2005]).
OSTEOBLAST FATES AND FUNCTIONS
Остеобласты участвуют в минерализации костного матрикса (rev. Boskey, [1996]). В конце фазы формирования кости остеобласты могут иметь одну из 4-х судеб: (1) оказываются вмурованными в кость в качестве остеоцитов, (2) трансформируются в неактивные остеобласты и станосятся кость-выстилающими клетками, (3) подвергаются запрограммированной клеточной гибели (апоптозу) или в некоторых ситуациях (4) трансдифференцируются в клетки, которые откладывают chondroid или chondroid кость (Manolagas, [2000]; Noble et al., [1997]; Jilka et al., [1998]; Li et al., [2004]).
Пропорция остеобластов, следующих по каждому из этих путей не одна и та же у разных млекопитающих и не законсервирована среди всех таксонов или всех типов костей. Parfitt ([1990]) сообщил, что у людей в решетчатых (cancellous) костях 65% остеобластов подвергаются апоптозу и только 30% трансформируются в остеоциты. Aubin and Liu ([1996]) дали картину в 10-20% для количества остеобластов, трансформирующихся в остеоциты. Banks ([1974]) подсчитал, что 10% остеобластов трансформируется в остеоциты в оленьих рогах бело-хвостых оленей (Odocoileus virginianus). В продвинутых костях рыб, не содержащих клеток, количество остеобластов, которые превращаются в остеоциты, естественно равно нулю (Ekanayake and Hall, [1987]; Witten et al., [2004]).
Возраст животных также может оказывать влияние на количество остеобластов, которые трансформируются в остеоциты. В трабекулярных костях стареющих гончих количество клеток, выстилающих кость, снижается (Miller et al., [1980]) указывая тем самым, что или меньше остео-предшественников дифференцируется в остеобласты (т.e., имеется меньший пул остеобластов) или что пропорция клеток, следующих каждой онтогенетической судьбе изменяется.
Будучи внедрены в костный матрикс бывшие остеобласты теперь становятся остеоцитами и снижают свою активность. Важной ролью остеоцитов и их сети клеточных отростков является их функция в качестве сенсоров растяжений (strain) и давлений (stress), сигналы о чем очень важны для поддержания структуры кости (see Burger et al., [2003]; Knothe Tate et al., [2004], among others). Остеоциты общаются с соседними остеоцитами и с клетками на поверхности кости посредством сети клеточных отростков, которые располагаются внутри canaliculi в костном матриксе (Palumbo et al., [1990]) (Fig. 1). Т.к. устанавливается перекрестное общение между остеобластами (bone deposition) и остеокластами (bone resorption) (Lacey et al., [1998]; Yasuda et al., [1998]) то существует также вероятность взаимного общения между остеоцитами и остеокластами (Burger et al., [2003]). Т.о., функциональная сеть костных клеток, которая распространяется от preosteoblast до зрелых остеоцитов является важной для поддержания интеграции кости как ткани.
Рис.1. | Diagram showing the transitional cell types between preosteoblasts and osteocytes during osteoblast transformation and their relationships to one another during the second phase of intramembranous ossification (i.e., when transformation occurs). The diagram is not to scale. The preosteoblast (1) layer consists of proliferating cells. Gap junctions are present between all cells for direct communication. Enlargement shows gap junction between the cell process of an osteocyte and an embedding osteoblast. Arrow indicates osteoid deposition front; arrowhead indicates mineralization front. During the transformation process, cellular organelles decrease and the total cell body volume decreases substantially. 1. preosteoblast, 2. preosteoblastic osteoblast, 3. osteoblast, 4. osteoblastic osteocyte (Type I preosteocyte), 5. osteoid-osteocyte (Type II preosteocyte), 6. Type III preosteocyte, 7. young osteocyte, 8. old osteocyte. Diagram drawn by Tim Fedak (http://www.figs.ca/).
Др. функцией замурованных остеобластов (остеоцитов) в сети костных клеток является способность некоторых остеоцитов откладывать и резорбировать кость в лакуне остеоцита, в которой он хозяйничает, тем самым изменяется форма лакуны. Этот процесс называется osteocytic osteolysis, часто рассматривается как нехарактерный для остеоцитов человека, но доакзательства его существования обнаружены во многих видах млекопитающих, таких как летучие мыши (Doty and Nunez, [1985]; Kwiecinski, [1985]; Kwiecinski et al., [1987]), хомячки (Steinberg et al., [1981]), белки (Haller and Zimny, [1978]), крысы (Be'langer, [1977a]; Tazawa et al., [2004]); кролики (Zhang et al., [2000]), змеи (Alcobendas et al., [1991]), угри (Lopez et al., [1980]), лосось (Hughes et al., [1994a]), carp (Witten et al., [2000]) и неидентифицируемые Cretaceous рептилии (Be'langer, [1977b]). Остеоцитический остеолиз может быть ограничен ситуациями, такими как лактация, зимняя спячка или беременность, для которых необходима мобилизация минералов из скелета (see Haller and Zimny, [1978]; Steinberg et al., [1981]; Kwiecinski, [1985]; Hall, [2005]).
THE CELLS INVOLVED
Многие исследователи рассматривают процесс трансформации с использованием трех типов клеток: преостеобласты дифференцируются в остеобласты, которые залавливаются в качестве остеоцитов. Все согласны, что трансформация осуществляется в виде ряда морфологических изменений, таких как уменьшение размера клеточного тела, увеличение клеточных отростков и изменение внутриклеточных органелл (Marotti, [1977]; Palumbo, [1986]; and see Knothe Tate et al., [2004] for a recent review). Palumbo ([1986]) подсчитали общее уменьшение объема клеточного тела в 70% между стадией остеобластов и остеоцитов. Мы впервые описали более подробно клеточные типы и обсуждаем промежуточные типы клеток, которые может предположить.
Обычно различают три типа остеобластов на костной поверхности, исходя из функции и морфологии: преостеобласты, активные остеобласты и неактивные (покоящиеся) остеобласты (Holtrop, [1990]). Преостеобласты млекопитающих были описаны как менее кубоидальные по форме, чем активные остеобласты. Они располагаются на расстоянии от костной поверхности, не откладывают костный матрикс и всё ещё может делиться (Fig 1).Преостеобласты уже продуцируют молекулы предшественники коллагена типа I, которые после пост-трансляционной модификации собираются в коллагеновые фибриллы (Manolagas, [2000]). Ряд кость-специфических маркеров уже экспрессируются преостеобластами, а именно osteonectin, alkaline phosphatase, некоторые IGFs, hXBP-1, TIMP, tenascin C, EGF-R, IL-6, PTH/PTHrP рецепторы, некоторые integrins и periostin (osf2) (Table 1). Преостеобласты дифференцируются в активные секретирующие костный матрикс остеобласты, которые обычно кубовидные по форме (у млекопитающих) и безусловно ответственны за отложение органического костного матрикса.
Table 1. Molecular Markers (mRNA, protein) Involved During Endochondral (EC) and Intramembranous (IM) Ossificationa
Смотреть в
Остеобласты обладают крупными эксцентричными ядрами с 1-3 ядрышками и выраженными областями RER (rough endoplasmic reticulum) и Гольджи. Они выпячивают клеточные отростки или псевдоподии в направлении пласта остеоида (Palumbo, [1986]) (Fig. 1), они не делятся и могут быть отличены от преостеобластов благодаря активации сюиты клеточных маркеров, главными из которых являются костные sialoprotein, osteocalcin, E11, BMP-R1, vitamin D3 receptor, vitronectin, thrombospondin, decorin, several BMPs, и, конечно, collagen type I (Table 1).
Многие исследователи сообщили о чрезвычайной гетерогенности паттернов экспрессии генов и белков остеобластами (Aubin et al., [1992], [1993]; Heersche et al., [1992]; Chen et al., [1993]; Ikeda et al., [1995]; Liu et al., [1997]; Candaliere et al., [2001]) (Table 1). Напр., у взрослых крыс в культуре стромальных клеток костного мозга соседние остеобласты, которые кажутся идентичными морфологически, экспрессируют очень разные уровни остеобласт-ассоциированных маркеров, таких как osteocalcin, osteonectin (SPARC) и galectin-3 (Malaval et al., [1994]). Эта гетерогенность не рассматривается как результат стадии клеточного цикла и она всё ещё присутствует, когда анализ ограничивается пост-пролиферативными остеобластами (Liu et al., [1997]). Недавнее исследование остеобластов из свода черепа 21-дневных плодов крыс, которые несмотря на то, что все клетки выглядят гистологически одинаковыми, единственными маркерами, экспрессируемыми всеми остеобластами, независимо от их положения в своде черепа, были щелочная фосфатаза и pth/pthrp рецепторы (Candeliere et al., [2001]) (Table 1). Оба маркера экспрессируются также преостеобластами, хотя их уровни ниже в преостеобластах, чем в остеобластах (для pth/pthrp рецептора) и не обнаруживаются выше фоновых значений в остеоцитах. Др. маркеры остеобластов (osteocalcin, msx-2, c-fos, parathyroid hormone-related protein) дифференциально экспрессируются как на уровне мРНК, так и белка в субнаборах остеобластов в зависимости от их локализации или среды внутри свода черепа (Candeliere et al., [2001]). Все маркеры, протестированные в этом исследовании, присутствуют в пост-пролиферативных клетках, так что клеточный цикл не может объяснить паттерны дифференциальной экспрессии. Анатомические места, онтогенетический возраст, вид и способ оссификации могут влиять на профили экспрессии генов остеобластов (Heersche and Aubin, [1990]; Aubin et al., [1993]; Gehron Robey et al., [1993]; Liu et al., [1997]). Candeliere et al. ([2001]) также установили, что преостеобласты и остеоциты дифференциально экспрессируют репертуар генов.
Т.к. отложение костного матрикса продолжается, то остеобласты оказываются вмурованными в клеточный секреторный продукт, остеоид. Клетки на этой ранней стадии дифференцировки остеобластов в остеоциты были названы крупными остеоцитами, молодыми остеоцитами или osteoid-osteocytes (Baud, [1968], Semba et al., [1966]). Эти клетки более крупные, чем зрелые (старые) остеоциты и имеют хорошо развитый аппарат Гольджи для хранения коллагена. При transmission electron microscope коллагеновые фибрилы могут быть видны окружающие эти матрикс-продуцирующие клетки (Hancox and Boothroyd, [1965]).
В ходе минерализации остеоида ультраструктура остеоцитов подвергается дальнейшим изменениям, редукции ER и аппарата Golgi, чтобы снизить белковый синтез и секрецию (Dudley and Spiro, [1961]). Теперь большинство из ранее экспрессируемых костных маркеров подавляется или выключается в остеоцитах (напр., osteocalcin, bone sialoprotein, collagen type I, alkaline phosphatase, IGFs, integrins, periostin и др.) (Table 1). В некоторых исследованиях было показано, что в зависимости от типа формируемой кости, активности и размеров детерминированных остеобластов, вновь вмурованные остеоциты могут быть разными по размеру и форме по сравнению с более старыми, более зрелыми остеоцитами, уже внедренных в костный матрикс (Boyde, [1980]; Marotti et al., [1990]). Более того, форма вмурованных остеоцитов может зависеть от типа кости. Напр., в woven кости, которая откладывается быстро со случайно ориентированными коллагеновыми волокнами, остеоциты одинаковы в диаметре (Currey, [2003]). В lamellar кости, однако, которая откладывается более медленно, остеоциты уплощены и сплющены по своей короткой оси, параллельной толщине пластинок (lamella) (Currey, [2003]). Зрелые остеоциты в конце концов оказываются внутри лакун в костном матриксе, они имеют звездчатую форму и длинные клеточные отростки (Fig. 1).
The Transitional Cell Stages
Т.к. остеоциты происходят из остеобластов, то переходные клеточные стадии между дифференцированными остеобластами и остеоцитами д.б. обнаружимы на базе морфологических и молекулярных характеристик (Fig. 1, Table 1).
Некоторые авт. различают промежуточные или переходные стадии между остеобластами и остеоцитами, а именно, osteoid-osteocytes (Palumbo, [1986]), osteocytic osteoblasts (Nijweide et al., [1981]), or preosteocytes (Holtrop, [1990]) для костных клеток, полярностью окруженных остеоидом. Недавно Nefussi et al. ([1991]) выявили различия между osteoblastic osteocytes и osteoid osteocytes. Остеобластные остеоциты являются более молодыми и д. стать остеоидными остеоцитами. Эти авт. различают также промежуточный пул клеток между преостеобластами и остеобластами, которые они назвали preosteoblastic osteoblasts. Итак, при переходе от преостеобластов к остеоцитам, они идентифицируют 6 клеточных типов (Fig. 1). Preosteoblastic osteoblast не обязательно трансформируются во вмурованные остеоциты, а в основном замещают потерянные остеобласты из остеобластного слоя.
Palumbo et al. ([1990]) различают три типа клеток от остеобластов до зрелых остеоцитов. Тип I преостеоциты известны также как osteoblastic osteocyte. Типа II преостеоциты являются osteoid-osteocytes, тогда как типа III преостеоциты являются клетками, которые частично окружены минерализованным матриксом. Несмотря на тот факт, что многие исследователи обозначают любую костную клетку, окруженную остеоидом или матриксом, как остеоциты. важно помнить, что инициальное закрытие остеобласта остеоидом не является концом процесса osteoblast-to-osteocyte трансформации. Эта стадия, также как и др. стадии, является частично продолжением дифференцировки, но почему то разные авт. идентифицируют разные признаки на каждой стадии. Мы суммировали стадии от преостеобласта до остеоцита на Рис. 1.
Важно нее только присутствие или отсутствие костных маркеров, которые изменяются во время процесса трансформации, но также и их уровни экспрессии. Естественно, количественные характеристики, такие как уровни экспрессии мРНК и белка, более трудно описать, чем качественные характеристики. Молекулярный маркер, который, как полагают, характеризует промежуточные типы клеток во время трансформации osteoblast-to-osteocyte, является эпитопом, который связывает антитела, наз. E11 (Table 1). Wetterwald et al. ([1996]) первоначально идентифицировали антитела E11, которые распознают остеобласты, преостеоциты и остеоциты. Liu et al. ([1997]) затем использовали этот маркер, чтобы отличать зрелые остеобласты на остеоиде (т.e., osteoblastic osteocytes) от тех, что замурованы в минерализованный остеоид (preosteocytes). Паттерн экспрессии этого маркера был ,однако, оспорен Schulze et al. ([1999]). они выявили экспрессию E11 в остеоцитах и их отростках, но не в остеобластах. Недавно Hadjiargyrou et al. ([2001]) подтвердили экспрессию E11 в остеобластах и остеоцитах во время заживления переломов бедренной кости у крыс. Изменчивый паттерн экспрессии этого маркера может быть результатом работы с разными популяциями остеобластов и остеоцитов, т.к. такая ситуация встречается и для многих др. маркеров, ассоциированных с остеобластами (Aubin, [1998]).
В дополнение к огромному репертуару генов, экспрессируемых на каждой из описанных выше стадий, имеются также различия между костями разных возрастов. Дифференциальная экспрессия белков не-коллагенового матрикса наблюдалась в бедре и своде черепа крыс Ikeda et al. ([1992]). Напр., osteocalcin слабо экспрессируется в костях новорожденных крыс (2 дня) по сравнению с более старыми костями (8 недель).
Итак, хотя ряд молекулярных маркёров для преостеобластов, остеобластов и остеоцитов известен, но уровень их экспрессии варьирует на разных стадиях во время остеогенеза и из-за этого существует огромная гетерогенность в профилях экспрессии некоторых клональных маркеров (Aubin, [1998]) (Table 1). Следовательно, идентификация промежуточных типов клеток всё ещё зависит в основном от морфологических характеристик (Fig. 1, Table 1). Комбинированные усилия с использованием ряда (или всех) этих маркеров и специфическое их рассмотрение во время трансформации osteoblast-osteocyte могут оказаться чрезвычайно успешными для нашего понимания этого динамического процесса. Согласно нашему анализу наиболее успешными могут быть alkaline phosphatase, insulin-like growth factors и их рецепторы, TIMP, hxBP-1, osf2, nitric oxide и DMP1 (Table 1). Наконец, Bonewald и др. получили некоторые остеоцит-подобные клеточные линии мышей из длинных (наз. MLO клеточными линиями) (Aarden et al., [1996]; Caplan et al., [1983]; Kato et al., [2001]). Преимущества методов культур клеток заключаются в том, что может манипулировать факторами клеточного культивирования, чтобы повлиять на пролиферацию, дифференцировку, синтез и функцию матрикса (Tenenbaum and Heersche, [1982]; Aubin et al. [1992]; Stein and Lian, [1993]). Одной из трудностей с культивированием костных клеток, однако, является то, что остеоциты не делятся in situ и нуждаются в присутствии внеклеточного минерализованного матрикса для поддержания их дифференцированного состояния и нормальной функции (Kalajzic et al., [2004]). Кроме того, наблюдаются различия в созревании костных клеток in vivo по сравнению с in vitro (Litvin et al., [2004]). По этой причине мы не включили данные по экспрессии из работ с культивируемыми клетками в Table 1. Отсутствие молекулярных данных для переходных клеточных стадий подчеркивается в Table 1, хотя некоторые данные может быть могут быть выведены из паттернов экспрессии до и после промежуточных стадий (серые тени Table 1).
THE TRANSFORMATION PROCESS
Трансформация из остеобластов в остеоциты происходит во время нескольких описанных процессов оссификации. Мы сконцентрируемся на внутримембранозной оссификации, которая хотя и является непрерывным процессом, но может быть подразделена на две фазы: (1) конденсация клеток и инициальный синтез коллагеновых фибрилл и (2) поляризованная секреция костного матрикса (Fig. 2).
Рис.2. | A diagram of the possible ways in which the first collagen fibres are laid down by cells within a condensation during the first phase of intramembranous ossification prior to lining up on a bone surface. Secreted collagen fibrils are shown in grey shading and the arrows indicate the direction of secretion. A: The cells secrete collagen in all directions and are not polarized. B: The individual cells are polarized but secrete collagen in an apparently random fashion. C: The individual cells are polarized and secrete collagen in an organized fashion towards the centre of the condensation. D: The situation is similar to C except that the cells are lined up when they secrete collagen fibres. See text for literature cited to support these possibilities.
Сначала происходит конденсация мезенхимных клеток (предетерминированных к судьбе остеобластов), внутри которых остеобласты дифференцируются и начинают откладывать фибриллы коллагена типа I с некоторыми фибриллами типа II and III. Коллаген типа III может формировать инициальный каркас, на котором происходит отложение кости (Carter et al., [1991]). Во время заживления переломов коллаген типа III формирует каркас для миграции костных предшественников и врастания капилляров, он позднее замещается коллагеном типа I (Bierbaum et al., [2003]). Точка зрения, отраженная в большинстве учебников (e.g., Windle, [1976], figs. 6-16), присутствует в сознании большинства исследователей и базируется на изучении млекопитающих, заключается в том, что остеобласты внутри конденсатов откладывают этот коллаген поляризованным образом (т.e., секреция матрикса происходит только с одной клеточной поверхности) (Fig. 2B-D). Что остается неясным, так это могут ли эти поляризованные остеобласты быть организованы (Romer, [1970]; Windle, [1976]) или нет (Bloom and Fawcett, [1969], fig. 10.20, подтверждено также Ferretti et al., [2002]) (сравни Fig. 2B,C). Остается также неизвестным, могут ли самые первые клетки, откладывающие коллагеновые фибриллы в центре остеогенных конденсатов (прежде чем они станут покрывать костную поверхность) также быть поляризованы; могут ли они секретировать фибриллы со всей клеточной поверхности (Fig. 2A). Несмотря на это, во время этой (первой) фазы внутримембранозной оссификации остеобласты, по-видимому, подвергаются само-захоронению (Parfitt, [1990]).
Недавно был найден костный кислый glycoprotein-75, экспрессирующийся во время очень ранней стадии внутримембранозного остеогенеза, он может играть роль в предопределении конденсированных мезенхимных регионов (Gorski et al., [2004]) вместе с tenascin C и др. молекулами внеклеточного матрикса (Hall and Miyake, [2000]).
Как только этот инициальный матрикс (остеоид) оказывается отложенным остеобласты выстраиваются в ряд вдоль края костных шипов (spicule), чтобы отложить больше костного матрикса, тем самым увеличивая размер кости. Как только остеоид достигает определенной толщины, то отлавливаются дополнительные остеобласты. Эта вторая фаза внутримембранозной оссификации обсуждается схематически ниже.
Possible Schemes of the Transformation Process
Мы рассмотрим 4 схемы того, как остеобласты могут залавливаться внутрь костного матрикса (Fig. 3A-D). Пятая схема (Fig. 3E) представляет собой скорее путь, с помощью которого остеобласты не могут быть замурованы в костный матрикс в лишенной остеоцитов (бесклеточной) кости у высших teleosts (Ekanayake and Hall, [1987], [1988]; Witten et al., [2004]).
1. Остеобласты не поляризованы и откладывают кость во всех направлениях, т.е. клетки замуровываются своим собственным секретом (Fig. 3A).
2. Индивидуальные остеобласты поляризованы (т.e., откладывают кость только в определенном направлении), но они внутри одной и той же генерации (слоя) поляризованы по-другому по отношению к соседним слоям. Следовательно, кость откладывается во всех направлениях и остеобласты оказываются замурованы (Fig. 3B).
3. Остеобласты каждой генерации поляризованы в одном и том же направлении: одна генерация хоронит предшествующую в костном матриксе (Fig. 3C). Мы не уверены в существовании каких-либо доказательств в пользу этого механизма.
4. Внутри одной генерации, некоторые остеобласты замедляют свою скорость отложения кости или прекращают отложение кости, так что они оказываются погребенными секретом своих соседних клеток (Fig. 3D). Эта схема предложена Palumbo et al. ([1990]) and Nefussi et al. ([1991]).
5. Остеобласты высоко поляризованы и функционируют синхронно как единицы отложения кости. Все клетки перемещаются прочь от остеогенного фронта, когда костный матрикс отложен, что обязательно приводит к образованию кости без клеток (Fig. 3E) (Ekanayake and Hall, [1987], [1988]; Witten, [1997]).
Рис.3. | A schematic of the four different schemes (A-D) by which osteoblasts could become entrapped in bone matrix as osteocytes and one scheme (E) that leads to bone without osteocytes (acellular bone). The column on the left is the situation before osteoblasts become embedded in osteoid and the column on the right depicts their positions in the osteoid during the next deposition phase. Arrows indicate the direction of matrix deposition by osteoblasts towards the osteogenic front. Solid line indicates the bone surface. Black shaded cells indicate those osteoblasts that will become trapped in the next phase of matrix deposition as osteocytes (grey shading). The cell in D (column 1) stops or slows down matrix secretion and becomes buried by its neighbours (passive). The dotted line in E indicates the previous bone surface, which was displaced by the deposition of acellular bone. In all five schemes osteoblasts line up along the bone surface. A: Osteoblasts secrete matrix in all directions. B: Each osteoblast is polarized in a different direction but still secretes matrix in one direction only. C: One generation of osteoblasts buries the next generation. D: The osteoblast to be embedded slows down its matrix production compared to neighbouring osteoblasts. E: Matrix secretion does not embed cells. See text for detailed discussion.
The Decision to Transform Into an Osteocyte: Morphological Perspective
Candaliere et al. ([2001]) высказали точку зрения, что различия в онтогенетическом возрасте остеобластов могут объяснить паттерн экспрессии генной гетерогенности между остеобластами, так что, по крайней мере в своде черепа, остеобласты экспрессируют разные наборы генов по мере их прогресса вдоль костной поверхности прочь от костных швов. Эта гипотеза предполагает, что остеобласты разных онтогенетических стадий присутствуют вдоль костных поверхностей; мы знаем. что только некоторые остеобласты совершают переход к остеоцитам. Решение следовать судьбе остеоцитов д. очень сильно зависеть от или контролироваться профилями генной экспрессии поверхностных остеобластов (которые в контакте с подлежащими остеоцитами). Инструменты для отслеживания индивидуальных остеобластов, когда они трансформируются в остеоциты имеются, но они д.б. приложены к переходным клеточным стадиям, т.к мы только начинаем понимать генную гетерогенность остеобластов.
Было также предположено, что сигналы остеокластов могут модулировать остеобласты, принимая во внимание взаимное общение между этими типами клеток (Candaliere et al., [2001]). Т.о., комбинация коммуникаций между вмурованными остеобластами, остеоцитами и остеокластами вместе с уникальными генными профилями и могут предрешать судьбу остеобластов. Рассматривая процесс трансформации в целом, дифференцирующиеся клетки остаются в контакте с клетками как слоя остеобластов, так и с замурованными остеоцитами, даже когда морфологические характеристики меняются (Palumbo et al., [1990]).
Согласно Palumbo et al. ([1990]) решение трансформироваться в остеобласты является следующим. Во время формирования кости отростки на сосудистой поверхности остеоцитов продолжают расти, что позволяет остеоцитам оставаться в контакте со слоем активных остеобластов и модулировать их активность. Когда эти отростки стороны, обращенной к сосудам, прекращают рост, то они продуцируют сигнал, который индуцирует рекрутирование тех остеобластов с которыми они теряют контакт. Предетерминированные остеобласты затем трансформируются в osteoblastic osteocytes. Сигнал для прекращения роста сосудистых отростков может испускаться остеобластами с которыми они в контакте или он может быть обусловлен постепенным уменьшением сосудистого снабжения остеоцитов, когда откладываются новые слои кости на остеогенном фоне. Во всяком случае, промежуток жизни активных остеобластов (до их замуровывания) не зависит от количества костного матрикса им продуцируемого (как показано на мышином periodontium McCulloch and Heersche, [1988]).
The Decision to Transform Into an Osteocyte: Molecular Perspective
Описаны некоторые факторы, модулирующие функцию остеобластов и/или участвующие в контроле решения трансформироваться в остеоциты.
Транскрипционные факторы, Runx2 и Osterix, являются критическими для дифференцировки остеобластов при внутримембранозной и эндохондральной оссификации (Nakashima and de Crombrugghe, [2003]; Inohaya and Kudo, [2000]; Kobayashi and Kronenberg, [2005]). Runx2/Cbfa1 непосредственно активируют ряд osteoblast/osteocyte маркеров, таких как типа I collagen, osteopontin, bone sialoprotein и osteocalcin (Aubin, [1998]; Inohaya and Kudo, [2000]; см. также Eames et al., [2003]). Гомозиготная мутация этого гена у мышей вызывает полное отсутствие образования кости в результате ареста дифференцировки остеобластов (Komori and Kishimoto, [1998]; Otto et al., [1997]). Этот транскрипционный фактор, однако, не экспрессируется преостеобластами и клетками остео-хондропредшественников (Nakashima and de Crombrugghe, [2003]), которые являются общими клетками предшественниками, которые обладают потенциалом дифференцироваться в клоны osteoblast/osteocyte или chondroblast/chondrocyte (см. Hall, [2005]). Osx, по-видимому, стоит ниже Runx2, т.к.не обнаруживается транскриптов Osx у нулевых Runx2 мышей (Nakashima and de Crombrugghe, [2003]). Некоторые др. транскрипционные факторы также участвуют в пролиферации и дифференцировке остеобластов - Msx1, Msx2, Dlx5, Dlx6, Twist, Runx2, Osx, Sp3 - но они не касаются нашегол обсуждения трансформации остеобластов в остеоциты.
Некоторая важная информация может быть получена из клинических исследований остеопорозов и краниосиностозов. Leptin является продуктом гена, синтезируемым адипоцитами, но который может служить важным сигналом для модуляции функции остеобластов (Gordeladze et al., [2002]) и может объяснить, как ожирение оказывает защитный эффект на остеопороз. Мыши, гомозиготные по гену obese имеют аномальный метаболизм глюкозы и жира, уменьшенный рост и не продуцируют leptin. Недавно было показано, что leptin защищает клетки (включая остеобласты) от апоптоза и облегчает трансформацию остеобластов в преостеоциты. Широко распространено мнение среди исследователей, которые изучали остеопороз, что снижение формирования кости является результатом уменьшения продолжительности жизни популяции остеобластов. Это уменьшение продолжительности жизни м.б. результатом раннего включения в костный матрикс (следовательно, увеличения скорости трансформации в остеоциты [Lips et al., [1978]; Darby and Meunier, [1981]; Dempster et al., [1983]]).
Недавнее исследование Borton et al. ([2001]) подтверждает, что ослабление TGFβ-связанных сигнальных механизмов может увеличивать склонность остеобластов созревать в остеоциты и уменьшает продолжительность их продуктивного функционирования путем укорочение их продолжительности жизни, приводя в конечном итоге к остеопении. TGFβ продуцируется также остеобластами и инкорпорируется в костный матрикс (Seyedin et al., [1986]; Robey et al., [1987]). Модель, которая позволила продвинуться вперед, предполагает, что скорость продукции матрикса остеобластами и инкорпорация остеобластов в матрикс регулируется частично с помощью TGFβ-родственных сигнальных механизмов (Jordan et al., [2003]).
Исследователи. изучающие краниосиностозы (преждевременное слияние швов свода черепа) идентифицировали гены, участвующие в блокировании дифференцировки остеобластов, а именно, FGFs и Wnt генов и Sox2 (Masukhani et al., [2005]). Считается, что FGFs могут действовать посредством генов Wnt, чтобы ингибировать дифференцировку остеобластов и что Sox2 индуцируется FGF.
Генетические модели кость-специфических маркеров (такие как нокауты, мутации с избыточной и потерей функции, трансгенные мыши и т.д.) может вносить важный вклад в наше понимание процессов трансформации. Недавние исследования идентифицировали некоторые факторы (напр., LRP5, sclerostin, Fgfr2c, matrix metalloproteases и glucocorticoids), которые влияют на апоптоз и/или активность остеобластов (Babij et al [2003]; Winkler et al., [2003]; Eswarakumar et al., [2004]; Karsdal et al., [2004]; O'Brien et al., [2004]) и тем самым косвенно на процесс принятия решения стать остеоцитами (или нет). Kalajzic et al. ([2004]) генерировали трансгенных мышей с цис-регуляторной системой dentin matrix protein 1, которая управляет green fluorescent protein, в качестве маркера для живых остеоцитов. Это исследование (и др.) представляют нам потенциальные будущие модели для более детального исследования процесса трансформации. Однако, пока ни одно из этих исследований не пролило свет на специфический механизм трансформации остеобластов в остеоциты.
How Long Does It Take?
Трансформация остеобластов в остеоциты продолжается примерно 3 дня в метафизах бедренной кости 2-недельных кроликов (Owen, [1963]). Young ([1962]) подсчитал 2 дня в тибии и ребрах новорожденных крыс 2, тогда как Kember ([1960]) подсчитал 5 дней у тех же животных. У новорожденных мышей, меченных tritiated thymidine, меченные остеоциты видны только на 10 день на periodontal поверхности корней молярных зубов, но в periodontal альвеолярной кости трансформация osteoblast-osteocyte происходит значительно дольше, около 19 дней. Из этих исследований ясно, что время трансформации не одинаково для всех костей/сайтов одного и того же животного (McCulloch and Heersche, [1988]). На обеих поверхностях скорости отложение кости очень сходны. Следовательно, скорость трансформации не зависит от скорости отложения кости. Ten Cate and Mills ([1972]) показали, что источник клеток предшественников для periodontal поверхности альвеолярной кости и остеобласты, выстилающие endosteal и periosteal поверхности alveolar отростков не являются одинаковыми. Следовательно, происхождение остеобластов может влиять на время трансформации остеобластов в остеоциты. Недавно разные скорости формирования кости были описаны для подвздошной кости человека у pre-menopausal женщин (Parfitt, [1990]) и во время развития свода черепа у крыс (Candaliere et al., [2001]).
Ясно, что даже внутри одного костного элемента наблюдаются разные скорости образования кости. Показано, что скорость отложения кости существенно зависит от средовых/экспериментальных условий, скелетного элемента и возраста (Stark and Chinsamy, [2002]). Итак, много недавних исследований скорости отложения кости, но немногие из них сфокусированы на трансформации osteoblast-osteocyte, это указывает на то, что этот процесс является сайт-специфическим, зависящим от происхождения остеобластов, кости и возможно возраста и пола животного, но не зависит от скорости отложения кости.
How Does It Happen?
Считается, что остеобласты контролируют инициацию минерализации костного матрикса путем оставления матричных пузырьков в остеоиде. Как отмечалось выше, E11 является единственным маркером, экспрессирующимся во время перехода от остеобластов к остеоцитам. Недавно было подтверждено, что E11 необходимы для формирования полностью минерализованных пузырьков на развивающихся клеточных отростках osteoid-osteocytes (Barragan et al., [2004]). Удлинение и сужение клеточных отростков приводит в результате к минерализации пузырьков, оказывающихся ассоциированными с коллаген-обусловленной минерализацией.
Было предположено, что osteoid-osteocytes могут участвовать в секреции и минерализации матрикса и могут участвовать в ориентации ктолагеновых волокон (как это делают остеобласты) (Palumbo, [1986]). Palumbo ([1986]) подтвердил также, что эти функции osteoid-osteocyte осуществляются со стороны, обращенной к минералу; а сосудистая сторона не имеет каких-либо клеточных отростков на этой стадии трансформации остеобластов в остеоциты (Fig. 1). Это наблюдение указывает на то, что минерализация любого остеоидного матрикса происходит между слоем остеобластов и osteoid-osteocyte и зависит только от активности остеобластов (или osteoblastic-osteocytes), а не от osteoid-osteocytes (Palumbo, [1986]).
Вообще-то одно из наиболее детальных исследований того, как остеобласты становятся остеоцитами, проведено на примере образования внутримембранозной кости свода черепа крыс с помощью ЭМ. На базе своих наблюдений Nefussi et al. ([1991]) предложили следующий механизм замуровывания остеобластов: following mechanism for osteoblast entrapment: один из выравненных поляризованных остеобластов уменьшает свою активность и выпадает из ряда (alignment) соседних активных остеобластов (называемых теперь osteoblastic osteocytes) (Fig. 1). Эти клетки постепенно оказываются внедренными в матрикс, формируемый выравненными (aligned) остеобластами, но сохраняют латеральные клеточные контакты с этими клетками. Конкурентно, преостеобласты выше клеток, которые д. трансформироваться в остеоциты (наз. preosteoblastic osteoblast), перемещаются, чтобы оккупировать пространство в слое активных остеобластов, так что выравненный слой активных остеобластов не нарушается (Fig. 1). Др. словами, согласно Nefussi et al. ([1991]), внедрение остеобластов является пассивным процессом.
Остеобластические остеоциты продолжают свою процедуру пассивного внедрения так что в конце этой стадии эти клетки полностью оказываются вне слоя остеобластов. Такие клетки теперь морфологически отличны - уменьшены размеры клеток, уменьшены органеллы - и называются osteoid-osteocyte (Fig. 1). Эти авт. ничего не говорят, может ли остеоид между клетками этого типа и слоем остеобластов быть целиком синтезированным слоем активных остеобластов или клетками в слое остеоида. Palumbo et al. ([1990]) полагают, что osteoblastic osteocyte (type I preosteocyte) и osteoid osteocyte (type II preosteocyte) всё еще поляризованы в отношении mineral поверхности и продуцируют матрикс. Продукция матрикса преостеоцитами типа III минимальна, т.к. минерализующие матричные пузырьки никогда не обнаруживаются на vascular поверхности.
Palumbo et al. ([1990]), исследовали parallel-fibred кость тибии новорожденных кроликов, они также пришли к выводу, что вмуровывание является пассивным процессом. Клеточные изменения, ранее описанные во время трансформации osteoblast-to-osteocyte, такие как уменьшение размера клеток и количества органелл (Palumbo, [1986]; Aarden et al., [1994]), являются показательными для клеток, чья активность снижается и это подтверждает гипотезу.
Вмуровывание остеобластов обсуждалось Ferretti et al. ([2002]) в контексте TEM исследований остеобластов в своде черепа и длинных костях новорожденных кроликов и эмбрионов кур. Они рассматривали внутримембраножное образование кости как статический остеогенез, т.к. он осуществляется с помощью стационарных остеобластов, которые трансформируются в остеоциты в месте, где они дифференцируются. Они описали клетки нерегулярно расположенные в тяжах из двух или трех клеточных слоев в местах образования новых костных трабекул. Каждая из таких клеток поляризована в разных направлениях по отношению к соседним (определяется по положению клеточных органелл по отношению к ядру и по присутствию вновь секретированных фибрилл коллагена типа 1). Подвижные остеобласты поляризованы в том же самом направлении, затем дифференцируются вдоль трабекул, ранее отложенных стационарными остеобластами. Итак, согласно этому исследованию, внутримембранозная оссификация двухфазная, состоит из стационарной и динамической фаз. Неожиданно, они не описывают стадию конденсации до формирования кости, так что трудно интерпретировать их описание. Ferretti et al. ([2002]) не нашли существенных структурных или ультраструктурных различий в остеобластах стационарной по сравнению с динамической фазой. Кроме того, они пришли к выводу, что существуют два разных механизма трансформации osteoblast-to-osteocyte: стационарные остеобласты трансформируются в остеоциты путем само-захоронения, тогда как динамические остеобласты отбираются, чтобы трансформироваться в остеоциты с помощью секреторной активности соседних остеобластов.
CHOOSING A MODEL
Во время первой фазы внутримембранозного образования кости (когда preosteoblasts находятся внутри конденсатов) (Dunlop and Hall, [1995]; Hall, [2005]), остеобласты могут откладывать коллаген во всех направлениях (Fig. 2A) (Ham and Cormack, [1979]), они могут быть поляризованы, но ориентированы по-разному и поэтому откладывают коллаген в разных направлениях (Fig. 2B) (Bloom and Fawcett, [1969], это подтверждено и Ferretti et al., [2002]), они могут быть поляризованы и направлены по направлению к центру конденсации (Fig. 2C), или могут быть поляризованы и выравнены и тогда откладывают коллаген только в одном направлении (Fig. 2D) (Romer, [1970]; Windle, [1976]). Остается еще вопрос, на который пока нет ответа, могут ли клетки быть предетерминированые, чтобы стать остеобластами, также д.б. поляризованы и выравнены. Молекулярные маркеры для ранних конденсатов, такие как Osterix, osteopontin, osteonectin и alkaline phosphatase (Liu et al., [1997]; Aubin, [1998]), хотя также экспрессируются и во время поздних стадий, могут определенно помочь идентифицировать клетки внутри конденсатов, которые развиваются в остеобласты. Dunlop and Hall ([1995]) показали, что alkaline phosphatase активирована еще до конденсации в предшественниках остеобластов во время остеогенеза в первой мандибулярной дуге цыплят. В настоящее время alkaline phosphatase остается самым ранним маркером для остеогенных конденсатов. С ее помощью структрные и ультраструктурные исследования д. показать, являются ли предшественники остеобластов и ранние остеобласты поляризованными и в каком направлении они секретируют свой первый матрикс (Fig. 2).
Вторая фаза внутримембранозной оссификации изучена лучше и кажется более скоординированной во времени и пространстве. Остеобласты определенно поляризованы на этой стадии; остеобласты с поляризованной активностью подвергаются трансформации в остеоциты, это определяется положением трех органелл: ядра, эндоплазматического ретикулема и аппарата Гольджи (Dudley and Spiro, [1961]; Pritchard, [1972]; Palumbo, [1986]). Но остается вопрос, остеобласты просто захораниваются с помощью следующего поколения остеобластов (Fig. 3C) или они вносят вклад в свое собственное захоронение путем остановки и/или замедления откладки матрикса, прежде чем быть вмурованы в костный матрикс (Fig. 3D). Nefussi et al. ([1991]) полагают, что в самом деле имеет место комбинация обоих процессов.
Как только определенное количество остеоида будет отложено, пока мы не знаем критического его количества, но минимум остеоида вообще-то необходим для гарантии пространственного расположения остеоцитов (osteocyte generations) в костном матриксе, остеобласты оказываются заловленными, возможно с помощью механизма впервые предложенного Nefussi et al. ([1991]) и представленного на схеме D (Fig. 3D). Очевидно, что остеобласты могут замедлять продукцию своего матрикса, напр., когда они трансформируются в кость-выстилающие клетки или перед началом апоптоза. Т.о., разумно предположить, что остеобласты, предназначенные стать остеоцитами уменьшают продукцию матрикса по сравнению с соседними остеобластами и таким образом оказываются пассивно погребены в костный матрикс. Даже если поляризованный остеобласт в процессе захоронения не останавливает полностью продукции матрикса и продолжает синтезировать матрикс с медленной скоростью, то захоронение все равно будет пассивным в том смысле. что соседние клетки будут ответственны за вмуровывание. Как известно у костистых рыб (Acanthomorpha), поляризованная и синхронизированная продукция матрикса выравненными клетками не приводит к внедрению клеток в матрикс. Если мы примем схему 4 (Fig. 3D), то онтогенетическая гетерогенность остеобластов д. отвечать за внедрение некоторых остеобластов в костный матрикс.
PERSPECTIVE
Future research that focuses on the mechanisms that underlie osteoblast heterogeneity might not only provide a better understanding of how osteoblasts become embedded in bone matrix but also contribute to our understanding of synchronized processes, such as dentine and acellular bone formation, when cells do not become embedded in the matrix. There is so far no evidence to suggest that some osteoblasts are predetermined to become embedded (and hence slow down matrix production) within the newly secreted osteoid, although Lanyon ([1993]) suggested that the osteoblasts that secrete less matrix and, ultimately, become osteocytes may be those with prior connections to underlying osteocytes. The key to understanding the transformation of osteoblasts to osteocytes and how the latter are buried alive may reside in viewing all bone cells (preosteoblasts, osteoblasts, bone-lining cells, osteocytes) as a continuum, as a tissue, with cells in different developmental stages. To characterize these different developmental stages and to understand their function in time and space, it will certainly be helpful to close the gaps, regarding the expression of molecular markers during the transformation process.
Currently, bone is often still viewed as a hard substance (although we call it hard tissue), with the focus on how the mineralized material is deposited by osteoblasts. However, bone is a dynamic tissue composed of living cells, 95% of which are osteocytes. In this review, we raised the question how the tissue called bone develops in order to increase attention to osteocytes.
